小尾寒羊GHR和GHRHR基因多態性與生長性狀的關聯分析

摘要：為了解小尾寒羊的生長和發育的遺傳機制，為小尾寒羊的品種選育做基礎，本研究對GHR和GHRHR基因的多態性進行檢測，并將其多態性與生長性狀進行了關聯分析。試驗利用PCR-SSCP技術，檢測GHR和GHRHR基因在小尾寒羊群體的多態性，利用SPSS軟件分析GHRH基因的多態性與生長性狀之間的關聯性。結果表明，在小尾寒羊群體中檢測到3種GHR和GHRHR基因基因型，即DD、II、ID，GHR基因和GHRHR基因中II的基因型頻率分別為0.625 0、0.687 5，ID的基因型頻率分別為0.3 130、0.2 500，DD的基因型頻率為0.0 630、0.0 625。GHR基因個體中DD基因型個體和ID基因型個體在宰后胴體質量、臀端高、尻長、頸長、胸深這5個性狀中均表現出顯著差異（Plt;0.05）；DD基因型個體和Ⅱ基因型個體在宰前活體質量、宰后胴體質量、臀端高、尻長、頸長這5個性狀中均表現出顯著差異（Plt;0.05）。GHRHR基因中，DD基因型個體和ID基因型個體在宰前活體質量、宰后胴體質量、體高、體長、尻高、頸長、腰角寬、腿臀圍這8個性狀中均表現出顯著差異（Plt;0.05）；ID基因型個體與II基因型個體在頸長和羊的宰前活體質量這2個性狀中表現出顯著差異（Plt;0.05）；同樣DD基因型個體同II基因型個體在尻高、腿臀圍這2個性狀中均表現出顯著差異（Plt;0.05）。結果證明，GHR和GHRHR基因與小尾寒羊生長發育的相關性，可作為本土小尾寒羊遺傳雜交改良的重要功能候選基因。本研究為進一步研究小尾寒羊的遺傳特性試驗提供了理論依據，對于研究小尾寒羊的遺傳多樣性改良和培育優良小尾寒羊品種具有重要意義。

關鍵詞：小尾寒羊；GHRHR基因；GHR基因；PCR；關聯分析；生長性狀

中圖分類號：S826.2" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0187-06

收稿日期：2023-05-03

基金項目：國家自然科學基金（編號：31201777）；橫向課題（編號：橫20220047）。

作者簡介：何豫涵（2000—），男，河南周口人，碩士研究生，研究方向為動物分子育種。E-mail：heyuhan0609@163.com。

通信作者：白俊艷，博士，教授，主要從事動物分子育種研究，E-mail：junyanbai@163.com；王玉琴，博士，教授，主要從事動物分子育種研究，E-mail：wangyq6836@163.com。

生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）基因和生長激素釋放激素受體（growth hormone releasing hormone receptor，GHRHR）基因廣泛存在于各種哺乳動物中。它們均被認為是影響動物生長發育的重要基因。動物的生長和發育是由許多信號傳導途徑上的調控因子相互協同來執行的，動物體內幾乎所有的激素均直接或間接地參與機體生長的調節，其中，最為關鍵的是下丘腦-垂體-肌肉生長軸［1］。生長激素（growth hormone，GH）是由腦垂體前葉合成和分泌的蛋白質類激素，而GH發揮調控動物機體作用首先必須與靶細胞表面的生長激素受體結合。由GHR介導將信號傳遞到細胞內從而產生一系列的生理反應。GHRHR響應生長激素釋放激素結合，導致儲存在分泌顆粒中的生長激素釋放，刺激生長激素細胞中生長激素的產生［2］。因此，組織中GHR基因和GHRHR基因堿基序列的突變均可能影響GH生理效應的正常發揮，導致動物生長發育模式的變異，從而影響細胞的代謝活動，最終影響動物的生產性能［3］。GHR在GH發揮生理作用的過程中有著至關重要的作用，對GH在細胞內的表達量有重要的影響，因此在動物機體的新陳代謝、生長發育和機體免疫等方面均具有極為重要的作用［4］。

InDel（insertion-deletion）標記是指在等位基因位點上一定數量的核苷酸插入或缺失一段相對短的核苷酸序列而產生的長度多態性變異。InDel具有分布廣泛、密度大、突變率低等優點，并且易于分型，與復雜的SNP分型系統相比，InDel分型簡單快捷，利用PCR及電泳平臺即可方便簡潔地進行。這使InDel成為了優秀的新一代分子標記，為家畜育種工作提供了新方法［5］。它作為分子標記的一種，可以較容易地通過生物信息學的方法獲得。本試驗選擇InDel標記探究GHRHR基因和GHR基因對小尾寒羊生長發育的影響。當前世界對于生長激素受體相關基因的研究并不算少：北京油雞的GHRHR基因的單核苷酸多態性（SNP）g.-1654Agt;G對于不同周齡雞體質量、初產蛋日齡及產蛋數均有顯著影響［6］；GHR基因核苷酸多態性對澤西牛繁殖、生產和產犢健康有影響，在GHR-F279Y位點上酪氨酸編碼A突變取代苯丙氨酸編碼T等位基因，會導致乳、脂肪和蛋白質產量下降等［7］。以上研究證明了GHRHR基因和GHR基因對動物個體生長發育的重要影響。但對于綿羊的GHRHR和GHR基因的研究相對較少，所以本研究探討綿羊品種小尾寒羊GHR和GHRHR基因的多態性及其與生產性狀之間的相關關系，可為優良綿羊品種的培育選育提供良好的數據支持，可根據需要以此來培育出可適應我國不同地區、不同氣候及不同飼養方式需求的優良品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的實驗動物是2022年3月，采自遼寧省沙地治理與利用研究所阜瑤牧業公司阜新市種羊場養殖的小尾寒羊（n=32），所有羊只均在相同環境下飼養。對頸靜脈采集的10 mL小尾寒羊血液樣本用自配4%枸櫞酸鈉抗凝劑（ACD）處理并置于冰盒中（血液與ACD的體積比為5 ∶1），-20 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長性狀指標測定

利用常規方法對小尾寒羊的生長性狀指標進行測定，測定的指標包括羊的宰前活體質量、宰后胴體質量、體高、體長、胸寬、胸圍、管圍、尻高、臀端高、前肢高、頭長、尻長、頸長、額寬、腰角寬、臀端寬、胸深、頭深、腹圍、腿臀圍、背高［8］。

1.2.2 基因組DNA提取

取出綿羊血樣解凍后，根據全血基因組DNA試劑盒（Thermo Scientific公司）說明書提取綿羊血液DNA，采用ND2000核酸濃度測定儀（Thermo Scientific公司）檢測DNA的濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。根據DNA樣品純度和濃度將DNA稀釋至100 ng/μL，分裝至EP管中，-20 ℃保存備用。

1.2.3 引物設計

引物設計參照Wu等的論文，由鄭州鼎國生物技術有限公司合成［9］，引物序列信息見表1。

1.2.4 PCR-SSCP技術

PCR-SSCP技術是一種用于檢測DNA序列變異的分子生物學方法。它通過PCR擴增目標DNA片段，然后將其經過單鏈構象多態性（SSCP）電泳分離，使得具有不同突變的序列在電泳中呈現出不同的遷移模式，從而實現對樣本DNA序列變異的檢測和分析。

1.2.5 PCR擴增與凝膠電泳

GHR和GHRHR基因的PCR擴增體系均為10.0 μL：PCR Master Mix（Thermo Scientific公司）5.0 μL，DNA樣品1.0 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ddH2O 2.4 μL。經過溫度梯度篩選得到：GHR基因最適的退火溫度為53.2 ℃，GHRHR基因最適的退火溫度為 68.5 ℃。分別使用其最適的退火溫度進行PCR擴增。

1.2.6 數據處理與分析

使用Microsoft Excel 2019軟件對小尾寒羊GHR和GHRHR基因的基因型頻率、等位基因頻率、χ2、P值等數據進行計算。使用SPSS 26.0軟件對小尾寒羊GHR和GHRHR基因多態性與生長性狀進行關聯分析。

2 結果與分析

2.1 小尾寒羊GHR和GHRHR基因的電泳結果

由圖1可知，在小尾寒羊群里檢測到GHR基因有3種基因型，分別為II、ID及DD。

由圖2可知，在小尾寒羊群里檢測到GHRHR基因存在3種基因型，分別為II、ID、DD。

2.2 群體遺傳參數

由表2可知，GHR基因中的II的基因型頻率最高，為0.625 0，DD基因型頻率最低，僅有0.063 0；等位基因I的頻率較高，D的頻率較低。GHRHR基因中DD基因型頻率最低，為0.062 5， ID基因型頻率為0.250 0，II基因型頻率最高，為0.687 5；等位基因D頻率較低，為0.187 5，等位基因I頻率較高，為0.812 5。小尾寒羊GHR基因和GHRHR基因均不偏離哈代—溫伯格平衡（Pgt;0.05）。

2.3 小尾寒羊GHR基因與生長性狀關聯分析

由表3可知，基因型DD小尾寒羊的宰前活體質量和宰后胴體質量顯著高于II基因型個體（Plt;0.05）。基因型DD小尾寒羊的宰后胴體質量顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05）。3種基因型的小尾寒羊的體高、體長、胸寬、胸圍及管圍差異均不顯著（Pgt;0.05）。基因型DD小尾寒羊的臀端高、頸長顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），基因型ID小尾寒羊的尻長顯著高于DD基因型個體（Plt;0.05）。基因型DD小尾寒羊的臀端高、頸長顯著高于II基因型個體（Plt;0.05）。基因型II小尾寒羊的尻長顯著高于DD基因型個體（Plt;0.05）。3種基因型的小尾寒羊的前肢高、頭長及額寬差異均不顯著（Pgt;0.05）。3種基因型小尾寒羊的腰角寬、臀端寬、頭深、腹圍及背高差異均不顯著（Pgt;0.05）。基因型ID小尾寒羊的胸深顯著高于DD基因型個體（Plt;0.05）。基因型DD和基因型II的小尾寒羊的胸深差異不顯著（Pgt;0.05），基因型ID和基因型II的小尾寒羊的胸深差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.4 GHRHR基因與小尾寒羊生長性狀的關聯分析

由表4可知，小尾寒羊的DD基因型個體宰前活體質量、宰后胴體質量、體高和體長這4個性狀中顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），而在胸寬、胸圍和管圍這3個性狀中均表現出差異不顯著（Pgt;0.05）。DD基因型個體與II基因型個體在羊的宰前活體質量、宰后胴體質量、體高、體長、胸寬、胸圍和管圍這7個性狀中均表現出差異不顯著（Pgt;0.05）。II基因型小尾寒羊的宰前活體質量顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），而在宰后胴體質量、體高、體長、胸寬、胸圍和管圍這6個性狀中均表現出差異不顯著（Pgt;0.05）。

小尾寒羊DD基因型個體的尻高和頸長顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），而這2種基因型個體臀端高、前肢高、頭長、尻長和額寬這5種性狀均表現出差異不顯著（Pgt;0.05）。II基因型個體的頸長顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），而尻高、前肢高、額寬、臀端高、頭長和尻長這6個性狀均表現出差異不顯著（Pgt;0.05）。DD基因型個體的尻高顯著高于II基因型個體（Plt;0.05），而這2種基因型個體臀端高、頭長、額寬、尻長、前肢高和頸長這6種性狀均表現出差異不顯著（Pgt;0.05）。小尾寒羊DD基因型個體的腿臀圍顯著高于ID基因型個體（Plt;0.05），小尾寒羊ID基因型個體的胸深顯著高于DD基因型個體（Plt;0.05），而這2種基因型個體在背高、臀端寬、頭深、腹圍和腰角寬5種性狀中均表現出差異不顯著（Pgt;0.05）。ID基因型個體與II基因型個體在背高、頭深、臀端高、腰角寬、腿臀圍、胸深和腹圍7個性狀中均表現出差異不顯著（Pgt;0.05）。DD基因型個體的腿臀圍顯著高于II基因型個體（Plt;0.05），而這2種基因型個體在臀端寬、頭深、背高、腹圍、胸深和腰角寬這6種性狀中均表現出差異不顯著（Pgt;0.05）。

3 討論

3.1 GHR基因是動物生長發育相關的重要功能候選基因

GHR基因最早是在1976年由Tsushima在兔的肝臟細胞的細胞膜上發現的。近年來，所以關于GHR基因的研究不斷豐富［10］。Gencheva等研究了位于生長激素基因受體基因單核苷酸多態性對107只斷奶加利福尼亞種兔35、70、90日齡生長期個體體質量的影響，發現各基因型之間存在差異，研究得出GHR基因可能是加利福尼亞兔提高生長性能的有用候選基因［11］。Cobanoglu等研究了生長激素受體基因第10外顯子特定單核苷酸多態性（SNP）區域對土耳其飼養的澤西和荷斯坦奶牛產奶性狀的影響，發現GHR基因可能是標記輔助選擇方案的潛在候選基因，以改善土耳其奶牛群體的牛奶性能和相關性狀［12］。鄭嘉輝等對GHR基因的突變情況進行了研究，結果表明突變后的GHR基因會影響蘆花雞脛長、體質量發育［13］。Sahu等將印度綿羊的GHR基因第10個外顯子SNP位點與生長性狀進行了相關分析，發現GHR基因對馬德拉斯紅羊出生、6個月和9個月的體質量有顯著影響［14］。Akhatayeva等分析表明，GHR基因與公羊、母羊的生長性狀顯著相關，包括體質量、身高、胸深、胸圍、胸圍、大炮圍、腹圍和臀圍這幾種生長性狀［15］。本研究發現，GHR基因與小尾寒羊的宰后胴體質量、臀端高、尻長、頸長、胸深這5個性狀上存在顯著關聯性，其中，DD基因型個體在宰后胴體質量、臀端高、頸長等性狀上高于ID、II基因型個體，說明I→D的轉換在促進小尾寒羊生長發育方面有重要影響作用。與Gencheva等的研究結果［11-14］一致。

3.2 GHRHR基因是動物生長發育相關的重要功能候選基因

GHRHR基因在細胞增殖、生長激素合成與分泌等方面發揮重要作用，目前關于該基因影響生長發育的研究日趨增多。Johansson等研究表明，GHRHR基因可能是至今為止所發現的影響人類身高正常變異的最重要基因之一，GHRHR基因突變的患者會表現出明顯的矮小癥［16］。劉艷麗等將奶山羊GHRHR基因變異與其生長性狀進行關聯分析，研究發現GHRHR基因P3位點基因型與關中奶山羊的體長、體高和胸圍存在顯著性關聯；而在西農薩能奶山羊群體中，GHRHR基因多態性顯著影響個體的體高和體長生長性狀，這些結果表明GHRHR基因是影響奶山羊生長性狀的候選基因［17］。Liu等對北京油雞GHRHR基因多態性的研究結果表明，GHRHR基因多態性對7、9、11、13、17周齡雞體質量和32、36、40周齡雞開產日齡及產蛋數有顯著影響，GHRHR基因啟動子區的3個SNP位點可作為潛在的遺傳標記用于改善雞的生長和繁殖性狀［6］。Zhao等的研究結果表明，GHRHR基因的6個SNPs顯著影響中國大別山黃牛體高、臀高、胸圍、臀寬等體型性狀，因此GHRHR基因可作為大別山黃牛育種的分子標記［18］。Wu等研究發現，GHRHR基因多態性顯著影響蘭州大尾羊群體的體質量，即GHRHR的1個分子標記可用于肉羊生長相關性狀的標記輔助選擇［9］。上述研究均表明，GHRHR基因可能對于動物的生長發育有著重要的影響。本研究發現，GHRHR基因的不同基因型個體在宰前活體質量、宰后胴體質量、體高、體長、尻高、頸長、腰角寬、腿臀圍等生長性狀中均表現出顯著差異，試驗結果驗證了GHRHR基因的多態性可影響小尾寒羊的生長發育性狀。

4 結論

GHRHR基因和GHR基因的不同基因型小尾寒羊的生長性狀存在顯著差異。GHR基因與小尾寒羊的宰后胴體質量、臀端高、尻長、頸長、胸深這5個性狀上存在顯著關聯性，其中，DD基因型個體在宰后胴體質量、臀端高、頸長等性狀上高于ID、II基因型個體。GHRHR基因的不同基因型個體在宰前活體質量、宰后胴體質量、體高、體長、尻高、頸長、腰角寬、腿臀圍等生長性狀中均表現出顯著差異。GHR和GHRHR基因與小尾寒羊生長發育具有相關性，可作為本土小尾寒羊遺傳雜交改良的重要功能候選基因。

參考文獻：

［1］楊樹猛，卡召加，王蘭英，等. 甘南歐拉羊GHR基因第10外顯子SSCP多態性與生長性狀關聯研究［J］. 中國草食動物科學，2015，35（1）：1-4.

［2］Dettori M L，Pazzola M，Paschino P，et al. Association between the GHR，GHRHR，and IGF1 gene polymorphisms and milk yield and quality traits in Sarda sheep［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（11）：9978-9986.

［3］馬 曉，胡 毅，熊 鋼，等. 生長激素受體及其基因研究進展［J］. 湖南農業大學學報（自然科學版），2010，36（增刊1）：58-62.

［4］唐賢飛. GH和GHR基因對貴州地方黃牛生長性能的影響［J］. 畜禽業，2021，32（9）：47，49.

［5］楊 潔，赫 佳，王丹碧，等. InDel標記的研究和應用進展［J］. 生物多樣性，2016，24（2）：237-243.

［6］Liu W，Yu Y，Li G，et al. Single-nucleotide polymorphisms in the promoter of the growth hormone-releasing hormone receptor gene are associated with growth and reproduction traits in chickens［J］. Animal Genetics，2012，43（5）：564-569.

［7］Komisarek J，Michalak A，Walendowska A. The effects of polymorphisms in DGAT1，GH and GHR genes on reproduction and production traits in Jersey cows［J］. Animal Science Papers and Reports，2011，29 （1）：29-36.

［8］He L B，Kang Z H，Kang Y X，et al. Goat CMTM2：mRNA expression profiles of different alternative spliced variants and associations analyses with growth traits［J］. 3 Biotech，2020，10（3）：1-10.

［9］Wu M L，Zhao H D，Tang X Q，et al. Novel InDels of GHR，GHRH，GHRHR and their association with growth traits in seven Chinese sheep breeds［J］. Animals，2020，10（10）：1883.

［10］Tsushima T. Technics of growth hormone receptor assay［J］. Nippon Rinsho，1976，34（3）：461-465.

［11］Gencheva D G，Velikov K P，Veleva P M. Association analysis of nucleotide polymorphisms in growth hormone （GH） and its receptor （GHR） with body weight in Californian rabbits［J］. World Rabbit Science，2022，30（1）：95-102.

［12］Cobanoglu O，Kul E，Gurcan E K，et al. Determination of the association of GHR/AluI gene polymorphisms with milk yield traits in Holstein and Jersey cattle raised in Turkey［J］. Archives Animal Breeding，2021，64（2）：417-424.

［13］鄭嘉輝，冷奇穎，張為露，等. 矮小體型蘆花雞GHR基因突變類型分析及其與正常體型蘆花雞發育差異研究［J］. 農業生物技術學報，2021，29（10）：1978-1989.

［14］Sahu A R，Eichitra V J，Rajendran R，et al. Association analysis of novel SNPs in exon 10 of the growth hormone receptor gene with growth traits in Indian sheep［J］. Veterinarski Arhiv，2020，90（6）：593-602.

［15］Akhatayeva Z，Li H X，Mao C，et al. Detecting novel Indel variants within the GHR gene and their associations with growth traits in Luxi Blackhead sheep［J］. Animal Biotechnology，2022，33（2）：214-222.

［16］Johansson A，Jonasson I，Gyllensten U. Extended haplotypes in the growth hormone releasing hormone receptor gene （GHRHR） are associated with normal variation in height［J］. PLoS One，2009，4（2）：e4464.

［17］雷初朝，藍賢勇，等. 2個奶山羊品種GHRHR基因多態性及其與生長發育性狀關系研究［C］//中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學術討論會論文集. 楊凌：中國畜牧獸醫學會，2009：401.

［18］Zhao S P，Jin H，Xu L，et al. Polymorphisms of the growth hormone releasing hormone receptor gene affect body conformation traits in Chinese Dabieshan cattle［J］. Animals，2022，12（13）：1601.