枯草芽孢桿菌4種環脂肽抗豬δ冠狀病毒的研究

摘要：為探究從枯草芽孢桿菌Bs 916中提取的表面活性素、羅克霉素、泛革素及桿菌霉素L 4種抗菌肽對豬δ冠狀病毒（PDCoV）的抗病毒作用。首先采用CCK-8法確定抗菌肽對細胞無毒性的最佳濃度范圍，隨后分別采用RT-qPCR、Western blot及IFA 3種方法檢測Bs 916中4種環脂肽對PDCoV的抗病毒效果。結果顯示，4種環脂肽在濃 度≤50 μg/mL時對細胞無毒性，同時具有良好的抗病毒效果。相同條件下，羅克霉素抗病毒效果最佳，其次為表面活性素。本研究從枯草芽孢桿菌Bs 916中提取的表面活性素、羅克霉素、泛革素及桿菌霉素L可抑制PDCoV在細胞中的增殖，具有良好的抗病毒作用，其中以羅克霉素和表面活性素的抗病毒效果最佳，可為抗PDCoV藥物研發提供理論支持。

關鍵詞：表面活性素；羅克霉素；泛革素；桿菌霉素L；豬δ冠狀病毒

中圖分類號：S852.65+1 "文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0182-05

收稿日期：2023-05-17

基金項目：江蘇省重點研發計劃（編號：BE2021324）；江蘇省農業自主創新資金（編號：［CX（21）3127］）。

作者簡介：朱 桃（1994—），女，河南商丘人，碩士研究生，主要從事非洲豬瘟疫苗研究。E-mail：1694490993@qq.com。

通信作者：李 彬，博士，研究員，主要從事動物腹瀉病防控技術等研究，E-mail：libinana@126.com；羅楚平，博士，教授，主要從事微生物代謝產物研究，E-mail：luochuping@163.com。

豬δ冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬，是一種新型豬腸道致病冠狀病毒，主要導致新生仔豬急性腹瀉、嘔吐和脫水［1-4］。PDCoV是一種包膜病毒，基因組全長約25.4 kb，編碼15個成熟的非結構蛋白（nsp 2-16）、4個結構蛋白（棘突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M、核衣殼蛋白N）和3種輔助蛋白（NS6、NS7、NS7a）［5-6］。在這些蛋白中，N蛋白是表達量最為豐富的多功能結構蛋白，其基因全長1 029 bp，共編碼343個氨基酸。N蛋白發生在病毒感染早期，是最早產生免疫反應的抗原蛋白，最先刺激機體產生抗體，此外，它在結構和功能上具有保守性強和種屬特異性［7-8］，因此，PDCoV-N蛋白常被用于分子生物學診斷技術。PDCoV是一種新發現的豬腹瀉病毒，其傳播速度快，從最初2012年發現于香港［1］后，于2014年即于美國暴發［9］，隨后蔓延至全球［10］。PDCoV不僅對養豬業造成極大影響，還會跨物種感染牛、雞甚至是人［11-14］，危害公共健康。因此，建立快速有效的預防措施，找到抑制病毒的特效藥物至關重要。

脂肽（lipopeptide）是一類由脂肪酸和多肽分子組成的生物分子，具有一系列獨特的物理和生物學性質。其廣泛存在于自然界中，包括細菌、真菌、植物和動物等生物體內。目前，已發現枯草芽孢桿菌能夠產生多種類型的環脂肽，根據環肽的結構可分為三大家族：表面活性素、泛革素和伊枯草素。大量研究表明，芽孢桿菌產生的脂肽，具有多種生物活性，其中包括抗真菌、抗細菌、抗炎癥、抗病毒及抗腫瘤等生物活性［14-18］，但關于它們抗病毒、抗腫瘤生物活性鮮有報道。芽孢桿菌的脂肽，已經廣泛應用于農業、生物醫藥、環保、食品工業等領域［15-19］。然而，關于芽孢桿菌產生的抗菌肽在抗病毒方面的研究，大部分傾向于表面活性素抗病毒方向，而對泛革素和伊枯草素的抗病毒作用效果未見有報道。有研究表明，表面活性素是抗包膜病毒的萬能武器［17］。早在1997年，有研究證明，枯草芽孢桿菌產生的表面活性素可抑制廣譜病毒，如猴泡沫病毒（SFV）、單純皰疹病毒（HSV-1、HSV-2）、貓杯狀病毒（FCV）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、鼠腦心肌炎病毒（EMCV）、水泡型口炎病毒（VSV）［20］。2006年，Huang等從枯草芽孢桿菌fmbj上提取主要含有表面活性素、泛革素的抗菌脂肽，進行體外抗病毒試驗，研究發現抗菌脂肽對偽狂犬病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、新城疫病毒（NDV）、法氏囊病毒（IBDV）有直接滅活作用，可有效抑制NDV和IBDV的感染和復制［21］。Wang等證明枯草芽孢桿菌OKB 105及其表面活性素可抑制傳染性胃腸炎病毒（TGEV）進入細胞，并且表面活性素以劑量依賴的方式減少TGEV的斑塊產生［22］。這些研究結果表明，枯草芽孢桿菌衍生的肽是一種高效的抗病毒化合物，是研發抗病毒藥物及抗病毒疫苗較好的候選者。

本研究基于筆者所在實驗室提取的高純度芽孢桿菌抗菌肽（羅克霉素［23］、表面活性素、泛革素及桿菌霉素L），旨在探索這4種抗菌肽是否對PDCoV具有抑制作用，為抗病毒藥物的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、病毒及抗菌肽

LLC-PK1細胞購自中國獸藥檢驗所，LLC-PK1細胞培養條件為37 ℃ 5% CO2，所用培養基為DMEM+10% 胎牛血清（FBS）；PDCoV毒株CZ2020，其滴度為106.25 TCID50/mL，來自江蘇省農業科學院獸醫研究所；表面活性素、羅克霉素、泛革素及桿菌霉素L由筆者所在實驗室提純所得，所有抗菌肽先用DMEM培養基稀釋為 1 mg/mL，作為母液置于-20 ℃冰箱保存備用，后續試驗所涉及的抗菌肽稀釋溶劑，均用含有 7.5 μg/mL 胰酶的DMEM培養基。此外，本試驗于2021年12月25日于江蘇省農業科學院獸醫研究所完成。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清、DMEM培養基，購自Gibco公司；Cell Counting kit 8（CCK-8）試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；RIPA（強）蛋白裂解液、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG和β-actin，均購自上海碧云天生物技術有限公司；FITC標記的羊抗豬熒光二抗，購自Abcam公司；PDCoV-N蛋白單克隆抗體及PDCoV抗豬陽性血清，來自江蘇省農業科學院獸醫研究所。

1.1.3 主要儀器

蛋白電泳儀及蛋白轉印儀，購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；倒置熒光顯微鏡，購自日本Olympus公司；實時熒光定量PCR儀及CO2培養箱，購自美國Thermo Fisher公司；ELx 800酶標儀，購自美國BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽對細胞的毒性測定

首先采用含有7.5 μg/mL胰酶的DMEM培養基，將4種抗菌肽分別稀釋至100、50、10、5 μg/mL。將LLC-PK1細胞均勻地鋪在96孔細胞板上，37 ℃ 5% CO2條件下培養，細胞長滿單層后用無菌的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗3次，加入上述稀釋好的不同濃度的抗菌肽，每孔100 μL。同時設空白對照，每個試驗組設置3個重復。過夜培養24 h后，每孔加入 10 μL CCK-8溶液，在細胞培養箱避光培養3 h，采用ELx 800酶標儀讀取450 nm處的吸光度。細胞活力=（D抗菌肽-D培養基）/（D空白-D培養基）×100%。

1.2.2 抗菌肽對病毒增殖的影響

將LLC-PK1細胞鋪在24孔細胞板中，37 ℃ 5% CO2條件下培養，待細胞長滿單層后，采用PBS清洗細胞3次，加入MOI=0.01的PDCoV病毒液，每孔500 μL。在細胞培養箱繼續培養1.0～1.5 h，期間每隔0.5 h輕輕搖晃1次細胞板，使病毒更好地融合細胞。將融合好的細胞板用PBS清洗3次，加入不同濃度的抗菌肽，每孔500 μL，即50、10、5 μg/mL，每組試驗設3個重復，將只感染了病毒不加抗菌肽的細胞孔設為空白對照，繼續培養24 h。重復本試驗，細胞板用于后續檢測。收集上清和細胞，用于后續 RT-qPCR、蛋白免疫印跡（Western blot）及間接免疫熒光（IFA）試驗。

1.2.3 RNA提取與RT-qPCR

使用RNA提取試劑盒提取“1.2.2”節上清中的RNA，通過反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。用超敏高耐受探針法檢測試劑對cDNA進行擴增，所用引物：正向序列5′-ATCGACCACATGGCTCCAA-3′；反向序列5′-CAGCTCTTGCCCATGTAGCT-3′；探針序列5′-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAvGCT-3′。

1.2.4 Western blot檢測

取“1.2.2”節中制作好的24孔細胞板，PBS清洗3次后加入100 μL RIPA細胞裂解液，室溫下裂解10 min后刮取細胞碎片，收集蛋白液。取40 μL蛋白液樣品與5×蛋白上樣緩沖液混合，置于金屬浴中100 ℃煮樣10 min。取10 μL煮好的樣品加入12.5%蛋白膠樣品孔，90 V電壓下使樣品遷移至分離膠后將電壓升至120 V。提前將濾紙與硝酸纖維素（NC）膜浸泡于轉膜液中，采用三明治法，將膠體放于濾紙與NC膜中間，用滾輪輕輕去除氣泡。打開蛋白快速轉印儀運行 15 min。轉印后的NC膜用5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，PBST清洗3次，每次10 min。加入稀釋比為 1 ∶5 000一抗（PDCoV-N蛋白單克隆抗體）或 β-actin （1 ∶1 000）室溫下孵育2 h，PBST清洗后加入稀釋比為1 ∶10 000二抗（山羊抗小鼠）室溫孵育 2 h，最后加入ECL顯色液進行曝光顯色。

1.2.5 IFA檢測

取“1.2.2”節中制作好的24孔細胞板，PBS清洗3次后加入預冷的無水乙醇 -20 ℃ 固定30 min，棄去無水乙醇，PBS洗滌3次。每孔加入500 μL 5%脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h，PBS清洗3次，每次3～4 min。每孔加入稀釋比為 1 ∶500 的PDCoV豬血清500 μL，37 ℃孵育2 h，PBS清洗后每孔避光加入FITC標記山羊抗豬熒光二抗500 μL，稀釋比為1 ∶500，繼續孵育1 h后用PBS清洗3次至無非特異性結合，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 數據處理

用GraphPad Prism 9對數據進行統計分析及作圖，各組試驗數據采用One-way ANOVA進行統計分析，用t檢驗法對數據進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽對LLC-PK1細胞活性的影響

為確定抗菌肽藥物的最佳濃度，設置濃度梯度由高到低依次為100、50、10、5 μg/mL檢測抗菌肽對細胞的毒性。試驗采用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，在酶標儀上讀取樣品吸光度（D），計算細胞存活率。由圖1可知，抗菌肽對細胞安全濃度范圍為 50 μg/mL 以下，此時細胞生長狀態與對照孔形態無差異，細胞活力達100%；當抗菌肽藥物濃度達到 100 μg/mL 時，細胞出現不同程度的皺縮、破裂現象。

2.2 RT-qPCR檢測結果

為了研究抗菌肽對PDCoV增殖的影響，筆者所在課題組分別向感染了該病毒的細胞中加入濃度為50、10、5 μg/mL 的4種抗菌肽，并采用RT-qPCR

檢測細胞內病毒RNA的變化。由圖2可知，隨著抗菌肽濃度的增加，細胞內病毒載量逐漸降低，說明抗菌肽能夠在安全濃度范圍內通過劑量依賴的方式發揮更好的抗病毒效果。當抗菌肽濃度為 5 μg/mL 時，僅有羅克霉素（P＜0.01）和表面活性素（P＜0.05）能顯著抑制病毒增殖，而泛革素和桿菌霉素L則不具有顯著的抗病毒效果。當抗菌肽濃度達到 10 μg/mL 時，4種抗菌肽均能顯著抑制病毒增殖，其中羅克霉素（Plt;0.0 001）CT值高達25.93，其次是表面活性素（Plt;0.001），CT值高達23.96。當抗菌肽濃度升至50 μg/mL時，4種抗菌肽均能顯著抑制病毒增殖。

2.3 Western blot檢測PDCoV-N蛋白的表達

為進一步探索抗菌肽對PDCoV增殖的影響，向“1.2.2”節中制作好的細胞板中加入蛋白裂解液獲取蛋白，采用Western blot方法檢測PDCoV-N蛋白的表達水平。由圖3可知，感染了PDCoV的細胞，在濃度為50 μg/mL的4種抗菌肽作用下，可完全抑制病毒增殖，Western blot法完全檢測不到PDCoV-N蛋白特異性條帶。而羅克霉素和表面活性素在低至10 μg/mL濃度下，即可完全抑制病毒增殖。

2.4 間接免疫熒光（IFA）檢測結果

采用IFA方法檢測“1.2.2”節細胞板中細胞存在的病毒，在倒置顯微鏡下觀察熒光量，進一步確定抗菌肽抗病毒效果。由圖4可知，當濃度為 5 μg/mL 的抗菌肽作用于感染了PDCoV的細胞時，并未對病毒增殖產生顯著的影響；當抗菌肽濃度升至10 μg/mL時，羅克霉素和表面活性素表現出最佳的抗病毒效果；而當抗菌肽濃度達到50 μg/mL時，所有抗菌肽均表現出較好的抗病毒效果。這一結果與筆者所在課題組之前使用RT-qPCR檢測病毒RNA變化、Western blot檢測PDCoV-N蛋白的表達水平得到的結論一致。

3 討論與結論

PDCoV是一種新發現的具有包膜的RNA病毒，它以膜融合的方式侵入宿主細胞，引起仔豬嚴重腹瀉。目前，尚未研制出有效的疫苗和特效治療藥物。在抗PDCoV藥物研究中，具有紅藻凝集素性質的格瑞弗森（griffithsin）及褪黑激素類性質的褪黑激素（melatonin）、吲哚（indole）、色胺（tryptamine）、L-色氨酸（L-tryptophan）已被證實具有抗病毒能力［24-25］。枯草芽孢桿菌分泌的脂肽類物質也有抗病毒作用，但未有報道作為抗PDCoV藥物的研究。表面活性素是枯草芽孢桿菌的衍生物，有研究表明它是一種膜融合抑制劑［26］，具有抗多種包膜病毒的生物活性［20-21］，如單純皰疹病毒、水皰性口炎病毒、猴免疫缺陷病毒和新城疫病毒。羅克霉素是筆者所在團隊新發現的脂肽類抗生素，被證實具有抗病毒活性［23］。泛革素和桿菌霉素L在抗病毒活性方面未有報道。

本研究首先將表面活性素、羅克霉素、泛革素和桿菌霉素L，以100、50、10、5 μg/mL濃度梯度作用于LLC-PK1細胞，發現4種抗菌肽在100 μg/mL濃度下，細胞形態會發生不同程度的皺縮、破裂現象，說明抗菌肽濃度達到100 μg/mL時具有細胞毒性，其中表面活性素和桿菌霉素L對LLC-PK1細胞毒性最強，這可能與它們具有較強的溶血活性有關［27］。表面活性素、泛革素和桿菌霉素L都有表面活性劑的特性［28-29］，表面活性劑具有一定毒性，會使紅細胞溶血［30］。然而，由于表面活性劑種類繁多，其毒性也因此存在差異。其中陽離子表面活性素具有較高的溶血活性和細胞毒性［31］；相比之下，泛革素雖然同樣具有表面活性劑特性，但并不會引起強烈的溶血活性和細胞毒性。目前，泛革素的作用機制仍需進一步深入研究。本研究采用RT-qPCR、Western blot和IFA等方法檢測了不同濃度的抗菌肽對PDCoV增殖的影響。研究發現，當羅克霉素和表面活性素的濃度為10 μg/mL時，它們表現出較強的抗病毒效果；而泛革素和桿菌霉素L的完全抑制作用需要50 μg/mL的濃度。隨著抗菌肽濃度的遞增，其抗病毒效果也越好，這一結果與Han等的研究結果［32］一致。在4種抗菌肽中，羅克霉素表現出最好的抗病毒效果，表面活性素次之，而泛革素和桿菌霉素L的效果相對較弱。

綜上所述，筆者所在實驗室從枯草芽孢桿菌 Bs 916 中提取的4種抗菌肽（表面活性素、羅克霉素、泛革素和桿菌霉素L），濃度范圍在5～50 μg/mL內，能夠有效抑制豬δ冠狀病毒在細胞中的增殖，同時不會引發細胞毒性。其中，羅克霉素表現出最好的抗病毒效果，其次是表面活性素，泛革素和桿菌霉素L也具有一定的抗病毒活性。這一結論為尋找有效的PDCoV治療方法提供了新思路和理論支持。此外，根據文獻報道，抗菌肽除了具有抗菌作用外，還可能在免疫調節、組織修復和細胞凋亡等方面發揮重要作用。因此，這些抗菌肽具有廣闊的應用前景，可被開發成為治療PDCoV感染或其他病原微生物感染的新型藥物。未來的研究可進一步挖掘這些抗菌肽的分子機制，深入了解其在宿主免疫調節中的作用以及其對其他病原體的殺滅作用，為新藥物的開發提供更多的理論基礎和實踐指導。

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