鵝星狀病毒capsid蛋白對細胞因子的影響

摘要：為了解鵝星狀病毒（GAstV）capsid蛋白對細胞因子的影響，試驗將構(gòu)建的pCMV-capsid真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，并于轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，提取核酸檢測細胞內(nèi)CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α、IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，capsid蛋白于12、36 h顯著抑制CCL2轉(zhuǎn)錄，12 h顯著促進CCL5表達，24 h顯著抑制CCL5表達；capsid蛋白于24、36 h顯著促進IL-1β的轉(zhuǎn)錄；capsid蛋白于24、36 h顯著抑制IFN-α的轉(zhuǎn)錄；capsid蛋白于36 h顯著促進TNF-α的轉(zhuǎn)錄；capsid蛋白于24 h顯著抑制IFITM1的轉(zhuǎn)錄，于36 h顯著促進IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明，GAstV capsid蛋白過表達能夠誘導IL-1β、TNF-α和IFITM的轉(zhuǎn)錄，抑制CCL2和IFN-α的轉(zhuǎn)錄；對于CCL5，capsid蛋白早期促進CCL5的轉(zhuǎn)錄，后期抑制CCL5的轉(zhuǎn)錄；對于IFITM1，capsid蛋白早期抑制IFITM1轉(zhuǎn)錄，后期促進IFITM1轉(zhuǎn)錄。

關(guān)鍵詞：鵝星狀病毒；細胞因子；轉(zhuǎn)錄；RdRp蛋白

中圖分類號：S852.65+7" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）04-0193-04

收稿日期：2023-04-21

基金項目：信陽農(nóng)林學院青年教師基金（編號：QN2021010）；河南省重點研發(fā)與推廣專項（科技攻關(guān)）（編號：232102111043）；河南省高等學校青年骨干教師培養(yǎng)計劃；信陽農(nóng)林學院家禽重大疫病防控科技創(chuàng)新團隊資助項目（編號：2022CXTD06）。

作者簡介：饒 丹（1988—），女，江西南昌人，碩士，講師，從事動物病毒學研究。E-mail：raodan2007@126.com。

通信作者：董建國，博士，副教授，從事動物病毒學研究。E-mail：dongjianguo213@163.com。

近幾年，由鵝星狀病毒（GAstV）引起的鵝痛風癥狀較為常見。該病毒主要侵害雛鵝，鵝感染后臨床癥狀表現(xiàn)出動作緩慢、頻繁縮頸、糞便發(fā)白并外有尿酸鹽包裹。在痛風發(fā)病早期，患病雛鵝精神沉郁、食欲不振、體溫升高，經(jīng)常臥地不起，行走不穩(wěn)；在痛風發(fā)病中期，患病雛鵝出現(xiàn)輕度跛行，雙腿肘部紅腫，采食量大幅度下降［1］。剖檢雛鵝臟器有白色尿酸鹽沉積，呈大理石樣外觀，腎臟最為明顯［2］。

GAstV基因組全長7 175 bp，共有3個開放閱讀框：ORF1a、ORF1b和ORF2。其中，ORF1a（3 255 bp）編碼多聚蛋白，ORF1b編碼RdRp蛋白，ORF2編碼capsid蛋白［3］。為研制有效的疫苗進行鵝痛風的防控，Sellers等表達了雞星狀病毒的capsid蛋白，雞群免疫后產(chǎn)生高水平的抗體［4］。榮雪路等采用制備的重組GAstV capsid蛋白免疫鵝，能夠100%保護鵝免受病毒攻擊［5］。這些結(jié)果表明，capsid蛋白具有重要免疫原性，在抵抗疫病入侵中發(fā)揮重要作用。而目前針對GAstV capsid蛋白參與免疫調(diào)控的研究較少。有研究表明，哺乳動物急性痛風炎性反應發(fā)生過程中，細胞因子發(fā)揮重要作用［6］。為探索capsid蛋白在免疫調(diào)控中的作用，本研究初步探討GAstV capsid蛋白對細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和質(zhì)粒

293細胞由信陽農(nóng)林學院動物科技學院免疫病理實驗室凍存；表達GAstV capsid蛋白的真核質(zhì)粒pCMV-capsid由信陽農(nóng)林學院動物科技學院免疫病理實驗室構(gòu)建保存，本試驗于2022年12月在信陽農(nóng)林學院動物科技學院免疫病理實驗室進行。

1.2 試劑

核酸提取試劑DNA/RNA Extraction Kit FT（Prepackaged）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（1st Strand cDNA Synthesis Kit，+gDNA wiper）、熒光定量試劑AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed），購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細胞因子CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α、IFNα和抗病毒蛋白IFITM基因定量檢測引物，由金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 細胞培養(yǎng)

從液氮中復蘇293細胞，于5% CO2培養(yǎng)箱和含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并鋪入12孔板中，待細胞密度達90%時進行轉(zhuǎn)染。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

每孔細胞，使用50 μL無血清培養(yǎng)基稀釋 0.6 μg 真核質(zhì)粒pCMV-capsid-HA。同時，1.2 μL Lipofectamine 2000試劑加入50 μL無血清培養(yǎng)基。隨后將兩者混合，室溫靜置20 min，隨后將混合物加入細胞培養(yǎng)孔中，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、 36 h 收集細胞，于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 核酸的提取

使用FastPure Cell Total RNA Isolation Kit 提取細胞中總RNA，具體操作如下：將細胞加入Buffer RL，漩渦振蕩，轉(zhuǎn)移到收集管中，至無明顯細胞團，12 000 r/min離心2 min。收集上清液，加入Buffer RL2（已加入無水乙醇），輕柔混勻，轉(zhuǎn)移至RNA Pure Columns中（RNAPure Columns已放入收集管中），12 000 r/min離心1 min，棄廢液。將剩余的液體全部加入吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，棄廢液，重復1次。向RNA Pure Columns中加入Buffer RW2（已加入無水乙醇），12 000 r/min離心 1 min，棄廢液，12 000 r/min離心2 min。向吸附柱中央部位懸空滴加100 μL的RNase-free ddH2O。室溫放置2 min，12 000 r/min離心1 min洗脫RNA。提取的RNA放于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細胞因子檢測

將提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系如下：5×gDNA wiper Mix 2 μL，RNA 8 μL，5×RT Mix 2 μL，HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL，Random hexamers" 1 μL，RNase-free ddH2O 5 μL。反應程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。隨后采用染料法對細胞中的CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α和IFITM的轉(zhuǎn)錄水平進行定量檢測。定量檢測引物如下：CCL2F：5′-GCCTCCAGCATGAAAGTCTC-3′，CCL2R：5′-AGGTGACTGGGGCATTGAT-3′；CCL5F：5′-CTGCCTCCCCATATTCCTCG-3′，CCL5R：5′-CACACTTGGCGGTTCTTTCG-3′；IL-1βF：5′-AGGCACAAGGCACAACAGGCT-3′，IL-1βR：5′-AACAACTGACGCGGCCTGCC-3′；TNF-αF：5′-CCCTCTGGCCCAGGCAGTCA-3′，TNF-αR：5′-ATGGGTGGAGGGGCAGCCTT-3′；IFITM1F：5′-TCAGGTCAAGGATAGTCTGGAG-3′，IFITM1R：5′-AGGTTGTGTATTCCCACACTGTA-3′，IFITM2F：5′-GGAGGGAGAAAACTCCTTGGA-3′，IFITM2R：5′-GGCCAGTAGGTTGCACATTGT-3′。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAstV capsid蛋白影響趨化因子轉(zhuǎn)錄

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid-HA真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中CCL2和CCL5的轉(zhuǎn)錄水平。由圖1可知，capsid蛋白于12、36 h顯著抑制CCL2轉(zhuǎn)錄，12 h顯著促進CCL5表達，24 h顯著抑制CCL5表達。

2.2 GAstV capsid蛋白促進IL-1β的轉(zhuǎn)錄

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平，由圖2可知，capsid蛋白于24、36 h顯著促進IL-1β的轉(zhuǎn)錄。

2.3 GAstV capsid蛋白抑制IFN-α的轉(zhuǎn)錄

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IFN-α的轉(zhuǎn)錄水平。由圖3可知，capsid蛋白于24、36 h顯著抑制IFN-α的轉(zhuǎn)錄。

2.4 GAstV capsid蛋白對TNF-α轉(zhuǎn)錄的影響

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IFN-α的轉(zhuǎn)錄水平，由圖4可知，capsid蛋白于36 h顯著促進 TNF- α的轉(zhuǎn)錄。

2.5 GAstV capsid蛋白對IFITM轉(zhuǎn)錄的影響

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-capsid真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄水平，由圖5可知，capsid蛋白于24 h顯著抑制IFITM1的轉(zhuǎn)錄，于36 h顯著促進IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄。

3 討論與結(jié)論

近幾年，鵝痛風在我國江蘇、安徽、山東、廣東等養(yǎng)鵝地區(qū)頻繁發(fā)生，發(fā)病率高達80%，致使50%的病鵝死亡，嚴重影響鵝產(chǎn)業(yè)［7-8］。痛風主要引起鵝各個內(nèi)臟器官表面尿酸鹽沉積，病毒有廣泛組織嗜性，主要侵害腎臟［2］。

在痛風發(fā)生過程中，炎癥反應發(fā)揮重要作用。病毒感染宿主后，往往通過自身蛋白調(diào)節(jié)細胞因子的表達，促進自身增殖。趨化因子是白細胞（包括：單核細胞、T細胞和自然殺傷細胞）的趨化劑。人巨細胞病毒感染誘導人胚胎肺成纖維細胞中CCL2 mRNA的表達水平，同時誘導CCL2的特異性配體CCR2的表達水平，干擾CCL2表達，抑制病毒復制［9］。艾滋病病毒Nef蛋白誘導CCL2的表達，有利于病毒入侵腦，導致神經(jīng)元功能障礙［10］。CCL2能夠降低IFN-α的表達，并通過上調(diào)表面C-X-C基序趨化因子受體4的表達促進艾滋病病毒的復制［11］。CCL5通過上調(diào)SAMHD1水平抑制甲型流感病毒的復制［12］。本研究顯示，GAstV capsid蛋白過表達能夠抑制CCL2的表達，而對于CCL5，capsid蛋白過表達后早期抑制CCL5表達，后期促進CCL5表達。同時，GAstV capsid蛋白過表達能夠降低 IFN-α，后期促進抗病毒蛋白IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄。趨化因子在病毒廣泛擴散中發(fā)揮重要作用，而IFN和抗病毒蛋白具有重要的抗病毒特性。這些因子的改變是否會導致GAstV的廣泛組織嗜性，利于病毒增殖，有待于進一步研究。

研究顯示，許多病毒感染會導致炎癥反應劇烈發(fā)生，進而影響病毒自身增殖。流感病毒H1N1感染后，促進人類單核細胞中IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平［13］。登革病毒通過誘導TNF-α分泌降低IRS-1，參與胰島素抵抗作用［14］。犬流感病毒感染巨噬細胞后，誘導TNF-α的分泌和細胞死亡［15］。豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染巨噬細胞后誘導 TNF-α 的分泌，進而抑制豬瘟病毒的復制，致使臨床上出現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征感染導致豬瘟疫苗免疫失敗［16］。貓傳染性腹膜炎病毒感染巨噬細胞，誘導TNF-α的分泌，上調(diào)Ⅱ型貓傳染性腹膜炎病毒受體貓氨基肽酶N在貓巨噬細胞中的表達，利于病毒感染［17］。新型冠狀病毒感染會強烈、快速地刺激先天免疫反應，激活炎性小體，釋放IL-1β，導致過度的炎癥反應和肺部的損傷［18-19］。在尿酸鹽形成過程中，尿酸鹽結(jié)晶與巨噬細胞相互作用，導致NLRP3激活，進而活化 Caspase1，產(chǎn)生成熟的IL-1β，導致機體出現(xiàn)急性炎癥反應［20］。對感染GAstV雛鵝的腎臟中炎性因子的表達水平進行研究，結(jié)果顯示腎臟中IL-1β和 TNF-α 的表達水平顯著升高，導致雛鵝腎臟出現(xiàn)嚴重的炎性損傷［21］。本研究結(jié)果顯示，GAstV capsid蛋白顯著誘導IL-1β和TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果表明GAstV capsid蛋白可能通過誘導IL-1β和TNF-α，進而導致腎臟的損傷和尿酸鹽沉積，具體機制有待進一步深入研究。

綜述所述，本研究顯示GAstV capsid蛋白過表達能夠誘導CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α和IFITM的轉(zhuǎn)錄，抑制IFN-α的轉(zhuǎn)錄。

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