廣藿香PcGA2ox1基因克隆、VIGS載體構建和表達分析

關鍵詞：廣藿香；赤霉素2-氧化酶（GA2ox）；基因克隆：病毒誘導基因沉默（VIGS）；表達分析

廣藿香[Pogostemon cablin（Blanco）Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，以干燥地上部分人藥，原產于東南亞菲律賓、馬來西亞等熱帶地區，宋朝時期傳人我國并在南方廣泛種植，道地產區主要分布在兩廣、嶺南等，故而有廣藿香之稱。廣藿香少有開花，很難結果，因而主要采用扦插方式繁殖，但扦插繁殖慢且易引起種質退化，難以培育出優質品種。因此，通過促進側枝發育增加地上部分的比重，從而提高廣藿香產量，對選育品質優良的廣藿香意義重大。

赤霉素（gibberellins，GAs）是一種重要的植物內源激素，調控植物生命周期的各個階段，在根莖葉伸長、側枝發育、花期調控、種子休眠等方面發揮作用。植物體內的GAs分為有活性和無活性兩類，其中GA1和GA4為有活性類。GA20x（gibberellin 2-oxidases）作為赤霉素代謝途徑中的一個關鍵酶，可以將活性赤霉素（GAI和GA4）降解為無活性狀態，限制有生物活性GAs的含量，從而調節植物發育，如在擬南芥中阻止種子萌發、延遲無性繁殖、改變花期、限制主莖和側芽的伸長等。一般而言，植物體內GA2ox過表達會使活性GAs含量降低，從而使植株表現為矮化，而將其沉默，則會促進莖的伸長和植株生長。目前已有眾多植物GA2ox基因被成功克隆并進行了相關研究，如GA2ox基因在油菜籽、早熟禾、油茶等植物中過表達呈現出矮化表征，生物量減少、開花延遲、葉片顏色呈深綠色等：相反，在煙草中沉默GA2ox可以顯著促進煙草生長和提高纖維產量。目前GA2ox基因在煙草、擬南芥、番茄等植物中已有研究，但未見廣藿香GA2ox基因的相關研究報道，為此，本研究基于本課題組前期獲得的廣藿香轉錄組數據，對其GA2oxl基因進行克隆和生物信息學分析，以探尋GA2ox基因在廣藿香中的作用，為后續研究矮化廣藿香、促進側枝發育和增加產量等提供有力依據。

病毒誘導基因沉默（VIGS）是一種利用植物的病毒防御機制來抑制特定侵襲性病毒轉錄物的基因沉默方式，是研究植物基因功能的強有力工具，與傳統的基因功能分析方法相比，VIGS具有沉默單個或多個基因家族成員的潛力，已被應用于眾多研究領域，如在木薯、大豆、番茄等植物中利用VIGS技術進行抗病性研究：Wang等發現通過VIGS敲除GA中主要DELLA基因，可顯著增強棉花莖木質部和韌皮部次生細胞壁的形成：利用VIGS沉默百合花藥的赤霉素上調基因LoMYB65，可導致花粉發育不正常，花粉量減少等。為探尋GA2ox基因在廣藿香中的沉默效應，本實驗采用煙草脆裂病毒載體對廣藿香葉片進行VIGS侵染，以降低GA2oxl基因的表達水平，探究其對廣藿香表型的影響，以期為廣藿香優良品種選育奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1供試材料

組培苗培養：摘取經廣東藥科大學中藥學院嚴寒靜教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物廣藿香Pogostemon cablin（Blanco）

Benth.的葉片接種于叢芽誘導培養基（MS+0.2mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA）上培養40d，然后選取生長健壯、長勢一致的不定芽接種于生根培養基（1/2MS）上培養60d，統一采用日光燈為光源，在25℃恒溫培養。

將生根培養60d的組培苗移栽水培兩周，然后移栽至混合土壤（普通土與營養基質的體積比為1：1）繼續培養60d。選取生長良好的廣藿香葉片液氮速凍后用于提取總RNA;選取生長良好的廣藿香植株進行VIGS實驗，取第2．3對葉用于沉默基因表達量分析；選取廣藿香的根、莖（第2對葉與第3對葉之間）、葉（第2或第3對葉）、芽（頂芽），液氮速凍后存于-80℃冰箱，用于組織特異性表達分析。

所用菌株DH5a、農桿菌GV3101感受態細胞，購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司：EcoRI和Xhol快切酶購于寶日醫生物技術（北京）有限公司；pTRV1、pTRV2載體為實驗室留存。

1.2實驗方法

1.2.1總RNA提取及cDNA合成根據不同實驗要求選用廣藿香不同組織部位材料，使用天根植物RNA prep Pure Plant試劑盒提取廣藿香總RNA，用超微量紫外分光光度計UV2450檢測總RNA純度和濃度，并使用瓊脂糖凝膠電泳法對其完整性進行檢驗。使用TaKaRa生物公司的Pri-meScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉錄合成廣藿香cDNA，于-20℃貯存備用。

1.2.2廣藿香PcGA2oxl基因的克隆

基于課題組前期獲得的轉錄組測序數據，使用PrimerPremier5.0軟件設計特異引物（表1）。以反轉錄得到的廣藿香cDNA為模板，設定PCR反應體系：cDNA1uL，上游引物PcGA20xl-F，下游引物35個循環；72℃延伸2 min。產物經膠回收后檢測純度和濃度，采用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的克隆載體One step ZTOPO-Blunt/TA進行連接并轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，將獲得的陽性單菌落送至北京擎科生物科技有限公司測序，檢查該序列是否為目標序列。

1.2.3PcGA2oxl的生物信息學分析

利用相應的在線分析軟件（表2）對PcGA2oxl基因進行生物信息學分析，利用BLAST對不同植物的GA2ox氨基酸序列進行同源比對，運用MEGA-X軟件利用NJ法對不同植物GA2ox基因序列進行系統進化樹分析。

1.2.4VIGS實驗基于克隆得到的PcGA2oxl基因CDS序列，選取其中第344～558bp片段，利用SnapGene軟件設計引物（表1），引入EcoR I和Xhol兩個酶切位點，擴增PcGA2oxl基因215 bp片段，構建VIGS載體。PCR擴增體系50PCR反應條件同1.2.2，回收得到目的基因片段。

使用TaKaRa QuickCut限制酶進行pTRV2載體上的EcoRI和Xhol雙酶切，37℃反應15min，切膠回收得到酶切產物，檢測濃度和純度后，將酶切產物與目的基因用莊盟生物的SE無縫克隆試劑盒進行無縫克隆，轉化DH5ce感受態細胞，測序正確后提取得到pTRV2-PcGA20xl質粒。

分別將pTRV1、pTRV2和pTRV2-PcGA20xl質粒轉化農桿菌GV3101感受態細胞，涂布在LB培養基平板（含50mg/LKan，50 mg/LRif）上，恒溫培養箱28℃倒置培養24h，挑取單克隆菌經PCR鑒定，隨即活化擴大培養陽性克隆菌，培養至菌液OD600值為1.0～1.5，重懸后用侵染液（10mmol/L MES、10mmol/L MgCl2、200umol/L AS）沉淀懸浮，于28℃恒溫培養箱遮光靜置3h，然后將pTRV1侵染液分別與pTRV2和pTRV2-Pc-GA2oxl侵染液按1：1混合，混勻后從葉背面注射侵染廣藿香第2對、第3對葉，于28 0C恒溫培養兩周后，按照不同組別采集廣藿香葉片用于基因表達量測定。

1.2.5PcGA20xl基因表達量測定使用PrimerPremier 5.0軟件設計VIGS沉默及組織特異性表達的qRT-PCR引物（表1），以18SrRNA為內參基因，以反轉錄得到的cDNA為模板，使用SYBRGreen Premix Pro Taq PCR試劑盒和熒光定量PCR儀CFX96進行實時熒光定量PCR。使用20擴增體系：TB Green⑩Premix Ex TaqⅡ（TliRNaseH Plus）（2x），上、下游引物各0.4，模板cDNA 1.6 VL，雙蒸水（ddH20） 7.6。擴增程序：95℃ 30s;95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環。每個樣品3次重復，采用2法計算VIGS沉默及不同組織部位的基因表達量，使用Prismchs軟件進行分析繪圖。

2結果與分析

2.1PcGA20xl基因克隆

根據前期獲得的轉錄組數據，克隆得到Pc-GA20xl的CDS序列，并設計了特異性引物；以廣藿香cDNA為模板進行PCR擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到在500 bp左右位置形成了清晰的條帶（圖1）。經過對比分析，目的片段與預期大小相符，由SnapGene測序驗證確認所得序列為完整的561bp的正確CDS序列。

2.2PcGA20xl基因的生物信息學特征

2.2.1PcGA2oxl蛋白理化性質及親疏水性分析

ProParam預測結果（表3）顯示，PcGA20xl蛋白的分子式為C930 H1455 N255 0278 S10．分子量為20.98kDa，脂肪系數為83.87，為親水性的不穩定弱酸性蛋白；酸性氨基酸殘基（Asp+Glu）總數為22，堿性氨基酸殘基（Arg+Lys）總數為19。ProtScale分析結果（圖2）表明，PcGA20xl氨基酸多肽鏈的親水性最大值為1. 467，最小值為-1.844．主要表現為親水性，與ProParam預測結果一致。

2.2.2PcGA2oxl蛋白跨膜結構、信號肽及亞細胞定位預測TMHMM分析結果表明，PcGA20xl蛋白不存在跨膜結構。SignalP6.0未預測到信號肽裂解位點，推測PcGA2oxl蛋白不具有信號肽，屬于非分泌類蛋白。WoLF PSORT亞細胞定位預測結果表明．PcGA2oxl編碼蛋白主要定位在細胞核中。

2.2.3PcGA2oxl蛋白二級結構結果（圖3）顯不，PcGA2oxl蛋白的二級結構由55個a-螺旋、39個延伸鏈、15個轉角、77個無規則卷曲組成，占比分別為29.57%、20.97%、8.06%、41.40%。

2.2.4PcGA2oxl蛋白三級結構利用SWISS-MODEL在線分析平臺構建了PcGA2oxl蛋白可能的三級結構模型（圖4），該模型的GMQE值為0.94，其氨基酸序列與珙桐（Nyssaceae）的模型序列相似度高達83.33%，表明對PcGA2oxl蛋白三級結構的預測結果較為可靠。

2.2.5PcGA20xl保守結構域及系統發育分析在NCBI的CDD（Conserved Domain Database）數據庫搜索上傳的PcGA20xl氨基酸序列，發現其具有GA20x家族保守的20G-FeⅡ_Oxy結構域，表明其屬于GA20x基因家族（圖5）。

運用MEGA -X軟件的NJ法建立不同植物GA20xl基因序列進化樹，結果（圖6）顯示，Pc-GA2oxl與丹參GA2ox7同屬于一小支，相似度最高，達到99%，親緣關系最近；與荔波連蕊茶、煙草、番茄、碧冬茄的同源性也達到50%以上。

2.3病毒誘導PcGA2oxl基因沉默

pTRV2載體經EcoRI和XhoI雙酶切后與PcGA2oxl同源臂PCR切膠回收產物連接，獲得pTRV2-PcGA2oxl重組質粒，熱激法轉化農桿菌GV3101，用VIGS法侵染廣藿香。被侵染的廣藿香培養兩周后，取葉片，通過qRT-PCR分析Pc-GA2oxl表達量的變化。以未侵染的葉片為空白對照，注射pTRV2空載的葉片為陰性對照。結果（圖7）顯示，被侵染的廣藿香葉片中PcGA2oxl表達量分別低于空白對照組和陰性對照組71%和83%，差異顯著，沉默效果明顯：空白對照組與陰性對照組之間沒有顯著差異，表明pTRV2空載不能影響廣藿香葉片GA2oxl基因的表達水平，說明GA2oxl基因在廣藿香中成功沉默。

2.4PcGA2oxl基因組織特異性表達分析

選取生長時間相同、長勢一致的廣藿香植株，對其根、莖、葉和芽中的PcGA2oxl基因表達量進行檢測，結果（圖8）顯示，PcGA2oxl基因在各組織中均有表達，但表達水平存在差異，以葉中的表達量最高，根中的表達量最低。

3討論

GAs的生物合成在高等植物生長發育過程中不可或缺，GAs代謝過程中有多種酶，這些酶會影響生物合成與分解之間的平衡，能維持特定發育階段生物活性水平，實現植物生長發育正常進行。GA2氧化酶使GAs羥基化，導致活性赤霉素鈍化為非活性形式，因此可以調節植物體內赤霉素含量，影響植物生長過程。GA2ox是由多基因家族編碼的雙加氧酶，可分為三類，I類和Ⅱ類都作用于C19-GAs，I類使其失活，Ⅱ類使其前體失活；Ⅲ類作用于C20-GAs，使其2-羥基化。根據生物信息學分析及構建系統發育樹可知，廣藿香PcGA2oxl基因與丹參的GA2ox7相似度最高，達到99%，親緣關系最近；與荔波連蕊茶、煙草、番茄、碧冬茄也聚在一支，同源性達到50%以上。推測PcGA2oxl基因同上述植物的GA2ox基因相似，也屬于I類，催化C19-GAs失活，從而使具有生物活性的GA1和GA4失活。

研究表明，GA2ox基因在植物生長發育過程中存在組織特異性表達差異。大麥HvGA2oxl和HvGA20x3在成熟種子的節間和胚乳中高表達，HvGA2ox6主要在胚中表達：丹參SmGA20xl在花中的表達較高，SmGA20x4在根中的表達較高，SmGA2ox7在葉中高表達，SmGA2ox10在莖中高表達：而荔波連蕊茶CIGA2oxl基因在嫩枝和二年生莖段中的表達量最高，在幼葉中的表達量最低；萬壽菊GA2ox基因在莖及葉中的表達量較高．在種子中的表達量較低。表明不同物種GA2ox基因雖同源性較高，但功能存在差異。本研究結果表明，Pc-GA2oxl基因在廣藿香的根、莖、葉、芽中均有表達，以葉中的表達量最高，芽中的次之，根中的表達量最低，且其表達在根與葉、莖與葉、根與芽、莖與芽間均存在顯著性差異，具有一定的組織特異性。由此推測PcGA2oxl基因主要參與廣藿香葉、芽的生長發育。

由于易用性好和產生表型所需的時間短，VIGS被廣泛用于植物遺傳學中的基因沉默。在廣藿香中，靳巧春等利用VIGS技術沉默廣藿香醇合酶PcPTS基因，對其功能進行了鑒定，并初步建立了廣藿香的VIGS體系：楊豫章通過VIGS技術有效沉默了廣藿香基因，一定程度上影響了廣藿香中百秋李醇的生物合成：王小兵利用TRV病毒載體沉默廣藿香內源PcPDS基因，使其表達量明顯下降，且觀察到葉片白化表型。本研究利用VIGS技術沉默廣藿香PcGA2oxl基因，qRT-PCR結果顯示，沉默兩周后，PcGA2oxl基因表達量與陰性對照相比顯著下降83%，與空白對照相比顯著下降71%。表明PcGA2oxl基因在廣藿香中被有效沉默。

已有研究表明，VIGS沉默技術用于GA20x基因上可促進莖節生長、新枝發育等，如：Joanna等利用VIGS技術沉默碧冬茄“夢幻藍”的GA2ox基因，基因沉默植株會表現出莖伸長：Li等在紫薇垂枝性狀機制研究時發現，VIGS誘導可降低GA信號傳導水平，使紫薇長出新枝。但本研究僅采用煙草脆裂病毒載體TRV使用注射法瞬時侵染廣藿香葉片，且調查時間短，尚未發現明顯表型變化，后續將延長侵染時間，觀察廣藿香生長的變化，并通過含量測定和激素水平分析等進一步探尋VIGS沉默PcGA2oxl基因是否對廣藿香生長發育產生影響。

4結論

本研究首次從廣藿香中克隆出PcGA2oxl基因，全長為561bp，編碼186個氨基酸，為親水性蛋白，具有GA2ox基因家族的保守結構域，主要定位在細胞核。PcGA2oxl基因在廣藿香中的表達存在組織特異性，在葉中的表達量最高：利用VIGS技術成功沉默了PcGA2oxl基因，初步驗證了該基因的功能。本研究結果可為今后深入研究PcGA2oxl基因的功能、選育矮化廣藿香等奠定基礎。