產鐵載體的根際促生菌鑒定及其對月季生長和養分吸收的影響

摘要：以月季藍絲帶根際土為試材，采用鉻天青S（CAS）瓊脂平板測定法對根際促生菌進行分離，利用平板劃線法對菌株進行分離提純，分析不同分離菌株的促生效果和鐵吸收能力，并探索鐵載體物質對月季礦質元素吸收的影響。結果表明，通過CAS瓊脂培養基共獲得3株分離株（SP1、SP2、SP3），16S rRNA分子鑒定顯示，SP1、SP2、SP3均屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），分別為銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）、喜昆蟲假單胞菌（P. entomophila）、惡臭假單胞菌（P. putida）。其中，SP3促生效果、鐵含量較佳，鐵載體活性可達87.20%。此外，SP3可分泌嗜鐵素將不溶性 Fe（OH）3 轉化為可溶性鐵，提高根系及地上部鐵含量，且顯著影響月季幼苗對其他元素（K、P、Ca、Mg、Zn、Mn）的吸收。綜上，從月季根際分離得到的1株惡臭假單胞菌（SP3）具有較佳的產鐵載體活性，可促進植株生長、鐵含量及礦質養分吸收，或可作為開發高效菌肥的潛在資源。

關鍵詞：假單胞菌；產鐵載體；月季；地上部；根系生長；養分吸收；嗜鐵素

中圖分類號：S685.120.6；S182" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0174-08

收稿日期：2023-09-14

基金項目：上海市現代農業產業技術體系項目（編號：KY2-0000-21-05）。

作者簡介：張 婷（1987—），女，江蘇丹陽人，碩士，講師，主要從事園林植物栽培養護研究工作。E-mail：tingz280026@163.com。

通信作者：游小英，碩士，副教授，主要從事園林植物培育研究工作。E-mal：xyyoush@163.com。

鐵（Fe）是植物生長必需的礦物質營養素，在細胞呼吸作用、光合作用及催化金屬蛋白等主要代謝過程中發揮著重要作用［1］。鐵是地殼中的第四大礦質元素，但在土壤（尤其是中性和堿性土壤）中主要以不溶性的Fe3O4及氫氧化物的形式存在而難以被植物有效利用［2］。鐵缺乏時，植物由于葉綠素合成受到抑制，容易出現失綠現象，從而阻礙葉片的光合作用進程。嚴重缺鐵時，植物生長發育矮小，產量及植物免疫性能降低［3］。補充鐵元素已成為農作物、園藝作物生產中不可或缺的重要措施之一。月季（Rosa chinensis）為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）多年生植物，月季花香濃郁、花型洋溢、色澤高雅，可作為植物源香水和精油的重要來源植物之一，兼具觀賞價值和工業價值，已被廣泛應用于園林、食品、化妝品等多個領域［4］。然而種植的月季土壤多為堿性，這使得月季可用鐵元素缺乏，反過來會影響月季的開花品質和綻放周期，從而降低栽培效益［5］。

針對性施肥是農林業生產環節中彌補土壤養分不足的必要措施［6］。以往的農林業生產中以施用化肥為主，近10年來，微生物菌肥的應用效果顯著，已成為發展高質量農業的優選肥料類型之一［7］。根際促生菌（PGPR）是微生物菌肥主要的功能性組成成分，可通過溶解磷酸鹽、嗜鹽、固氮和分泌鐵載體增加土壤有效養分，提高植物對養分的利用率及品質［8］。PGPR還可合成并釋放多種激素類物質，如吲哚乙酸（IAA）、赤霉酸、乙烯以及其他揮發性有機化合物［9］。黃靖等的研究表明，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）可分泌鐵載體、植酸、IAA和玉米素等，從而提高金線蓮地上部干質量，促進皂苷和黃酮（槲皮素、山柰酚、異鼠李素）的累積量［10］；李文祥等研究發現，來自金水仙根際的芽孢桿菌屬（Bacillus）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）的菌株均可分泌氨基環丙烷羧酸脫氨酶，激活切花月季抗氧化系統、降低乙烯釋放速率［11］。此外，PGPR還可誘導增強植物免疫系統，從而提高植物對病毒、真菌性病原菌及對非脅迫的抵抗力。

PGPR通過多種機制促進植物對鐵的吸收，在植物的鐵吸收中亦發揮著非常重要的作用。鐵載體是微生物在低鐵條件下分泌的低分子量有機物質，鐵載體可螯合Fe3+并向微生物提供鐵營養［12］。研究表明，產鐵載體的細菌可以產生不同結構的鐵載體，促進缺鐵環境下的植物生長［13］。例如，埃希菌屬（Escherichia）產生腸菌素（enterobactin）、芽孢桿菌屬（Bacillus）產生桿菌烯（bacillibactin）、假單胞菌屬（Pseudomonas）產生嗜鐵素（pyoverdine）［14］，其中假單胞菌屬是研究較多的菌群之一。研究表明，施用3種假單胞菌菌株（Pseudomonas sp.1T、Pseudomonas sp.2S和Pseudomonas sp.C7R12）的鐵載體物質時，鐵載體可與鐵的螯合物（Fe-pvds）促進豌豆的鐵累積量［15］。上述研究為產鐵載體PGPR的應用提供了一定的理論依據。然而根際微生物群組成由宿主特殊的招募機制所決定［16］，來自同一宿主的PGPR或能更好地定殖于同一宿主根際。因此，本研究基于從鐵高效利用型月季根際分離產鐵載體菌株，探索菌株對堿性土壤中月季的促生效應，本研究結果可為產鐵載體型微生物應用于園林栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集及產鐵載體菌株的分離與篩選

4個根際土壤樣品于2022年5月均采集自上海辰山植物園月季園（37°07′49″N，121°18′31″E）藍絲帶月季根際土壤。避開施肥點，以月季地面主莖為中心、半徑20 cm、深度30 cm，用鏟子挖出整個根部，輕輕搖動除去根系最外部的土壤，該土壤自然風干以用于后續盆栽基質用土。采用消毒刷子收集根表0.1 cm附著的根際土壤，放入無菌密封袋中，帶回實驗室并保存于4 ℃冰箱中。

稱取約5.0 g根際土壤至無菌三角瓶中，并加入45 mL無菌蒸餾水，于28℃恒溫搖床振蕩（120 r/min） 15 min，采用無菌蒸餾水稀釋土壤懸浮液，吸取稀釋液100 μL涂在鉻天青S（CAS）檢測培養基上，并將平板在28 ℃恒溫培養箱中培養24 h。當細菌產生鐵載體時固體培養基上出現黃橙色暈圈，暈圈的大小（以直徑計）反映鐵載體的產生性能；挑取3環較大的黃橙色暈圈，分別標注為SP1、SP2、SP3；在LB培養基上進行3次劃線、純化、分離以獲得菌株的純培養物，并對獲得的菌株純培養物進行分子鑒定。

1.2 鐵載體物質與IAA物質定量分析

菌株鐵載體定量分析參照葛淼淼等的方法［17］：取等體積的菌株培養上清液、蒸餾水，與CAS檢測液混勻，避光靜置反應45 min，在680 nm處每隔6 h檢測細菌-CAS檢測液、蒸餾水-CAS檢測液的吸光度D1、D2，通過D1/D2分析菌株鐵載體產生能力，D1/D2＜0.8則產鐵載體能力較高。采用鐵載體活性單位（SU）表示菌株鐵載體的產量，SU=［（D2-D1）/D2］×100%。

1.3 產鐵載體菌株的分子鑒定

采用細菌基因組提取試劑盒（D3350-01，北京天根生化科技公司）提取菌株總DNA，16S rRNA基因擴增引物：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，對3株待測菌株進行擴增。聚合酶鏈式反應（PCR）反應體系為25 μL：天根Taq PCR混合物12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，采用雙蒸水（ddH2O）補足至25 μL。熱循環參數如下：95 ℃預變性3 min；98 ℃變性15 s，62 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；72 ℃ 8 min。將16S rRNA基因PCR產物純化后進行測序分析，基于NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）與GenBank中的序列對測序結果進行BLAST檢索以確定相似序列。該工作委托生工生物工程（上海）科技有限公司完成。

1.4 鐵載體物質的分離與提純

根據Hoegy等描述的嗜鐵素特性［18］判斷是否存在嗜鐵素：上清液呈黃綠色，在紫外光下發出熒光，并且在400 nm處有吸收峰，則上清液中存在嗜鐵素。收集琥珀酸液體培養基的SP3上清液，在紫外光下觀察熒光現象并通過紫外分光光度計（UV-2550，Shimadzu，Kyoto，Japan）測量吸收光譜。鐵載體物質的提取步驟根據Trapet等所述方法［19］進行，將上清液送至生工生物工程（上海）科技有限公司進行鐵載體物質的純化，得到該鐵載體（Pds）的凍干粉用于后續試驗。

1.5 盆栽土培試驗

用0.8%次氯酸鈉對月季種子進行表面消毒 5 min，用流動無菌水進行洗滌，將種子放置于無菌蛭石中培養，培養至幼苗4葉期。設置接種不同促生菌處理（SP1、SP2和SP3），以不施菌為對照（CK），各處理重復5次，共20盆。

將幼苗移植到裝有1 kg滅菌土壤的塑料盆中。該土壤為月季根系包裹土壤，其理化性質如下：pH值7.94，堿解氮含量55.68 mg/kg，有效磷含量25.86 mg/kg，速效鉀含量55.01 mg/kg，DTPA提取有效鐵（DTPA-Fe）含量3.27 mg/kg。接菌處理接種10 mL相應菌株的懸浮液，三者有效活菌數均約為1.0×107 CFU/mL，CK則施入同體積的無菌水。試驗期間，植物光周期為14 h/10 h，溫度為28 ℃/22 ℃，空氣濕度為75%～90%，光照度為1 000～1 400 μmol/（m2·s），盆栽周期30 d。

1.6 盆栽沙培試驗

基于盆栽土培的試驗結果，將促生最佳、鐵含量最高的菌株提純鐵載體物質，進行相應的水培試驗。設置不施鐵（NFe）、施用可溶性乙二胺四乙酸鐵鈉（AFe）、施用難溶性氫氧化鐵（IFe）及難溶性氫氧化鐵結合施用鐵載體物質（IFe+Pds），各處理重復5次，共20盆，施鐵處理中的施用濃度皆為 4.6 mmol/L。將幼苗移植到裝有2 kg滅菌沙的盆中，按上述處理將相應鐵化合物配制為改良的Hoagland營養液，每2 d施用10 mL，沙培培養周期14 d。

1.7 盆栽測定指標分析

1.7.1 根系形狀參數測定 土壤培養第30天，將盆栽器具剖開，將月季地上部、根系分開，根系采用流動蒸餾水小心沖洗，用吸水紙吸干根表水分。根系性狀相關參數測定采用EPSON V800掃描儀對根系進行掃描，WinRHizo Basic 2013C軟件（Regent Instruments Inc，Canada）分析；采用ImageJ軟件（ImageJ 1.48u，Rasband）測定根毛長度。

1.7.2 地上部生長參數、SPAD值及礦質養分含量測定 采用葉綠素計（SPAD-502m，Konica Minolta，Japan）測定新葉的葉綠素含量（以SPAD值）。將根和地上部分開，105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干，記錄干物質質量。再將樣品粉碎處理，過0.25 mm篩，以測定礦質養分含量。基于M6微波消解系統（上海屹堯儀器科技發展有限公司）采用HNO3消解，并使用電感合成等離子體原子發射光譜儀（iCAP 7000，Thermo Scientific，USA）測定P、K、Ca、Mg、S、Cu、Mn、Zn、B及Fe含量。

1.7.3 根尖染色觀察 采用上海遠慕生物科技有限公司生產的普魯士藍鐵染色試劑盒（Perls stain，伊紅法）對月季根系進行Fe3+染色：采用黃血鹽（K4［Fe（CN）6］）與鹽酸（HCl）按1 ∶1體積比配制為Perls溶液，剪取月季幼嫩根尖，放置于Perls溶液中染色45 min，染色結束先采用去離子水小心沖洗，吸水紙吸干根尖水分，接著采用10 mmol/L疊氮化鈉（NaN3）和0.3%甲醇混合液（按體積比5 ∶1）緩慢沖洗1 min，吸水紙吸干根表溶液。最后采用 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖鹽水（pH值7.4）沖洗 1 min，吸水紙再次吸干根表溶液，用體視鏡（SMZ-168，上海朗善光學儀器有限公司）觀察根尖。

1.8 數據處理與統計分析

采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析與Duncan’s多重比較檢驗平均值間的顯著性（α=0.05）。采用Origin 2020軟件完成圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 產鐵載體根際促生菌的分子鑒定

由圖1可知，從月季根際分離得到3株產鐵載體菌株，分別標注為SP1、SP2、SP3。基于NCBI數據庫進行Blast比對，采用鄰接法構建16S rRNA系統進化樹，結果顯示，SP1、SP2、SP3分別與銅綠假單胞菌（P. aeruginosa） D1-3（序列號MN922571）、喜昆蟲假單胞菌（P. entomophila） KLP01（序列號MW250866）、惡臭假單胞菌（P. putida） PR32537（序列號KR349258）在同一分支上；Blast同源性比對相似性分別達99.86%、99.93%、99.79%。因此確定SP1、SP2及SP3均隸屬假單胞屬（Pseudomonas），分別為銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）、喜昆蟲假單胞菌（P. entomophila）及惡臭假單胞菌（P. putida）。

2.2 根際促生菌的產鐵載體能力分析

由圖2-a可知，SP1、SP2、SP3分離株在CAS瓊脂培養基上的菌落周圍均呈現黃橙色暈圈。暈圈大小表明SP1、SP2、SP3菌株均具有較強的鐵載體產生能力，且3株菌株的鐵載體生產趨勢基本一致，即72 h的培養時間內，3株菌株的鐵載體活性單位（SU）均呈逐漸增加趨勢。其中，0～24 h鐵載體生產最為迅速，24～48 h相對緩慢，48 h之后SU趨于平緩（圖2-b）。但SP1、SP2、SP3的鐵載體產生能力存在一定差異，培養6 h時，各菌株SU表現為SP2＜SP1＜SP3，此后則表現為SP1＜SP2＜SP3；在培養48 h后，SP3鐵載體活性單位均值為87.20%，而SP2、SP1僅分別為65.28%、73.79%。

2.3 產鐵載體根際促生菌的促生效應分析

由表1可知，SP1、SP2、SP3菌株對月季地上部、根系生長參數及鐵含量產生了顯著影響。與不施菌處理（CK）相比，施菌處理（SP1、SP2、SP3）在地上部干質量、根系干質量、株高、根系表面積、根系總長度、根系體積、地上部鐵含量、 根系鐵含量等方面整體上較高，其變幅范圍分別為8.33%～29.17%、5.88%～41.18%、3.03%～39.45%、9.66%～41.88%、1.46%～36.03%、-23.08%～30.77%、5.39%～84.83%、3.78%～88.23%。其中，地上部干質量、株高分別以SP1、SP2存在極大值外，其他生長指標及鐵含量均以SP3最高，且任一指標中，SP3皆顯著大于CK，表明SP3最有利于月季植物的生長發育及鐵吸收。

2.4 SP3培養上清液中鐵載體物質檢驗

為了表征SP3產生的鐵載體，將SP3接種在缺鐵培養基中，培養結束后，SP3上清液在自然光下呈黃綠色，CK上清液透明無色（圖3-a）；在紫外光照射下SP3上清液具有熒光效應，而CK上清液無明顯現象（圖3-b），同時SP3上清液的紫外吸收光譜在400 nm處顯示出明顯的吸收峰（圖3-c），表明SP3發酵上清液存在一定含量的嗜鐵素物質。此外，將SP3分離株接種到含有難溶性鐵的培養基中，發現上清液中有效鐵含量顯著增加（圖3-d），表明SP3分泌的嗜鐵素具有將難溶性鐵轉化為有效鐵的良好功能作用。

2.5 SP3嗜鐵素對沙培月季鐵含量及根尖鐵染色觀察

由圖4-a可知，在月季植株地上部鐵含量從高到低表現為NFe處理＜IFe處理＜AFe處理＜IFe+Fds處理，其中與IFe+Fds處理相比，NFe、IFe、AFe處理分別降低14.36%、37.45%、41.89%；IFe+Fds處理與AFe處理、NFe處理與IFe處理間均無顯著差異。在根系中，以AFe處理鐵含量最高，達 1 129.47 μg/g，其他處理較其顯著（Plt;0.05）降低62.04%～81.24%；其次為IFe+Fds處理，IFe、NFe處理較其分別顯著降低42.71%、50.59%。對幼嫩根尖的Perls染色顯示，IFe+Fds處理的根尖染色明顯深于IFe和NFe處理，且IFe+Fds處理與AFe處理更為接近（圖4-b），這表明添加嗜鐵素顯著增加了月季根系對鐵的吸收與累積。

2.6 SP3嗜鐵素對沙培月季礦質養分含量的影響

由圖5可知，來自SP3菌株的嗜鐵素物質對大量元素（K、P）、中量元素（Ca、Mg、S）及微量元素（Cu、Mn、Zn、B）生產了一定影響。其中，K、P、Mn含量以IFe+Fds處理最高，其他處理較其降低19.66%～25.24%、20.98%～31.81%、36.74%～69.68%；Ca、Mg含量以NFe處理最高，其他處理較其分別降低0.76%～20.48%、6.30%～27.14%；S含量以AFe處理最高，IFe+Fds、IFe、 NFe處理較其

分別顯著降低44.21%、42.35%、43.61%；Zn含量以IFe處理最高，AFe、，IFe+Fds、NFe處理較其分別降低78.90%、59.04%、3.09%；而在Cu、B含量中， 各處理從高到低依次為AFe＜IFe+Fds＜IFe＜NFe、IFe+Fds＜IFe＜NFe＜AFe，但2個指標在各處理間均無顯著差異。特別地，相較于NFe和IFe處理，IFe+Fds處理下的K、P和Mn含量顯著提高，而Ca、Mg、Zn含量顯著降低。

3 結論與討論

在土壤尤其是堿性土壤中，游離鐵通常被氧化并沉淀成鐵氧化物質，主要以Fe（OH）3的形式存在［20］。因此，堿性土壤中速效鐵含量較低，從而使植物無法吸收到足夠的鐵離子，嚴重阻礙植物生長［2，21］。在應對土壤有效的養分供應時，目前的研究主要基于基因工程改良手段以培育養分利用高效型或養分耐受更佳的品種，鮮有考慮植物微生物組及植物與微生物組的相互作用［22］。此外，對生物或非生物環境變化作出反應的植物的根部分泌物會發生變化，這反過來會影響根部微生物組的組成［8］，因此某些植物根際的有益細菌可能是緩解其他植物脅迫的關鍵因素［23］。月季是一種優良的園林植物，對缺鐵具有較強的耐受性。本研究從月季根際土壤采用鉻天青S（CAS）檢測培養基分離得到3株可產生鐵載體的細菌菌株，分別命名SP1、SP2、SP3，且CAS檢測培養顯示SP3產生鐵載體的能力最高。采用16S rRNA分子鑒定顯示該3個菌株均屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），SP1、SP2及SP3分別為銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）、喜昆蟲假單胞菌（P. entomophila）及惡臭假單胞菌（P. putida）。

假單胞菌屬（Pseudomonas）分布廣泛，代謝途徑多樣，在促進植物生長和抗病性方面發揮著重要作用［24］；此外，假單胞菌屬是研究最多的促進植物鐵吸收的群屬之一，它可以增加植物中鐵的含量，并且可以調節缺鐵相關基因的表達［25］。本研究結果表明，在堿性土壤（pH值7.94）中接種SP1、SP2、SP3均具有促進地上部、根系生長和鐵吸收作用。表明這3株假單胞菌除分泌鐵載體外，還可能具有分泌其他促生激素（如IAA）的能力。其中，SP3可通過顯著提高根表面積、根長度、根體積及鐵吸收促進植物生長。這與Liu等的研究結論［26］基本一致，即在鈣質土中，與不接種處理相比，產鐵載體的伊利諾伊類芽孢桿菌（Paenibacillus illinoisensis YZ29）和蕈狀芽孢桿菌（B. mycoides DZ13）可增強花生根系活性，提高葉片葉綠素和鐵含量。此外，王亞楠等的研究表明，產鐵載體的甲基營養型芽孢桿菌（B. methylotrophicus BMF04）菌株可促進黃瓜幼苗株高、莖粗、地上部、地下部生物量和須根數增加［27］。這些表明產生鐵載體的細菌菌株在改善植物生長及鐵營養供應方面發揮著至關重要的作用。

大量研究表明，在缺鐵條件下，大多數假單胞菌屬可產生熒光鐵載體物質——嗜鐵素［16］，嗜鐵素可以螯合鐵離子與通過化學方式螯合難溶鐵，從而為植物提供可用鐵形態［2，15，28-29］。本研究發現，SP3可分泌一定量的嗜鐵素，并且能夠將不溶性 Fe（OH）3 轉化為可溶性鐵，這表明惡臭假單胞菌（SP3）中的嗜鐵素具有在缺鐵環境中螯合Fe3+的能力。從SP3上清液中提取的嗜鐵素添加到沙培試驗中以研究其對月季幼苗的影響。結果表明，與不施鐵處理（NFe）和難溶性Fe（OH）3（IFe）相比，Fe（OH）3+嗜鐵素處理（IFe+Fds）顯著提高了月季地上部和根系的鐵含量。該結果與擬南芥［30］和豌豆［15］等植物進行的研究相似，表明鐵載體螯合物可以被植物有效吸收利用。然而，本研究結果表明，嗜鐵素在改善植物鐵營養方面不如EDTA-FeNa處理有效，這與之前的研究結果［13，31］不一致。其原因可能是嗜鐵素與形成絡合物是較為緩慢的化學過程，而本研究是分開施用方式且試驗周期較短，因此效果并未得到充分的體現。

在本研究中，施用從SP3上清液中提取的嗜鐵素也影響了月季幼苗對其他元素（K、P、Ca、Mg、Zn、Mn）的吸收，其中K、P和Mn含量顯著增加，而Ca、Mg、Zn含量顯著降低。從營養角度來看，鐵與其他元素之間存在一定競爭［2，32］，表明營養缺乏會影響植物體內其他元素之間的吸收平衡［15，33］。綜上，本研究表明從鐵高效型植物——月季根際分離得到的惡臭假單胞菌（SP3）菌株可促進月季植物的干物質累積，增加根系根長、根表面積和根體積，有效改善鐵營養。此外，SP3菌株產生嗜鐵素具有鐵載體功能，可有效緩解植物鐵限制。

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