小麥四個抗白粉病基因的KASP標記檢測

關鍵詞：小麥：抗白粉病基因：Pm13：KASP標記：分子標記輔助選擇

小麥白粉病是影響小麥生產的重要病害之一，在國家提倡農藥減量化使用的背景下，利用抗白粉病基因選育抗病品種能有效降低白粉病危害，減少農藥用量，促進農業綠色轉型。

Pm21是我國小麥育種中利用最成功的抗白粉病基因之一，從南京農業大學陳佩度等創制出普通小麥一簇毛麥T6VS.6AL易位系至今已有近30年，該基因在我國大部分麥區仍保持全生育期廣譜抗性。T6VS.6AL異位系在創制之初就被發放到全國大部分小麥育種單位，廣泛用于品種選育，至今含有Pm21的審定品種超過30個，累計推廣面積超過400萬hm2。Pm21被克隆后表明該基因編碼典型的CC-NBS-LRR抗病蛋白，雖然具有廣譜抗性特征，但仍屬于小種專化抗性基因，已發現對Pm21具有毒性的白粉病菌株。

同樣利用簇毛麥創制的T6VS. 6DL易位系Pm97033等，攜帶廣譜抗白粉病基因PmV。通過差異表達基因分析和基因組編輯技術證實Pm9 7033中的抗白粉病基因是Pm21#4，與Pm21同源，可能就是PmV。將含有T6VS.6AL（Pm21）的揚麥18和含有T6VS.6DL（PmV）的揚麥22雜交構建重組自交系，對F分組分析發現T6VS.6AL有利于增加頂部小穗育性，但穗粒數減少，而T6VS.6DL導致株高增加，利用這兩個基因進行抗白粉病改良時需注意對穗粒數和株高的選擇。

Pm12來源于擬山羊草，位于易位染色體T6BS-6SS.6SL的6S染色體短臂，具有突出的白粉病抗性。通過回交獲得了僅含有部分6SS染色體的漸滲系1338-8（T6BS-6SS.6BL），但是仍表現晚熟、產量低等不利農藝性狀，因此在育種中應用較少。近期Pm12被克隆，證明是Pm21的直系同源基因。

Pm13來源于高大山羊草3SIS，通過染色體工程被易位至普通小麥的3B或3D染色體，對我國小麥白粉病具有較好抗性。該外源片段和小麥中對應的染色體為部分同源關系，不發生交換，因此基因定位和克隆研究進展緩慢。通過開展Pm13的轉育和基因聚合工作創制了不少種質材料，但Pm13僅存在于少數審定品種中，可能和攜帶的外源片段較大有關。

根據Pm21、PmV和Pm12的基因序列開發的KASP標記可以有效區分這3個基因，為開展小麥分子標記輔助回交轉育工作奠定了基礎。Cenci等開發了Pm13的SCAR標記Xutv14，該標記和Pm13的距離可能較遠，兩者表現為完全連鎖，可為其回交轉育提供精準標記。但SCAR標記檢測需要凝膠電泳等較為復雜的實驗過程，檢測效率相對較低。為提高Pm13的檢測效率，了解上述4個抗白粉病基因在山東小麥中的利用情況，本研究通過對Xutv14的PCR產物進行測序和引物設計將其轉化成KASP標記，并對2022-2023年山東省小麥區試材料進行KASP標記檢測，為利用KASP標記開展Pm21、PmV、Pm12和Pm13的回交轉育提供參考，以期促進山東省小麥抗白粉病的分子標記輔助選擇育種。

1材料與方法

1.1材料

2022-2023年山東省區試小麥品系取樣于山東省農業科學院作物研究所濟南試驗基地，共142份，其中高產區試組108份（編號GQ1-GQ107和GQCK）、強筋區試組34份（編號QQ1-QQ33和QQCK）。陽性對照揚麥18（含Pm21）、揚麥22（含PmV）、1338-8（含Pm12）、3778（含Pm13）和Pm13F1（含Pm13）由江蘇大學何華綱老師提供。

1.2KASP標記轉化

以小麥品系3778的DNA為模板，用SCAR標記Xutv14進行PCR擴增，PCR原液直接送北京擎科生物科技有限公司青島分公司進行一代測序，用DNAMAN8進行序列比對，在小麥多組學網站WheatOmics用BLAST工具與中國春參考基因組V2.1比對。根據比對結果設計顯性KASP標記Pm13K，引物為Pm13 H：5'-GCCA-CAAGAAGGTGATTAATCACCAGA-3'和Pm13C：5'-GGGTCAACTTGGAGCTCCTCC-3'。

1.3DNA提取和KASP標記檢測

返青期每品系取3個單株葉片小段2cm，采用簡化高鹽低pH法混合提取DNA，KASP-Pm21、KASP-Pm12、KASP-PmV和Pm13K引物通過北京擎科生物科技有限公司青島分公司合成。參考Rasheed等報道的方法進行KASP檢測，DNA被放人96孔板中，分成兩板，第一板包括CQl-CQ93和2份對應基因的陽性對照，第二板包括CQ94-CQ107、QQ1-QQ33、GQCK和QQCK。

2結果與分析

2.1Pm13K的轉化和檢測

用Xutv14擴增3778的DNA，設置1個重復。PCR原液直接測序，用DNAMAN 8比對重復測序樣品間的序列差異，剔除兩側不一致序列后獲得508 bp序列。將其與中國春參考基因組V2.1進行BLAST比對，未發現高相似度序列（圖1）。直接設計引物開發標記Pm13K，用已知含有Pm13的3778和Pm13Fi為陽性對照，以揚麥18、揚麥22、1338-8為陰性對照進行測試，結果（圖2）表明，3778和Pm13F，樣品全部為Hex基因型，其他樣品無信號，黑點為無模板對照。表明轉化的KASP標記Pm13K可以用于Pm13的檢測。

用Pm13K對140份區試材料和2份3778（陽性對照）進行檢測，結果見圖3。其中圖3a是第一板的檢測結果，圖3b是第二板的檢測結果（考慮到Pm13K為顯性標記，第二板增加了兩份陽性對照）。除陽性對照3778為Hex基因型外，全部區試材料均為無信號類型，即不含Pm13。

2.2KASP-Pm2I的檢測

利用Pm21的特異性KASP標記對140份區試材料和2份揚麥18（陽性對照）進行PCR擴增和信號檢測，結果（圖4）顯示，除GQ20無信號外，其余的139份區試材料均不含Pm21，表現為Hex基因型，而陽性對照揚麥18為Fam基因型。

2.3KASP-Pm12的檢測

利用Pm12的特異性KASP標記對140份區試材料和2份1338-8（陽性對照）進行PCR擴增和信號檢測，結果（圖5）顯示，除1338-8為陽性的Fam基因型外，全部區試材料均為陰性的Hex基因型，即不含Pm12。

2.4KASP-PmV的檢測

利用PmV的特異性KASP標記對140份區試材料和2份揚麥22（陽性對照）進行PCR擴增和信號檢測，結果（圖6）顯示，除揚麥22為Fam基因型外，全部區試材料均為Hex基因型，即不含PmV。

3討論與結論

Pm12的載體材料1338-8創制于2007年，因農藝性狀較差可能較少被用于育種。PmV的主要載體品種是揚麥22，2012年通過國家審定，屬于春性、紅粒、粉質弱筋小麥，與山東省的小麥育種目標差異較大，因此在山東被用作育種親本也較少。Pm13在二十世紀末作為二線抗源被用于回交轉育，后在煙中1934、萊農8621、魯農89（4） 116和中大01等種質材料中被檢測到，但檢出率較低，未能廣泛應用。Pm21被導人揚麥5號后廣泛用于育種，其突出的白粉病抗性使攜帶該基因的審定品種已超過30個，主要集中在長江中下游和西南麥區，包括揚麥15、揚麥18、揚麥21、內麥8號、內麥9號、南農9918、綿麥37等；在黃淮麥區品種中也發現但數量較少，如石麥14、金禾9123、國麥301、石鄭816等。上述4個基因均表現出較強的白粉病抗性，遺憾的是本研究中并未檢測到，表明它們在山東小麥育種中的應用較少。雖然在區試品系中未檢測到上述4個抗白粉病基因，但個人交流發現Pm21逐漸被部分育種家重視并用于品種選育，含有Pm21的品系正在選育中，還未能進入區試。

小麥近緣物種是小麥遺傳改良的重要基因庫，黑麥1RS染色體和簇毛麥Pm21在小麥育種中的成功開發為外源基因的利用提供了重要參考。外源抗病基因一般表現突出的抗性，被導入普通小麥時難免帶有連鎖累贅，影響了其在育種中的應用，需要遺傳學家和育種家一起攻堅克難。一方面可通過Ph1b、射線等誘導部分同源染色體的重組獲得漸滲系以減少連鎖累贅。近日Pm21的次級易位系被創制成功，易位片段大幅減小至36.9～39.1Mb，這為進一步利用大大減輕了負擔：另一方面可以通過創制中間材料不斷改善基因供體的農藝性狀。本研究根據SCAR標記Xutv14的擴增序列成功將其轉化為KASP標記Pm13K，與已開發的3個KASP標記一起，可用于Pm13、Pm21、PmV和Pm12的分子標記輔助選擇，精準高效地開展回交轉育和基因聚合，促進這4個基因在山東小麥抗白粉病育種中的利用。