組蛋白去乙酰化抑制劑誘導羽衣甘藍小孢子胚狀體發(fā)生和植株再生

摘要：羽衣甘藍是2年生植物，2年完成1個有性生殖世代，游離小孢子培養(yǎng)是加快其純合化的有效途徑。但是由于羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)的誘胚率低，使其難以育種應用。組蛋白乙酰化是一種重要的表觀遺傳學機制，影響小孢子發(fā)育途徑，促進小孢子胚狀體發(fā)生。本研究分別用不同濃度的組蛋白去乙酰化抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A處理羽衣甘藍紅斑鳩的小孢子，以誘導胚狀體發(fā)生。結果表明，辛二酰苯胺異羥肟酸濃度為0.075 μmol/L時，紅斑鳩獲得最多胚狀體，為每個花蕾獲得20.24個胚狀體，同時直接成苗率也達到最高，為16.07%。曲古菌素A濃度為0～0.150 μmol/L時，紅斑鳩的胚狀體發(fā)生率和直接成苗率都降低。適當濃度的辛二酰苯胺異羥肟酸可以促進羽衣甘藍紅斑鳩小孢子胚狀體發(fā)生和直接成苗率，而0～0.150 μmol/L曲古菌素A對羽衣甘藍紅斑鳩胚狀體的發(fā)生和直接成苗率有抑制作用。

關鍵詞：羽衣甘藍；小孢子培養(yǎng)；組蛋白去乙酰化抑制劑；胚狀體發(fā)生

中圖分類號：S635.904" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0168-06

收稿日期：2023-03-30

基金項目：江蘇省重點研發(fā)（現代農業(yè)）計劃（編號：BE2021376）。

作者簡介：姚悅梅（1974—），女，新疆石河子人，研究員，從事羽衣甘藍種質創(chuàng)新利用與栽培技術研究。E-mail：1045714975@qq.com。

通信作者：戴忠良，碩士，研究員，從事甘藍類蔬菜遺傳育種研究。E-mail：daizhongliang2008@126.com。

羽衣甘藍葉片層次豐富，株型緊湊，被譽為觀葉植物中的牡丹花，可直接用于瓶插和盆景。觀賞時間長且心葉色鮮艷，秋冬季節(jié)被廣泛應用于景觀美化。栽培觀賞期有3～4個月。羽衣甘藍為綠色春化植物，雜合基因型材料需要6～8年才能培育出可用于商業(yè)種子生產的純合自交系。因此，加速育種材料的純合化具有重要的商業(yè)意義。

游離小孢子培養(yǎng)是利用細胞全能性和培養(yǎng)單倍體小孢子從而獲得再生植株，可以縮短獲得純合株系的時間［1］。自Lighter在1989年首次通過羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)成功獲得再生植物以來，這項技術一直在不斷改進、發(fā)展并應用于許多十字花科植物［2］。羽衣甘藍的小孢子培養(yǎng)體系也得到了改進和優(yōu)化［3-11］。影響小孢子胚狀體發(fā)生的因素有很多，包括供體植物的基因型、生長狀態(tài)、培養(yǎng)基、小孢子活力、激素處理和培養(yǎng)環(huán)境等［12］。植物生長調節(jié)劑可以促進小孢子胚狀體發(fā)生，例如2，4-表油菜素內酯、脫落酸、水楊酸和茉莉酸、谷胱甘肽和 α-生育酚［7，13-14］。Lighter發(fā)現，在培養(yǎng)基中添加 6-芐基氨基嘌呤和萘乙酸可以提高甘藍小孢子胚狀體發(fā)生率［2］。Feng等在2009年對白菜的研究中發(fā)現，0.05 mg/L 6-芐基氨基嘌呤和0.1～0.2 mg/L 6-萘乙酸可將小孢子胚狀體發(fā)生率提高到8.13個胚/蕾［15］。Chen等在羽衣甘藍的研究中，在nln-13培養(yǎng)基中添加亞甲基藍，提高了胚狀體誘導率［3］，Ari等在2021年對小孢子進行冷休克處理，也提高了胚狀體誘導率［5］。早期，筆者進行了羽衣甘藍小孢子培養(yǎng)試驗，發(fā)現胚狀體誘導非常困難。Jiang等發(fā)現曲古菌素A促進了小麥胚狀體發(fā)生［16］。本試驗研究了不同濃度的組蛋白去乙酰化抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A對羽衣甘藍紅斑鳩小孢子胚誘導率和植株再生的影響，用流式細胞儀檢測再生植株的倍性，并研究DH系的園藝特性，以期加速羽衣甘藍的育種進程，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇羽衣甘藍紅斑鳩作為小孢子培養(yǎng)材料。植株種子于2018年7月中旬在試驗基地播種。8月移植到花盆中，10月移植到溫室中。翌年1—2月在溫室抽薹開花，在晴天選擇生長條件良好的花序用于小孢子培養(yǎng)。植株分別種植于沈陽農業(yè)大學和江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農業(yè)科學研究所實驗基地。

1.2 小孢子培養(yǎng)

小孢子培養(yǎng)試驗在Sato等的方法［17］基礎上進行了修改。選擇花瓣與花藥長度之比（P/A）為0.5～0.8的花蕾作為試驗材料，置于4 ℃冰箱中24 h。然后分別用體積分數為75%的乙醇和質量濃度為0.1%的氯化汞消毒花蕾30 s和6 min，然后用無菌超純水洗滌3次，每次5 min。將花蕾放置于8～10 mL B5液體培養(yǎng)基中，用無菌玻璃棒研磨分離小孢子。依次用74 μm不銹鋼細胞篩和40 μm細胞篩過濾懸浮液。隨后，將懸浮液倒入50 mL離心管中，加入B5液體培養(yǎng)基至30 mL，并在2 000 r/min下離心3 min。棄上清液，再次加入B5液體培養(yǎng)基至30 mL，然后離心 3 min。再次移除上清液，將得到的小孢子倒入NLN培養(yǎng)基［18］，并使用血球計數板將小孢子濃度調整為1×105個/mL。然后將小孢子懸浮液裝入 5 mL 無菌塑料培養(yǎng)皿（60 mm×15 mm）。每個培養(yǎng)皿加入100 μL活性炭。最后，用Parafilm 封口膜密封培養(yǎng)皿，在33 ℃下培養(yǎng) 24 h，然后轉移至25 ℃黑暗培養(yǎng)。

1.3 組蛋白去乙酰化抑制劑處理

將辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A（美國賽萊克斯化學公司）溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，濃度為0.5 mmol/L。將溶液的pH值調節(jié)至5.8，并在無菌條件下過濾。配制0、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.015 μmol/L的辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A。在小孢子培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)皿中添加5 mL小孢子懸浮液，分別添加不同體積的辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A。以 0.025 μmol/L 為例，每個培養(yǎng)皿（5 mL小孢子懸浮液）需要250 nL 辛二酰苯胺異羥肟酸。因此，分別向每個培養(yǎng)皿中添加0 nL（相當于0 μmol/L作為對照）、250 nL（0.025 μmol/L）、500 nL（0.050 μmol/L）、750 nL（0.075 μmol/L）、1.00 μL（0.100 μmol/L）、1.25 μL（0.125 μmol/L）和1.50 μL（0.150 μmol/L）辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A溶液。

1.4 胚狀體發(fā)生與植株再生

當胚狀體長到0.5 cm時（小孢子培養(yǎng)后約 20 d），將其轉移到45 r/min搖床中，25 ℃暗培養(yǎng)1周。統計胚狀體數量并轉移到固體Murashige and Skoog（MS）培養(yǎng)基（含7.5 g/L瓊脂粉、0.1 g/L活性炭、30 g/L蔗糖，pH值為5.8）中。將胚狀體種植在錐形瓶中，當胚生長成愈傷組織時，將愈傷組織切割并轉移到含有5.5 g/L瓊脂粉的MS固體分化培養(yǎng)基中。這個過程重復2～3次，每次持續(xù)20～25 d。

1.5 倍性鑒定

用FACSCalibur流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）鑒定再生植株的倍性。選擇葉面積約 2 cm2 的新鮮葉片，置于培養(yǎng)皿中，加入 1.5 mL chopping buffer緩沖溶液（含0.5 mmol/L精胺、15 mmol/L Tris、2 mmol/L EDTA-2Na、0.1% TritonX-100、20 mmol/L NaCl、80 mmol/L KCl和 15 mmol/L β-巰基乙醇，pH值為7.2～7.5）。用醫(yī)用剪刀快速切碎葉片組織，經過300目篩過濾到離心管中，10 000 r/min離心10 min。分離上清液并避光加入1 mL PI染料溶液染色15min。最后，使用500目篩將混合溶液過濾到樣品管中進行測定。以二倍體植株作為對照。

1.6 試驗設計與數據分析

在小孢子培養(yǎng)試驗中，每個組蛋白去乙酰化酶抑制劑濃度處理重復3次。小孢子培養(yǎng)之后20 d統計胚狀體數。使用SPSS軟件進行數據分析，并使用單因素方差分析（α=0.05）進行數據顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A對小孢子胚狀體發(fā)生的影響

辛二酰苯胺異羥肟酸促進了羽衣甘藍紅斑鳩小孢子胚狀體的發(fā)生（表1）。辛二酰苯胺異羥肟酸濃度為0.075 μmol/L時，紅斑鳩胚狀體發(fā)生率達到最高，即20.24胚/蕾，是對照組的1.39倍（圖1）。辛二酰苯胺異羥肟酸濃度超過0.075 μmol/L時會產生負面影響，小孢子胚狀體誘導率降低。不同濃度辛二酰苯胺異羥肟酸誘導小孢子胚胎發(fā)生率存在顯著差異。

曲古菌素A對羽衣甘藍紅斑鳩胚狀體的發(fā)生產生了抑制作用（表2）。0.025～0.150 μmol/L曲古菌素A均導致紅斑鳩胚狀體發(fā)生率降低。其中0.075 μmol/L曲古菌素A誘導紅斑鳩胚狀體發(fā)生最少，即6.35 胚/蕾（圖2）。

2.2 辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A對小孢子植株再生的影響

將胚狀體移植到MS固體培養(yǎng)基中（圖3-b），然后直接生長成再生幼苗（圖3-c）和愈傷組織，接著將再生幼苗和愈傷組織移植到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，生根之后長成正常幼苗（圖3-d），將試管苗移植到花盆中（圖3-e）。當辛二酰苯胺異羥肟酸濃度為0.075 μmol/L時，紅斑鳩直接長成幼苗的比例最高，為16.07%，是對照的4.37倍，胚狀體長成愈傷組織的比率達到最低，為46.43%，是對照的73%，胚狀體死亡率提高到37.50%，是對照的1.13倍。紅斑鳩胚狀體的死亡率在 0.025 μmol/L 時降到最低值，為17.24%，是對照的52%（表3）。

0～0.150 μmol/L 曲古菌素A對紅斑鳩直接成苗率有抑制效果，0.10 μmol/L 曲古菌素A效果最為明顯，直接成苗率為0。當曲古菌素A濃度為0.050 μmol/L時，紅斑鳩愈傷組織的比率達到最低，為61.03%，是對照的98%。曲古菌素A提高了紅斑鳩胚狀體死亡率，當曲古菌素A濃度為 0.050 μmol/L 時，胚狀體死亡率達到最高，為36.65%，是對照的1.09倍（表4）。

2.3 小孢子再生植株的倍性鑒定

紅斑鳩的小孢子游離培養(yǎng)的再生植株是由不同倍性的植株組成的，分為單倍體、二倍體、四倍體。再生植株的倍性是通過流式細胞儀鑒定，圖4中橫坐標接近100、200、400分別代表單倍體、二倍體、四倍體植株，共獲得紅斑鳩再生植株1 023株，其中單倍體植株746株，占比最高，為72.92%，雙倍體植株275株，占比為26.88%，四倍體植株只有2株，占比為0.20%。

2.4 DH系園藝學特征

小孢子游離培養(yǎng)獲得的雙單倍體品系的園藝性狀有著豐富的變異。紅斑鳩表現為紅色內葉綠色外葉。通過游離小孢子培養(yǎng)獲得的DH系有內外葉都是紅綠嵌合（圖5-a）、內葉紅綠嵌合綠色外葉（圖5-b，5-c）、粉色內葉綠色外葉（圖5-d）、內葉紅綠嵌合外葉部分嵌合部分綠色（圖5-e）和白色內葉綠色外葉（圖5-f）。

3 討論與結論

本研究采用辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A處理羽衣甘藍紅斑鳩小孢子。結果表明，當辛二酰苯胺異羥肟酸濃度為0.075 μmol/L，紅斑鳩獲得了最多的胚狀體，每個花蕾可得到20.24個胚狀體，并將直接成苗率提高至16.07%。0.000～0.150 μmol/L曲古菌素A對羽衣甘藍紅斑鳩胚狀體的發(fā)生和成苗率有抑制作用。其中0.075 μmol/L的曲古菌素A誘導紅斑鳩胚狀體發(fā)生最少，每個花蕾僅有6.35個胚狀體。0.100 μmol/L 曲古菌素A效果最為明顯，直接成苗率為0。

組蛋白去乙酰化抑制劑對小孢子胚狀體發(fā)生有明顯的影響。辛二酰苯胺異羥肟酸是組蛋白去乙酰化抑制劑。組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙酰化酶之間的平衡調節(jié)組蛋白乙酰化。當植物體內的酶活性受到抑制時，平衡被打破，組蛋白乙酰化水平發(fā)生變化，從而誘導小孢子胚狀體主要調控基因的轉錄和表達；因此，大量細胞從花粉途徑轉變?yōu)榕郀铙w發(fā)育途徑，隨后產生大量胚狀體［19］。在甘藍型油菜的研究中，Li等發(fā)現，組蛋白去乙酰化抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸增加了小孢子胚狀體發(fā)生的總量［20］。在對小白菜的研究中，發(fā)現丁酸鈉、曲古菌素A和辛二酰苯胺異羥肟酸可提高胚狀體產量［19］。Liu等發(fā)現，曲古菌素A對3種切花羽衣甘藍小孢子胚胎發(fā)生有促進作用［21］。在本研究中，羽衣甘藍紅斑鳩小孢子分別用7個濃度的辛二酰苯胺異羥肟酸和曲古菌素A處理。結果表明，在試驗濃度范圍內辛二酰苯胺異羥肟酸提高了的小孢子胚狀體發(fā)生率。不同濃度辛二酰苯胺異羥肟酸表現出不同的胚狀體誘導效果，0.075 μmol/L 辛二酰苯胺異羥肟酸效果最好。但曲古菌素A抑制了胚狀體的發(fā)生。

利用雜交種作為小孢子培養(yǎng)材料可以產生豐富的純和突變材料。Liu等對紅葉切花羽衣甘藍雙色鶴進行小孢子培養(yǎng)產生了具有粉紅色、白色和綠色葉子的材料［21］。本研究中，對紅色內葉的紅斑鳩進行小孢子培養(yǎng)，產生了紅綠嵌合葉片、粉色葉片和白色內葉的純合系。純合系具有豐富變異是培育觀賞甘藍的重要材料。觀賞甘藍純合系的所有基因位點都是純合的，可以穩(wěn)定遺傳，是選育高產、優(yōu)質、強優(yōu)勢組合的寶貴材料。

本研究篩選出了適合羽衣甘藍的小孢子胚狀體誘導劑，并確定了切花羽衣甘藍的適宜濃度，對游離小孢子培養(yǎng)在羽衣甘藍上的應用具有重要意義。本研究為改進羽衣甘藍的游離小孢子培養(yǎng)做出了貢獻，下一步將以純合系為親本配制雜交組合，測定其配合力，篩選出優(yōu)良雜交種。

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