犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡的研制

摘" 要：本研究采用免疫膠體金技術（immune colloidal gold technique，ICGT），以犬細小病毒單克隆抗體作為膠體金的標記物及檢測線診斷物、羊抗鼠IgG抗體作為質控線，制備犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡。結果顯示，制備的試紙卡可在10 min內完成顯色，對其他犬源病毒不存在交叉反應，具有較高的特異性；犬細小病毒滅活病毒液的梯度稀釋檢測結果顯示，制備的試紙卡具有較高的靈敏度，可達到4×109 TCID50/mL；通過對50份樣本的檢測，并與PCR結果進行比對，符合率達92.00％；同時，試紙卡可在室溫（22～25 ℃）穩(wěn)定保存約8個月，在4 ℃環(huán)境中穩(wěn)定保存約10個月。本研究所制備的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡具有較高的敏感性、特異性、重復性與穩(wěn)定性，對犬細小病毒的臨床診斷評估具有一定的參考意義。

關鍵詞：犬細小病毒；抗原檢測；膠體金免疫層析

中圖分類號：S852.23 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2024）03-0018-05

犬病毒性腹瀉是危害犬的一種重要疾病[1]，其中犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）是導致犬健康問題的常見的病原體，引起了獸醫(yī)相關行業(yè)從業(yè)者和犬飼養(yǎng)者的極大關注。CPV屬于細小病毒科，是一種具有二十面體結構的無包膜DNA病毒，直徑約25 nm，包含約5 kb的線性單鏈基因組[2]。CPV是引起犬（尤其是幼犬）死亡和發(fā)病的重要原因之一[3]，病毒在傳播過程中還會發(fā)生重組、變異和繼發(fā)感染等情況，因此對CPV的預防、檢測和控制應加以重視[4]。

目前，對CPV的預防多采用疫苗注射的方式。對CPV的檢測常采用分子生物學和免疫學方法。其中PCR為常采用的分子生物學手段，具有高準確性，同時可以對感染進行分類。血紅細胞凝集實驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫膠體金技術（immune colloidal gold technique，ICGT）等為CPV主要的免疫學檢測手段[5]。

然而，PCR與ELISA檢測需要大量的時間、儀器與相關專業(yè)背景知識，血紅細胞凝集實驗又受紅細胞狀態(tài)的直接影響，因此，本研究以ICGT技術為基礎，采用抗犬細小病毒單克隆抗體為原料，制作出了犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡。該方法具有快速、簡便和易于操作等優(yōu)點，適用于現(xiàn)場與當下的結果定性判定，對CPV的抗原監(jiān)測以及相關流行病學的調查具有重要意義。

1" 材料與方法

1.1 材料

氯金酸（AuCl4H）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自Sigma公司，檸檬酸三鈉購自國藥集團化學試劑有限公司，硝酸纖維素膜購自Sartrious公司，玻璃纖維膜和吸水紙購自懷遠縣通成紙制品有限公司，PVC板購自南通浩杰特貿(mào)易有限公司，犬細小病毒單克隆抗體以及羊抗鼠IgG、犬細小病毒滅活病毒液（1×106 TCID50/mL）、犬瘟熱病毒滅活病毒液、犬冠狀病毒滅活病毒液和犬腺病毒滅活病毒液由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存并提供，20份犬細小病毒陽性樣本、20份犬細小病毒陰性樣本（通過PCR檢驗）以及50份犬臨床眼、鼻分泌物待檢樣本由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院提供。

1.2 犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡的制備

1.2.1 膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉還原法對膠體金溶液進行制備。取100 mL超純水于250 mL錐形瓶中，隨后加入1.0 mL 1.0％氯金酸溶液，并置于磁力攪拌器上連續(xù)攪拌并加熱至沸騰。在攪拌過程中，快速加入1.6 mL 1.0％檸檬酸三鈉溶液，可觀察到溶液逐漸由淺黃色變?yōu)橥该鳎肿優(yōu)榛液谏詈笞優(yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱20 min，加熱結束后持續(xù)攪拌，冷卻至室溫，最后加入超純水定容至100 mL，置于棕色瓶中 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 膠體金-抗原復合物的制備

取1.2.1制備的膠體金溶液20 mL，加入超純水潤洗后的燒杯中，一邊快速攪拌一邊滴加一定量的0.2 M K2CO3溶液，調整溶液pH至8.0，隨后加入62.5 μL抗犬細小病毒單克隆抗體（3.2 mg/mL），繼續(xù)攪拌20 min，再加入終濃度為0.5％的BSA，繼續(xù)攪拌20 min。4 ℃ 8 000 r/min離心20 min，棄上清，沉淀溶于含5％蔗糖的磷酸緩沖液（0.05 mol/L）中，置于棕色瓶中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫層析試紙卡的制備

該試紙條由樣本墊、金標物結合釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和粘有一層聚氯乙烯片材作為襯膜的塑料聚乙烯板組成。將玻璃纖維用含 0.5％ BSA、1％聚乙烯吡咯烷酮-40、0.5％表面活性劑S9（tetronic 1307）的Tris-HCL緩沖液（0.02 mol/L）封閉后，置于37 ℃恒溫箱中干燥12 h以上，即為樣本墊。將膠體金-抗原復合物噴涂于金標物結合釋放墊上，并進行真空干燥。將羊抗鼠IgG抗體（1 mg/mL）和犬細小病毒單克隆抗體（1.5 mg/mL）分別包被為硝酸纖維素膜上的質控線和檢測線，隨后置于37 ℃恒溫箱中干燥12 h以上。將以上組分按照樣本墊、金標物結合釋放墊、硝酸纖維膜以及吸水墊的順序依次粘在塑料聚乙烯板上，切成寬為" "2.8 mm的試紙卡，加干燥劑密封，室溫保存。

1.2.4 樣本的檢測

將樣本與樣本稀釋液分別滴入組裝好的試紙卡中，8～10 min后觀察結果。試紙卡纖維膜上出現(xiàn)2條紅色線判為陽性；僅質控線區(qū)出現(xiàn)1條紅色線判為陰性；質控線區(qū)沒有出現(xiàn)紅色線視為結果無效。

1.3 犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡的評價

1.3.1 特異性評定

采用同一批次的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡分別對犬細小病毒滅活病毒液、犬瘟熱病毒滅活病毒液、犬冠狀病毒滅活病毒液和犬腺病毒滅活病毒液進行特異性評定。

1.3.2 敏感性評定

將犬細小病毒滅活病毒液（1×106 TCID50/mL）用生理鹽水依次以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256和1∶512的比例稀釋，并設置空白對照組（生理鹽水），分別加入樣本孔中，以評定試紙卡的敏感性。

1.3.3 重復性評定

選取4份犬細小病毒陽性樣本和4份犬細小病毒陰性樣本，每份樣本平行做3個重復，用同一批次犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡進行檢測，確定試紙條的批內重復性。

選取4份犬細小病毒陽性樣本和4份犬細小病毒陰性樣本，每份樣本平行做3個重復，用3批不同批次的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡進行檢測，確定試紙條的批間重復性。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗

將同一批試紙卡密封后置于4 ℃以及室溫（22～25 ℃）環(huán)境中，每隔30 d采用空白對照（生理鹽水）與同一批次的犬細小病毒滅活病毒液，對以上兩種環(huán)境中的試紙卡進行穩(wěn)定性測試，總共進行為期12個月的測試。

1.3.5 符合率試驗

將本研究制備的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡對50份待測樣本進行檢測，同時檢測結果與PCR的結果進行比對，檢測制備的試紙卡的符合率。

2" 結果

2.1 試紙卡特異性評定

如圖1所示，利用組裝的犬細小病毒膠體金試紙卡檢測犬細小病毒滅活病毒液、犬瘟熱病毒滅活病毒液、犬冠狀病毒滅活病毒液和犬腺病毒滅活病毒液和生理鹽水（空白對照）。除犬細小病毒滅活病毒液呈陽性外，其余皆呈陰性，說明制備的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡具有良好的特異性。

2.2 試紙卡敏感性評定

如圖2所示，利用組裝的膠體金試紙卡檢測不同稀釋倍數(shù)的犬細小病毒滅活病毒液，當犬細小病毒滅活病毒液稀釋至1∶256時，試紙條T線依舊可以觀察到淺淡的顯色，檢測結果為陽性，說明制備的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡可以檢測到4×109 TCID50/mL，具有良好的敏感性。

2.3 試紙卡重復性評定

對4份犬細小病毒陽性樣本和4份犬細小病毒陰性樣本進行批內重復性試驗和批間重復性試驗，檢測結果均完全一致，表明組裝的試紙卡具有良好的重復性。

2.4 試紙卡穩(wěn)定性評定

第8個月時，用在室溫（22～25 ℃）環(huán)境中保存的膠體金免疫層析試紙卡檢測犬細小病毒滅活病毒液，結果顯示，質控線以及檢測線的顯色效果有所下降，但并不明顯。然而，用在4 ℃環(huán)境中保存的試紙卡檢測犬細小病毒滅活病毒液，結果顯示，質控線以及檢測線的顯色水平較之前無差別，但在第10個月時出現(xiàn)了質控線和檢測線顯色效果皆下降的現(xiàn)象。在第12個月時，兩種溫度環(huán)境條件下的試紙卡的檢測線顯色都較之前更弱，不可再用于試驗檢測。同時，在為期12個月的試驗中，所有樣本稀釋液（空白對照）的檢測線皆不顯色。結果表明，本研究制備的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡在室溫（22～25 ℃）環(huán)境下可穩(wěn)定保存約8個月，在4 ℃環(huán)境中可穩(wěn)定保存約10個月。

2.5 試紙卡符合率

本研究制備的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡對50份犬待檢血清的陽性檢出量為38份，陰性檢出量為12份，PCR試驗的陽性檢出量為42份，陰性檢出量為8份。其中，PCR試驗檢測出的42份陽性樣本包含試紙卡檢測出的38份陽性樣本，因此該試紙卡的陽性符合率為90.48％。同時試紙卡檢測出的12份陰性樣本包含了8份PCR試驗檢測出的陰性樣本，因此該試紙卡的陰性符合率為100.00％。同時，在兩項試驗的檢測結果中，46份樣本的檢測結果是相符合的，因此該研究制備的試紙卡的符合率為92.00％，說明該試紙卡具備良好的準確性。

3" 討論

犬細小病毒在我國乃至全世界廣泛傳播，尤其對幼犬影響較大，受到了獸醫(yī)和寵物飼養(yǎng)人員的廣泛關注。雖然可以對犬采取嚴格的管控，對相關人員加強培訓，但對犬細小病毒有效的預防方法是接種疫苗。犬一旦感染細小病毒，治愈率低，死亡率高[6]，同時治療成本以及相關費用也特別高。因此，對犬細小病毒進行早預防、早發(fā)現(xiàn)以及早治療，對犬的健康十分重要。

ICGT作為病原體免疫診斷中常用的檢測手段，具有時效性高、準確性高以及實時性等優(yōu)點，常被用于病原體的臨床檢測及流行病學的調查。根據(jù)相關報道，CPV存在多個相同的抗原表位[7]，因此可以采用同一單克隆抗體制作犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡。本研究研制的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡可對犬的排泄物或嘔吐物進行犬細小病毒特異性檢測，不與其他犬源性病毒以及陰性樣本等發(fā)生交叉反應。同時，該試紙卡具有靈敏度高、最低檢測限高（4×109 TCID50/mL）的特點。通過本研究制作的試紙卡可在常溫與4 ℃的環(huán)境中保存半年以上，具有較高的穩(wěn)定性。該試紙卡對樣本的測試結果與PCR測試結果的總體符合率高達92.00％。

通過本研究制備的犬細小病毒膠體金免疫層析試紙卡可用于臨床樣本中犬細小病毒檢測的定性分析，可對CPV的治療以及CPV的流行病學調查提供有效的輔助手段。

參考文獻

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[2] COTMORE SF ，AGBANDJE-MCKENNA M，CANUTI M，et al．ICTV virus taxonomy profile：Parvoviridae[J]．Journal of General Virology，2019，100（3）：367-368.

[3] ZHOU P，ZENG W，ZHANG X，et al．The genetic evolution of canine parvovirus - A new perspective[J]．PLoS One，2017，12（3）：e0175035.

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[5] TUTEJA D，BANU K，MONDAL B．Canine parvovirology - A brief updated review on structural biology，occurrence，pathogenesis，clinical diagnosis，treatment and prevention[J]．Comparative Immunology， Microbiology and Infectious Diseases，2022，82：101765.

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[7] PAUL B，ALAM J，HOSSAIN MMK，et al．Immunoinformatics for novel multi-epitope vaccine development in canine parvovirus infections[J]．Biomedicines，2023，11（8）：2180.

*通信作者：蔣永青（1981－ ），碩士研究生，獸醫(yī)師，研究方向為動物疫病快速檢測及農(nóng)產(chǎn)品安全檢測