性別與生境因素對黑線姬鼠腸道菌群多樣性的影響

摘" " 要：為探究黑線姬鼠（Apodemus agrarius）腸道菌群的組成以及多樣性，討論性別差異和生境差異對黑線姬鼠腸道菌群的影響，采用高通量測序技術對黑線姬鼠腸道菌群的16S rRNA" V3-V4區進行PCR擴增并進行分析。結果顯示：農田黑線姬鼠雌雄2組樣品間在門、目、屬水平上排名前3的優勢菌群種類大致相同，但各菌群所占比例不同；灌叢黑線姬鼠雌雄2組樣品間在門、目、屬水平上的前3種優勢菌群不同。Alpha多樣性分析表明：農田組黑線姬鼠雌雄間腸道菌群差異不顯著；灌叢組黑線姬鼠雌雄間腸道菌群多樣性差異顯著，豐富度差異不顯著；不同生境黑線姬鼠腸道菌群無顯著差異。ANOSIM分析表明：農田黑線姬鼠雌雄2組樣品間腸道菌群差異不顯著；灌叢黑線姬鼠雌雄2組樣品間腸道菌群差異極顯著；2種生境黑線姬鼠組間腸道菌群差異不顯著。綜上所述，性別和生境對黑線姬鼠的腸道菌群的組成及多樣性有影響。

關鍵詞：黑線姬鼠；腸道菌群；高通量測序；16S rRNA

中圖分類號：S764.5" " " " "文獻標識碼：A" " " " " DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2024.06.007

Effects of Sex and Habitat Factors on Intestinal Flora Diversity of Apodemus agrarius

JIN Zhimin， HUANG Xiaoran， LI Qiang， YANG Wenjian， JIA Xiuqi

（College of Life Science and Technology， Mudanjiang Normal University， Mudanjiang， Heilongjiang 157011， China）

Abstract：" In order to investigate the composition and diversity of the intestinal flora of Apodemus agrarius， the effects of sex differences and habitat differences on the intestinal flora of Apodemus agrarius were discussed. The 16S rRNA V3-V4 region of the intestinal flora of Apodemus agrarius was amplified by PCR using high-throughput sequencing technology and analyzed. The results showed that the first three dominant intestinal flora were roughly the same at phylum， order and genus level between male and female groups of Apodemus agrarius in farmland， but the proportion of each bacterial group was different. The first three dominant intestinal flora were different at phylum， order and genus level between male and female groups of Apodemus agrarius in scrub. Alpha diversity analysis showed that there was no significant difference in intestinal flora between male and female of Apodemus agrarius in farmland. There was significant difference in intestinal flora diversity between male and female of Apodemus agrarius in scrub， but no significant difference in intestinal flora richness. There was no significant difference in intestinal flora of Apodemus agrarius in different habitats. ANOSIM analysis showed that there was no significant difference in intestinal flora between male and female groups of Apodemus agrarius in farmland. The intestinal flora was significantly different between male and female of Apodemus agrarius in scrub. There was no significant difference in intestinal flora between two groups of Apodemus agrarius. In conclusion， sex and habitat have influence on the composition and diversity of intestinal flora of Apodemus agrarius.

Key words： Apodemus agrarius; intestinal flora; high-throughput sequencing; 16S rRNA

動物的腸道中含有許多微生物群，它們之間相互作用，在維持宿主腸道穩態、生長發育、機體健康、免疫等方面發揮著重要作用[1-3]。腸道菌群的結構及多樣性受多種因素影響。例如，同種通俗腔蚓在不同農田生境中腸道菌群存在差異，這主要是受不同蔬菜之間的根系分泌物的影響[4]；于威等[5]研究發現，性別會影響阿拉善馬鹿冬季腸道菌群的多樣性及構成；甘肅鼢鼠腸道菌群的組成和結構在野生和人工飼喂條件下存在顯著差異[6]；不同生境對藏酋猴腸道菌群組成、豐度、多樣性存在影響，這可能與不同生境的食物組成有關[7]。

黑線姬鼠是哺乳綱，嚙齒目，鼠科，姬鼠屬的一種小型鼠類，其背部中央有1條黑色的條紋，又稱田姬鼠[8]。黑線姬鼠食性較雜，棲息環境廣泛，是農林地區的主要害鼠[9]。本研究利用高通量測序技術，對黑線姬鼠的腸道菌群進行檢測分析，探究黑線姬鼠腸道菌群的多樣性及組成的性別差異和環境差異，研究黑線姬鼠對不同環境的適應提供數據，為進一步探究其他因素對黑線姬鼠腸道菌群的組成及多樣性的影響提供了基礎的微生物數據，對農林鼠害的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和保存

試驗地為黑龍江省牡丹江市三道關林場，位于牡丹江市西北部（129°17′E～129°35′E，44°41′N～44°51′N）。在秋季的農田和灌叢中，使用籠捕法采集黑線姬鼠，在每個生境中選擇健康活躍的成年黑線姬鼠各10只，雌雄各半，并進行編號，如表1所示。在實驗室無菌條件下，將黑線姬鼠脫頸處死，取出黑線姬鼠的盲腸，立即放入裝有液氮的研缽中，裝入無菌凍存管中，做好標記，放入-80 ℃冰箱中。

1.2 樣本腸道微生物DNA的提取

采用CTAB/SDS方法，對黑線姬鼠的腸道組織進行總DNA的提取。經過1.8%瓊脂糖凝膠電泳20 min，檢測到明亮條帶為提取成功。

1.3 樣本建庫測序及數據處理

采用通用引物（上游引物515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，下游引物806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對16S rRNA基因V3-V4區進行PCR擴增；對其產物進行純化，純化產物送至北京百邁客生物科技有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000對質檢合格的文庫進行測序；使用 Trimmomatic v0.33軟件，對測序得到的 Raw Reads進行過濾；使用cutadapt 1.9.1軟件進行引物序列的識別與去除，得到不包含引物序列的Clean Reads；使用 QIIME2 2020.6中的DADA2方法進行去噪，雙端序列拼接并去除嵌合體序列，得到最終有效數據。

2 結果與分析

2.1 樣品中有效序列和OTU數目

利用高通量測序技術對20份黑線姬鼠的盲腸樣本進行16S rRNA測序，共獲得有效序列1 567 880條，平均每個樣本中含有78 394條有效序列。基于相似性gt;97%的原則，將獲得的有效tags序列進行聚類分析，共獲得3 116個OTUs。韋恩圖中重疊的部分代表所有樣本共有的OTU數目。由圖1-A可知，農田黑線姬鼠雌性、雄性樣本共有587個OTUs，農田雌性黑線姬鼠獨有的OTU數目為795，農田雄性黑線姬鼠獨有的OTU數目為668。由圖1-B可知，灌叢黑線姬鼠雌性、雄性樣本共有519個OTUs，灌叢雌性黑線姬鼠獨有的OTU數目為746，灌叢雄性黑線姬鼠獨有的OTU數目為625。

2.2 Alpha多樣性分析

稀釋性曲線通過驗證測序數據量是否充足，反映出樣品中的物種多樣性和物種豐富度。如圖2所示，隨著測序深度的不斷加深，稀釋曲線不斷上升，直至趨于平緩，說明樣品序列充分，其測序深度具有合理性，可以進行數據分析。

對農田組的黑線姬鼠和灌叢組的黑線姬鼠樣本進行Alpha多樣性分析，使用SPSS 19.0軟件對兩組黑線姬鼠的Alpha多樣性指數進行差異性分析。如表2所示，農田黑線姬鼠雌雄間的ACE指數、Shannon指數、Simpson指數和Chao1指數均差異不顯著（Pgt;0.05），表明農田黑線姬鼠雌性和雄性的腸道菌群的物種豐富度和菌群多樣性無顯著差異。如表3所示，灌叢黑線姬鼠雌雄間的ACE指數和Chao1指數均差異不顯著（Pgt;0.05），表明灌叢黑線姬鼠雌性和雄性的腸道菌群的物種豐富度無顯著差異。灌叢黑線姬鼠雌雄間的Shannon指數和Simpson指數均差異顯著（0.01lt;Plt;0.05），表明灌叢黑線姬鼠雌性和雄性的腸道菌群的多樣性有顯著差異。如表4所示，農田組和灌叢組的ACE指數、Shannon指數、Simpson指數和Chao1指數均差異不顯著（Pgt;0.05），表明2種生境中的黑線姬鼠腸道菌群的物種豐富度和菌群多樣性無顯著差異。

2.3 物種組成分析

2.3.1 農田黑線姬鼠雌雄腸道菌群在不同水平的物種組成 對農田黑線姬鼠雌性和雄性的腸道菌群進行門、目和屬水平的物種組成分析。如圖3-A所示，在門水平上，雌雄2組樣品中相對豐度含量排名前3的菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）。其中，厚壁菌門（♀64.934%、♂73.374%）和擬桿菌門（♀24.183%、♂16.075%）的相對豐度含量較高，二者相對豐度含量之和超過85%，是農田黑線姬鼠的優勢菌門，變形菌門為第3豐度菌門，在雌性黑線姬鼠中的相對豐度含量高于雄性黑線姬鼠（♀4.167%、♂3.529%）。

如圖3-B所示，在目水平上，雌雄2組樣品中相對豐度含量排名前3的菌目均為毛螺菌目（Lachnospirales）、擬桿菌目（Bacteroidales）、顫螺菌目（Oscillospirales）。其中，雄性毛螺菌目的相對豐度含量高于雌性（♀40.611%、♂47.241%），雌性擬桿菌目和顫螺菌目的相對豐度含量高于雄性（擬桿菌目♀24.096%、♂15.967%；顫螺菌目♀12.310%、♂11.327%）。

如圖3-C所示，在屬水平上，雌雄2組樣品中相對豐度含量排名前3的菌屬均為unclassified_Lachnospiraceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、unclassified_Muribaculaceae。其中，unclassified_Lachnospiraceae在雌性中的相對豐度含量略低于雄性（♀19.538%、♂19.544%），Lachnospiraceae_NK4A136_group在雌性中的相對豐度含量低于雄性（♀17.608%、♂18.213%）、unclassified_Muribaculaceae在雌性中的相對豐度含量高于雄性（♀15.187%、♂11.336%）。

2.3.2 灌叢黑線姬鼠雌雄腸道菌群在不同水平的物種組成 對灌叢黑線姬鼠雌性和雄性的腸道菌群進行門、目和屬水平的物種組成分析。如圖4-A所示，在門水平上，雌性樣品中相對豐度含量排名前3的菌門為厚壁菌門（Firmicutes）（63.385%）、擬桿菌門（Bacteroidota）（29.203%）、Campylobacterota（2.529%）。雄性樣品中相對豐度含量排名前3的菌門為厚壁菌門（Firmicutes）（55.167%）、變形菌門（Proteobacteria）（17.811%）、擬桿菌門（Bacteroidota）占（17.390%）。

如圖4-B所示，在目水平上，雌性樣品中相對豐度含量排名前3的菌目為毛螺菌目（Lachnospirales）（41.736%）、擬桿菌目（Bacteroidales）（29.156%）、顫螺菌目（Oscillospirales）（13.096%）。雄性樣品中，相對豐度含量排名前3的菌目為毛螺菌目（Lachnospirales）（41.707%）、Enterobacterales（17.591%）、擬桿菌目（Bacteroidales）（17.388%）。

如圖4-C所示，在屬水平上，雌性樣品中相對豐度含量排名前3的菌屬為unclassified_Lachnospiraceae占（25.186%）、unclassified_Muribaculaceae（20.744%）、Lachnospiraceae_NK4A136_group（12.194%）。雄性樣品中，相對豐度含量最高的3個菌屬為unclassified_Lachnospiraceae（22.361%）、Escherichia shigella（17.443%）、Lachnospiraceae_NK4A136_group（13.940%）。

2.3.3 不同生境黑線姬鼠腸道菌群在不同水平的物種組成 如圖5-A所示，在農田生境和灌叢生境中，黑線姬鼠的腸道菌群排名前3的優勢菌門相同，均為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形菌門（Proteobacteria）。其中，厚壁菌門（農田69.159%、灌叢59.281%）、擬桿菌門（農田20.125%、灌叢23.303%）、變形菌門（農田3.847%、灌叢9.675%）。農田黑線姬鼠中的厚壁菌門相對豐度含量比灌叢黑線姬鼠高。農田黑線姬鼠中的擬桿菌門和變形菌門相對豐度含量比灌叢黑線姬鼠低。農田生境中，除排名前3的優勢菌門外，其他菌門所占比例為6.869%。灌叢生境中，除排名前3的優勢菌門外，其他菌門所占比例為7.741%。

如圖5-B所示，2種生境中黑線姬鼠腸道菌群排名前3的優勢菌目相同，均為毛螺菌目（Lachnospirales）、擬桿菌目（Bacteroidales）、顫螺菌目（Oscillospirales）。其中，毛螺菌目（農田43.930%、灌叢41.721%）、擬桿菌目（農田20.027%、灌叢23.279%）、顫螺菌目（農田11.818%、灌叢10.662%），農田黑線姬鼠腸道菌群毛螺菌目和顫螺菌目的相對豐度均高于灌叢黑線姬鼠。農田生境中，除排名前3的優勢菌目外，其他菌目所占比例為24.225%。灌叢生境中，除排名前3的優勢菌目外，其他菌目所占比例為24.338%。

如圖5-C所示，農田黑線姬鼠腸道菌群排名前3的優勢菌屬為unclassified_Lachnospiraceae（相對豐度為19.541%）、Lachnospiraceae_NK4A136_group（相對豐度為17.911%）、unclassified_Muriba-culaceae（相對豐度為13.260%）。灌叢中黑線姬鼠腸道菌群排名前3的優勢菌屬為unclassified_Lachno-spiraceae（相對豐度為23.775%）、unclassified_Muriba-culaceae（相對豐度為17.294%）、Lachnospiraceae_NK4A136_group（相對豐度為13.066%）。

2.4 ANOSIM分析

對農田黑線姬鼠雌性和雄性的腸道菌群進行ANOSIM分析，結果如圖6-A所示。R=0.112（Rgt;0），說明農田黑線姬鼠雌雄2組樣品間腸道菌群存在差異，但是農田黑線姬鼠雌雄2組樣品間腸道菌群差異不顯著（Pgt;0.05）。

對灌叢黑線姬鼠雌性和雄性的腸道菌群進行ANOSIM分析，結果如圖6-B所示。R=0.544（Rgt;0）說明灌叢黑線姬鼠雌雄2組樣品間腸道菌群存在差異，且灌叢黑線姬鼠雌雄2組樣品間腸道菌群差異極顯著（Plt;0.01）。

對農田和灌叢黑線姬鼠的腸道菌群進行ANOSIM分析，結果如圖7所示。R=0.091（Rgt;0），說明2種生境的黑線姬鼠組間腸道菌群存在差異，但是2種生境黑線姬鼠組間腸道菌群差異不顯著（Pgt;0.05）。

3 討論與結論

腸道菌群與宿主協同進化，參與宿主體內的生命活動。對黑線姬鼠腸道菌群的研究中發現，門水平下，農田黑線姬鼠雌雄間排名前3的優勢菌門相同，灌叢雄性黑線姬鼠排名前3的優勢菌門與農田黑線姬鼠相同，而灌叢雌性黑線姬鼠排名前3的優勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、Campylobacterota。厚壁菌門作為一種優勢菌門普遍存在于脊椎動物中，能吸收食物中的營養。本試驗中，厚壁菌門在黑線姬鼠腸道菌群中所占比例很大，這與大林姬鼠、棕背鼠平、圈養梅花鹿、東北馬鹿腸道菌群的研究結果一致[10-14]。研究表明，厚壁菌門參與碳水化合物和多糖的分解[15-16]，通過此種方式產生的能量可以為宿主供能。擬桿菌門主要參與動物體內的一些代謝過程，如糖代謝、碳水化合物代謝等，增強宿主對營養物質的吸收能力和利用率[17-18]，維持動物腸道內的菌群平衡，使宿主的免疫能力增強[17-19]，同時也對腸道黏膜有修復和保護的作用[20]。變形菌門有利于消化食物中的木質素[21-23]。腸道菌群的種類與動物的食性有關，黑線姬鼠棲息在農田、草地、林區中，喜食植物性食物以及種子，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門有利于消化植物性食物中的半纖維素、纖維素和木質素。在屬水平下，農田黑線姬鼠雌雄間排名前3的優勢菌屬相同，灌叢雌性黑線姬鼠的排名前3的優勢菌屬與農田黑線姬鼠相同，但灌叢雄性黑線姬鼠排名前3的優勢菌屬與農田黑線姬鼠不同。灌叢雌雄黑線姬鼠共有的優勢菌屬為unclassified_Lachnospiraceae和Lachnospiraceae_NK4A136_group。其中，雌性黑線姬鼠特有的優勢菌屬為unclassified_Muribaculaceae，雄性黑線姬鼠特有的優勢菌屬為Escherichia shigella。unclassified_Lachnospiraceae和Lachnospiraceae_NK4A136_group在動物的腸道中廣泛存在，對腸黏膜有修復的作用[24]。unclassified_Muribaculaceae和Escherichia shigella也是對動物腸道有益的菌屬，在生理代謝中發揮重要的作用。腸道菌群的存在，能更好地幫助黑線姬鼠適應自然環境，使黑線姬鼠的抗逆性有所增強，可以抵御自然環境中的不利因素。

Alpha多樣性分析和ANOSIM分析表明，農田組黑線姬鼠雌雄間腸道菌群差異不顯著；灌叢組黑線姬鼠雌雄間腸道菌群在Alpha多樣性分析中表現出多樣性差異顯著，豐富度差異不顯著，在ANOSIM分析中表現出差異極顯著。對2種生境黑線姬鼠腸道菌群進行比較，農田組和灌叢組黑線姬鼠腸道菌群無顯著差異。灌叢組黑線姬鼠雌雄間腸道菌群出現差異的原因可能是雌雄黑線姬鼠食性不同、基因型不同、體內激素變化等，具體因素還需要進一步研究。

以上研究結果表明，性別因素和生境因素對黑線姬鼠腸道菌群的組成及多樣性有影響。本研究為進一步探究其他因素對黑線姬鼠腸道菌群的組成及多樣性的影響提供了基礎的微生物數據，對農林鼠害的防治具有一定的重要價值。

參考文獻：

[1] SHI N， LI N， DUAN X W， et al. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system[J]. Military Medical Research， 2017， 4： 14.

[2] D？魱AZ-S？魣NCHEZ S， MORIONES A M， CASAS F， et al. Prevalence of Escherichia coli， Salmonella sp. and Campylobacter sp. in the intestinal flora of farm-reared， restocked and wild red-legged partridges （Alectoris rufa）： is restocking using farm-reared birds a risk？[J]. European Journal of Wildlife Research， 2012， 58（1）： 99-105.

[3] DE KIVIT S， TOBIN M C， DEMEO M T， et al. in vitro evaluation of intestinal epithelial TLR activation in preventing food allergic responses[J]. Clinical Immunology， 2014， 154（2）： 91-99.

[4] 張玉峰， 劉宏毅， 劉敏， 等. 不同農田生境對通俗腔蚓腸道菌群結構的影響[J]. 土壤通報， 2023， 54（3）： 695-702.

[5] 于威， 李俊樂， 滕麗微， 等. 阿拉善馬鹿冬季腸道菌群組成的性別差異[J]. 野生動物學報， 2021， 42（2）： 420-427.

[6] 任世恩， 南小寧， 許淼， 等. 野生和人工飼喂條件下甘肅鼢鼠腸道細菌多樣性比較[J]. 微生物學報， 2020， 60（4）： 826-838.

[7] 翟子豪， 宋飏， 王俊茵， 等. 峨眉山與黃山藏酋猴腸道菌群組成的比較[J]. 四川動物， 2019， 38（1）： 1-10.

[8] 馬逸清. 黑龍江省獸類志[M]. 哈爾濱： 黑龍江科學技術出版社， 1986： 368.

[9] 路紀琪， 呂國強， 李新民. 河南嚙齒動物志[M]. 鄭州： 河南科學技術出版社， 1997： 178.

[10] 蘇航， 周思宇， 楊文建， 等. 橫道河子地區大林姬鼠腸道菌群組成的性別差異[J]. 中南農業科技， 2022， 43（2）： 12-14.

[11] 周思宇， 蘇航， 楊文建， 等. 牡丹江三道關林場大林姬鼠腸道菌群與功能預測[J]. 中國林副特產， 2022（4）： 19-21.

[12] 周思宇， 蘇航， 楊文建， 等. 大林姬鼠與棕背？腸道菌群與功能預測的對比分析[J]. 內蒙古農業大學學報（自然科學版）， 2022， 43（1）： 1-4.

[13] 史倍寧， 趙耀， 林子涵， 等. 圈養梅花鹿腸道菌群組成的性別差異[J]. 野生動物學報， 2023， 44（2）： 330-338.

[14] 郭金昊， 袁子奧， 張瑋琪， 等. 內蒙古赤峰地區東北馬鹿 （Cervus elaphus xanthopygus） 冬季腸道微生物多樣性研究[J]. 野生動物學報， 2020， 41（2）： 261-271.

[15] FLINT H J， BAYER E A， RINCON M T， et al. Polysaccharide utilization by gut bacteria： potential for new insights from genomic analysis[J]. Nature Reviews. Microbiology， 2008， 6（2）： 121-131.

[16] B？魧CKHED F， DING H， WANG T， et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2004， 101（44）： 15718-15723.

[17] HOOPER L V. Bacterial contributions to mammalian gut development[J]. Trends in Microbiology， 2004， 12（3）： 129-134.

[18] HOOPER L V， WONG M H， THELIN A， et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine[J]. Science， 2001， 291（5505）： 881-884.

[19] SEARS C L. A dynamic partnership： celebrating our gut flora[J]. Anaerobe， 2005， 11（5）： 247-251.

[20] NARAT V， AMATO K R， RANGER N， et al. A multi-disciplinary comparison of great ape gut microbiota in a Central African forest and European zoo[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 19107.

[21] SHIN N R， WHON T W， BAE J W. Proteobacteria： microbial signature of dysbiosis in gut microbiota[J]. Trends in Biotechnology， 2015， 33（9）： 496-503.

[22] 劉金月， 劉德凱， 王璐瑤， 等. 人工養殖西伯利亞狍腸道微生物組成的雌雄差異[J]. 野生動物學報， 2021， 42（2）： 428-436.

[23] FANG W， FANG Z M， ZHOU P， et al. Evidence for lignin oxidation by the giant panda fecal microbiome[J]. PLoS One， 2012， 7（11）： e50312.

[24] ZHONG Y B， KANG Z P， WANG M X， et al. Curcumin ameliorated dextran sulfate sodium-induced colitis via regulating the homeostasis of DCs and Treg and improving the composition of the gut microbiota[J]. Journal of Functional Foods， 2021， 86： 104716.