基于轉錄組的3種纈草SSR位點信息比較分析

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.05.004

收稿日期：2023-11-10

基金項目：貴州省科技計劃項目；貴州省農業農村廳項目（GZCYTX2023-0302）

作者簡介：王" 鑫（1992-），男，貴州遵義人，碩士研究生，助理研究員，主要研究方向為分子生物學。（E-mail）1120375576@qq.com

通訊作者：余" 波，（Tel）15085916661，（E-mail）yubonky@163.com

摘要：" 為研究3種纈草SSR分子標記的差異，開發相應的引物用于纈草的鑒定及分子育種。本研究采用Excel和MISA軟件對3種纈草轉錄組中SSR位點數據進行分析，利用Primer 3.0軟件隨機設計SSR引物，并進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳驗證引物的有效性和SSR的多態性。結果顯示，纈草Valeriana officinalis L.（VOL）、Valeriana officinalis var. iatifolia Miq.（VOI）及Valeriana officinalis var. officinalis Linn.（VOO）的轉錄組數據分別包含29 462、40 840和29 280個序列總數（Unigene），這些Unigene分別包含7 515、8 046和7 330個SSR位點。3種纈草的SSR位點的發生頻率為25.50%、19.71%、25.05%，平均距離為4.16 kb、4.20 kb、4.22 kb。SSR單堿基重復基元的主要類型為A/T型，占SSR總數的41.76%、41.30%、38.50%。VOL、VOI、VOO 3種纈草的獨有重復基元數量分別是44種、45種、25種。隨機設計的引物擴增SSR的有效率為77.78%，具有SSR高多態性的引物占比55.56%。總之，3種纈草的SSR位點具有分布密度高、出現頻率高、重復基元類型多等特點，多態性好，可為3種纈草后續的鑒定及分子育種提供理論依據。

關鍵詞：" 纈草；SSR位點；轉錄組；PCR

中圖分類號：" S562""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）05-0796-10

Comparative analysis of SSR loci information of three Valeriana officinalis L. species based on transcriptome

WANG Xin1，" WU Junda1，" JIANG Lingling1，" ZHOU Jingrui1，" LYU Zhongyun2，" LUO Wenju1，" AI Rong1，" SHU Fuxing2，" XU Haoxiang1，" RAN Jiang1，" LEI Lu1，" ZHONG Xuezhi3，" YU Bo1

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550000， China;2.Zunyi Medical University， Zunyi 563000， China;3.Guizhou Yuntai Xianmu Fine Fruits Co.， Ltd.， Qiandongnan 556200， China）

Abstract：" To study the differences in SSR molecular markers of three Valeriana officinalis L. species， the corresponding primers were developed for the identification and molecular breeding of Valeriana officinalis L. species. In this study， Excel and MISA software were used to analyze the SSR loci data in the transcriptome of three Valeriana officinalis L. species. Primer 3.0 software was used to randomly design SSR primers， and PCR amplification and agarose gel electrophoresis were performed to verify the effectiveness of the primers and the polymorphism of SSR. The results showed that the transcriptome data of Valeriana officinalis L. （VOL）， Valeriana officinalis var. iatifolia Miq. （VOI）， and Valeriana officinalis var. officinalis Linn. （VOO） contained 29 462， 40 840， and 29 280 Unigenes. These Unigenes included 7 515， 8 046， and 7 330 SSR loci， respectively. The occurrence frequency of SSR loci in the three Valeriana officinalis L. species was 25.50%， 19.71%， and 25.05%， with average distance of 4.16 kb， 4.20 kb， and 4.22 kb. The predominant type of single-nucleotide repeat units in SSR was A/T， accounting for 41.76%， 41.30%， 38.50% of the total SSR. The number of unique repeat units of VOL， VOI， VOO was 44， 45 and 25， respectively. The effective rate of SSR amplification by randomly designed primers was 77.78%， and the proportion of highly polymorphic SSR primers was 55.56%. In conclusion， the SSR loci of three Valeriana officinalis L.species exhibited characteristics such as high distribution density， high occurrence frequency， and diverse types of repeat units， indicating good polymorphism. The results of this study can provide a theoretical basis for the subsequent identification and molecular breeding of the three Valeriana officinalis L. species.

Key words：" Valeriana officinalis L.；SSR loci；transcriptome；PCR

纈草（Valeriana officinalis L.）具有悠久的藥用歷史，主要藥用部位為根莖，具有理氣止痛、鎮靜安神、解攣止痛、抗抑郁和抗腫瘤等功效。纈草的用途廣泛，例如其揮發油可用于藥品和保健品中。纈草作為天然藥物在歐洲銷售額很高，并且居全球植物藥銷售額前10。 中國纈草資源豐富，共有17個種和2個變種，貴州省以寬葉纈草（VOV）分布最廣。隨著市場對寬葉纈草需求的增加，纈草優良種子種苗的需求也日益增長。然而，纈草的品種會出現退化，導致藥材質量下降等問題。不同種類的纈草功效各具特色，因此，開發分子標記可以為纈草優良品種的選育提供理論和技術支撐。相關學者已經意識到開發纈草分子標記的重要性。錢志瑤等采用試劑盒研究了纈草的擴增多態性（RAPD）方法，然而，這種方法存在一些缺點：首先，由于顯性遮蓋作用，RAPD位點之間的遺傳距離計算準確性較低；其次，RAPD方法對反應條件相當敏感，如模板濃度和酶濃度，導致重復性較差。萬新利用ITS研究了6種纈草屬的遺傳多樣性，盡管ITS具有高度保守性，但大量研究結果表明ITS在區分近似物種方面效果不佳。

簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）是一種在非基因區域頻繁出現的串聯重復序列，一般由1～6個堿基組成；在真核和原核生物基因組中分布廣泛。SSR標記區分物種的能力高于RAPD標記和ITS標記。在許多作物中，QTL數量性狀位點作圖的首選方法一直是SSR方法。目前，基因組 和轉錄組 是大量SSR位點信息的主要來源。最初，傳統SSR開發過程繁瑣且失敗率高，造成成本和工作量的增加。EST-SSR是基于轉錄組表達序列信息分析而來，極大地簡化了傳統SSR的開發程序。雖然已經有關于寬葉纈草轉錄組的報道，但NCBI等數據庫中可查閱的纈草的EST序列非常有限，基于轉錄組的SSR位點信息尚未見報道。通常，為了能夠檢驗EST-SSR的有效性，常常會設計隨機引物進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳驗證，并開發出具有高多態性的引物為后續植株鑒定或者分子育種提供基礎。

本研究旨在對3種纈草進行SSR分析，并設計引物進行凝膠電泳驗證，以便從分子水平上區分這3個變種并輔助纈草的分子育種。

1" 材料與方法

1.1" 材料

3種纈草變種來自中國貴州省銅仁市江口縣黃柏山村（海拔337 m，東經105°51′15″，北緯28°32′13″），3種纈草變種在同樣環境的種植基地種植，生長旺盛，無病蟲害發生，經過貴州大學植物物種鑒定中心鑒定，3種供試纈草為不同的變種，分別為：Valeriana officinalis L.（VOL）、Valeriana officinalis var. iatifolia Miq.（VOI）及Valeriana officinalis var. officinalis Linn. （VOO）。

1.2" 方法

對3種纈草的葉長、葉寬、株高進行測量，每組重復3次。對3種纈草葉片拍照進行外觀差異比較。采集纈草新長出的葉子，每個樣本重復4次，立即將其放入液氮中冷凍，并在冷凍管中保存，樣品轉錄組由北京諾禾致源科技股份有限公司測序。之后，參考舒福興等的方法，聯合MISA在線網站（https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/）和Excel軟件對SSR位點進行分析。同時利用Primer 3.0軟件設計3種纈草的SSR隨機引物，并從每種纈草中隨機挑選3對引物進行后續SSR凝膠電泳分析，引物信息見表1。DNA的提取方法、PCR及瓊脂糖凝膠電泳方法參考忻雅等的方法。

1.3" 統計分析方法

使用Excel軟件和仙桃學術（https：//www.xiantaozi.com/）在線分析軟件繪制圖表，3種纈草的生物學性狀數據以平均數±標準差的形式表示。采用單因素方差分析比較不同組間的差異性。同時，利用Excel和MISA軟件對SSR重復單元的類型進行統計分析，利用韋恩圖對3種纈草獨有的SSR重復基元進行分析。

2" 結果與分析

2.1" 3種纈草的生物學性狀分析

從圖1A可見，3種纈草葉型外觀有明顯的區別。由圖1B所示，VOL、VOI、VOO的葉寬分別為6.47±0.06 cm、7.17±0.29 cm、6.73±0.64 cm，三者之間差異不顯著；VOL、VOI、VOO的葉長分別為10.57±0.51 cm、15.67±1.15 cm、9.57±0.97 cm，VOI與VOL、VOO之間差異顯著，VOL和VOO之間差異不顯著。VOL、VOI、VOO的株高分別為33.17±3.25 cm、43.17±0.76 cm、16.30±0.75 cm，VOL與VOO、VOI與VOO之間存在顯著差異。

2.2" 3種纈草轉錄組中SSR位點的分布特征

測序結果顯示，3種纈草轉錄組序列總長度從高到低順序為VOIgt;VOLgt;VOO，3種纈草總序列數量從高到底排序與序列總長度的排序一致。含有SSR的序列數從高到底的排序為VOIgt;VOOgt;VOL。VOI的各項數值均高于其他纈草變種（表2）。

2.3" 3種纈草轉錄組中SSR位點的重復基元類型及占比

從表3可見，3種纈草存在多種SSR重復基元類型，不同的基元類型在數量上有差異。其中，單堿基重復類型最多。在VOL、VOI、VOO中，分別有3 150個、3 336個、2 848個單堿基重復類型，分別占本變種SSR總量的41.92%、41.46%和38.85%。3種纈草中，VOI的單堿基重復類型最多，VOO最少。二堿基重復類型在各變種中數量居第2位，分別為2 413個、2 696個和 2 737個，分別占本變種SSR總數的32.11%、33.51 %和37.34%。VOO的二堿基重復類型數量和比例都超過VOL和VOI。三堿基重復類型在各變種中數量居第3位，分別為1 592個、1 678個和1 492個，占本變種SSR總數的21.18%、20.86%和20.35%。其他基元重復類型的比例較低，3個變種中剩余3種基元重復類型的總和分別占本變種SSR總數的4.79%、4.18%和3.47%。總體而言，基元中包含的堿基數越多，基元類型的數量就越少。從SSR的出現頻率來看，VOL、VOI、VOO分別為25.50%、19.71%及25.05%。其中，具有單堿基重復基元的出現頻率分別為10.69%、8.17%和9.73%；二堿基重復基元的出現頻率分別為8.19%、6.60%和9.35%；三堿基重復基元的出現頻率分別為5.40%、4.11% 和5.10%；其他類型重復基元出現頻率很低。整體上，3種纈草中的單堿基、二堿基和三堿基SSR是優勢類群，在各種纈草變種本身及纈草變種之間的出現頻率均不相同。VOL、VOI、VOO 的SSR平均距離分別為4.16 kb、4.20 kb和4.22 kb。總體上，隨著重復基元所含堿基數的增加，SSR的遺傳距離會變長。

2.4" 3種纈草轉錄組中SSR重復基元堿基組成分析

通過分析發現，在VOL的SSR重復基元中，共發現堿基組成類型145種。單堿基基元至六堿基基元的堿基組成類型分別有2種、4種、10種、24種、49種和56種。在VOI的SSR重復基元中，共有堿基組成類型139種。單堿基基元至六堿基基元的堿基組成類型分別有2種、4種、10種、20種、40種和63種。在VOO的SSR重復基元中，共發現堿基組成類型113種。單堿基基元至六堿基基元的堿基組成類型分別有2種、4種、10種、22種、26種和49種。

對3種纈草中排名前20的堿基組成類型占比分析發現，A/T、AT/AT、AC/GT、AAG/CTT入圍前4，其余類型占比較低（圖2）。3種纈草共有55種重復基元的堿基組成類型相同，而VOL、VOI、VOO各自獨有的重復基元的堿基組成類型分別為44種、45種、25種（圖3）。獨有重復基元的堿基組成類型詳見表4。

2.5" 3種纈草SSR多態性分析

2.5.1" 3種纈草SSR基元重復次數" 從表5可見，3種纈草中，不同堿基類型基元的數量和比例隨著SSR基元重復次數的增加而逐步下降。VOL的SSR重復基元的重復次數主要集中在5～20次，共7 149個，占總數的95.13%。其中，有4 979個重復基元的重復數為5～10次（低重復），占總數的66.25%；有1 752個重復基元的重復數為11～15次（中重復），占總數的23.31%；有418個重復基元的重復數為16～20次（高重復），占總數的5.56%。在所有基元類型中，重復次數排前三的依次是10次、6次和5次，分別含有1 265、1 222、1 074個基元，各占SSR重復基元總數的16.83%、16.26%、14.29%。VOI的SSR重復基元的重復次數主要集中在5～20次，共7 626個，占總數的94.78%。其中，低重復基元有5 345個，

占總數的66.43%；中重復基元有1 856個，占總數的23.08%；高重復基元有425個，占總數的5.28%。在所有類型中，重復次數排前三的依次是10次、6次和5次，分別含有1 412、1 313、1 145個基元，各占SSR重復基元總數的17.55%、16.32%、14.23%。VOO的SSR重復基元的重復次數主要集中在5～20次，共7 130個，占總數的97.27%。其中，低重復基元有5 136個，占總數的70.07%；中重復基元有1 655個，占總數的22.58%；高重復基元有339個，占總數的4.62%。在所有類型中，重復次數排前三分別是10次、6次和5次，分別含有1 429、1 309、920個基元，各占SSR重復基元總數的19.50%、17.86%、12.55%。

2.5.2" 纈草高多態性SSR分析" 從圖4可見，在VOL中，平均長度lt;12 bp的重復基元數量占總數的20.42%，12～20 bp的占53.45%，≥20 bp的占26.12%。在VOI中，平均長度lt;12 bp的重復基元數量占總數的20.32%，12～20 bp的占52.19%，≥20 bp的占27.49%。VOO中平均長度lt;12 bp的重復基元數量占總數的23.27%，12～20 bp的占52.75%，≥20 bp的占23.99%。3種纈草之間，符合高多態性SSR特征的比例從高到低排序為VOIgt;VOLgt;VOO。在VOL中，復雜混合型重復單元最長為306 bp，從單堿基基元到六堿基基元最長長度分別為66 bp、58 bp、81 bp、44 bp、40 bp和72 bp。在VOV中，重復單元最長的是復雜混合型，長度為244 bp，從單堿基基元到六堿基基元最長長度分別為76 bp、68 bp、63 bp、60 bp、45 bp和84 bp。VOO中，重復單元最長的是復雜混合型，長度為269 bp，從單堿基基元到六堿基基元最長長度分別為79 bp、62 bp、66 bp、76 bp、50 bp和78 bp。

2.6" 引物的篩選及SSR標記的多態性

從圖5可見，經過PCR擴增及凝膠電泳分析發現，本研究所設計的引物有效率為77.78%；具有高多態性的引物占比達55.56%。引物中除了VOI3、VOO2外，其余引物在3種纈草之間均擴增出大小不同的條帶。其中VOL1、VOL2、VOL3、VOI1和VOO3擴增出的SSR條帶多態性良好，能明確鑒定出3種纈草；而VOI2可以鑒定出VOO，但對VOI和VOL無法進行有效區分；VOO1能有效鑒定VOO與其他2種纈草的區別，但區分VOI與VOL的能力較差。

3" 討論

纈草中含有多種具有藥用價值的成分。例如：纈草作為治療胃腸道疾病和焦慮癥的中藥被收錄于《中國藥典》。對纈草SSR分子標記的研究及相關引物的開發對纈草雜交育種和混合樣品的鑒定等有較大的理論和應用價值。然而，關于纈草SSR的研究目前尚未見報道。盡管有許多研究SSR的方法，例如ISSR-PCR方法、磁珠富集法，但這些方法在挖掘數量和可用性上遠不如轉錄組法。利用轉錄組進行SSR位點分析已經在多種植物上得到應用，尤其是針對無基因組信息的植物，轉錄組法可以提供大量的標記信息。由此可見，有必要通過纈草轉錄組分析SSR位點。

從生物學性狀上看，3種纈草在葉型上存在很大的差異，由于其生境相同，排除地理隔離引起的差異，葉型差異可能是由于遺傳因素引起，那么其核酸水平可能存在差異。轉錄組序列分析結果顯示，VOL、VOI、VOO 3種纈草測得的序列長度分別為31 253 766 bp、33 795 128 bp、30 941 295 bp，對應29 462個、40 840個、29 280個序列總數，分別獲得7 515個、8 046個、7 330個SSR，出現頻率分別為25.50%、19.71%、25.05%。VOL和VOO的SSR出現頻率高于柴胡（20.08%）及雜花苜蓿（20.03%），低于大麻（33.10%）及睡蓮（33.98%），而VOI的SSR出現頻率均低于上述植物。VOL、VOI、VOO 3種纈草的轉錄組SSR分布的平均距離分別為4.16 kb、4.20 kb、4.22 kb，與其他植物相比，VOL、VOI、VOO轉錄組SSR分布的平均距離高于苜蓿、白及、南美蟛蜞菊，低于半夏、紅花。這可能與植物遺傳背景和轉錄狀態有關。同時，我們也發現3種纈草在SSR出現頻率上表現出差異性，VOL和VOO的差異不大，但是二者與VOI之間的差異較大。這說明纈草不同變種之間轉錄水平不同，因此有必要對其他纈草變種進行研究。總體來說，3種纈草的SSR種類和數量都比較豐富，可以為纈草育種提供依據。

3種纈草的SSR均以單堿基最多，這與南美蟛蜞菊、睡蓮、大麻一致，而柴胡的SSR以二堿基最多，這種差異可能來自種屬之間的差異。3種纈草中單堿基A/T型是最多的重復基元類型，與大多數植物的SSR優勢重復類型一致；二堿基、三堿基的優勢重復基元僅有輕微差異，而四堿基、五堿基、六堿基基元重復類型數量上三者之間出現非常大的差異，3種纈草獨有的重復基元全部集中在四堿基、五堿基、六堿基重復基元類型上。這說明具有這些重復基元的SSR具有區分3種纈草的分子標記的潛力，而這些SSR所在序列的表達可能是3種纈草生長發育或者代謝產物差異的重要基礎。

大量的研究結果表明， SSR重復基元長度＜12 bp，多態性極低。SSR重復基元重復的次數≥12次時，多態性標記的開發潛力隨著重復次數的增加逐漸增大。本研究中，VOL、VOI、VOO 3種纈草不同SSR重復基元重復次數主要集中在5～20次，所占比例分別為95.13%、94.78%、97.27%，重復基元長度≥20 bp的比例分別為26.12%、27.49%、23.99%。這表明3種纈草轉錄組SSR位點理論上具有較大開發潛力。本研究發現3種纈草之間存在獨有的SSR重復基元類型，這些類型對3種纈草的分子育種具有重要作用。但是根據之前在各個物種中利用轉錄組分析的SSR均采取了隨機引物驗證，本研究也通過隨機設計的引物及3種纈草DNA為模板進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳分析，發現引物有效率為77.78%，其中引物VOL1、VOL2、VOL3、VOI1和VOO3擴增出的SSR條帶多態性良好，能明確鑒定出3種纈草；而引物VOI2可以鑒定出VOO，但對VOI和VOL無法進行有效區分；引物VOO1能有效鑒定VOO與其他2種纈草的區別，但區分VOI和VOL的能力較差。在山東銀蓮花中引物有效率為68%，高多態性引物只占11%；在辣椒中引物有效率為93.10%，多態率為17.24%，本研究的引物高多態率（55.56%）比銀蓮花和辣椒高，引物有效率居中。可為后期纈草分子育種及鑒定等方面提供理論依據及具體引物。

4" 結論

3 種纈草的轉錄組中，SSR位點分布密度大、重復基元類型豐富、出現頻率高，本研究篩選出高多態性標記SSR隨機引物5對，可以為進一步研究纈草遺傳多樣性和分子標記輔助育種提供理論基礎及具體引物。

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（責任編輯：黃克玲）