紫菜種質保存和擴增中污染雜藻的形態學分析與鑒定

摘 要：紫菜種質庫為種業健康持續發展提供了科技支撐，但紫菜種質保存和擴增中常會受到雜藻（藍藻、綠藻、硅藻）的污染。通過形態學觀察及16S rRNA序列系統發育分析發現，污染藍藻隸屬3個屬：細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）（JBCY01、JBCY02）、結絲藻屬（Nodosilinea）（JBCY03）、異球藻屬（Xenococcus）（JBCY04），其中JBCY01、JBCY02和JBCY03三者具有相同的無性繁殖方式，均通過藻體的斷裂及藻殖段形成，在紫菜種質中可大量繁殖。形態學觀察顯示，污染綠藻隸屬3個屬：小球藻屬（Chlorella）（JBCH01）、裂絲藻屬（Stichococcus）（JBCH02）、石莼屬（Ulva）曲滸苔（Ulva flexuosa）（JBCH03），其中JBCH01和JBCH02的繁殖方式分別是無性生殖產生似親孢子和藻絲體斷裂，可在短時間內快速增殖。污染硅藻隸屬5個屬：分別為舟形藻屬（Navicula）（JBBA01）、針桿藻屬（Synedra）（JBBA02）、直鏈藻屬（Melosira）（JBBA03）、楔形藻屬（Licmophora）（JBBA04）、曲殼藻屬（Achnanthes）（JBBA05），這5個屬藻體具有相似的生態特點，均為固著類型硅藻。文章通過對雜藻進行形態學觀察與分子鑒定，并進一步分析其繁殖方式和生態特性，為紫菜種質保存和擴增中污染雜藻的防治提供了參考依據。

關鍵詞：紫菜；種質；形態學觀察；16S rRNA

紫菜是一種具有高營養價值和經濟價值的紅藻［1］，主要在中國、日本和韓國海域養殖［2］。紫菜生活史包括宏觀的葉狀體和微觀的絲狀體階段，因絲狀體階段具有體積小、增殖快、遺傳性質穩定等特點，常被用作紫菜種質保存［3］。隨著紫菜養殖規模的擴大，目前紫菜養殖面臨著海域退化、因病減產、雜藻污染等問題［4］。而由于人類沿海開發活動加劇，野生紫菜的生境條件遭到嚴重破壞，許多紫菜物種正在悄然消失。為了保護野生種質以及解決種質資源退化和匱乏等問題，紫菜種質資源庫應運而生。

江蘇省海洋水產研究所于1999年建立的國家級紫菜種質庫主要進行紫菜種質資源的收集、保存、擴增與良種推廣工作［5］。在紫菜種質保存和擴增中常常會受到藍藻、綠藻、硅藻等雜藻的污染，雜藻與紫菜絲狀體共存，阻礙了紫菜絲狀體的正常生長。藍藻是較難去除的雜藻之一，因其生長適溫范圍廣，生長速度快，且與紫菜絲狀體的顏色及形態較為一致，都是紅棕色絲狀藻體，一旦紫菜絲狀體受到藍藻污染，很難通過肉眼觀察進行甄別［6］。綠藻是春夏高溫季節最容易污染紫菜絲狀體的雜藻，綠藻的繁殖能力要比紫菜絲狀體強，如不及時將之清除，其會爭奪絲狀體所需養分，導致絲狀體發白。硅藻也是最常見的雜藻之一，由于其繁殖速度快、適應能力強，常會將絲狀體團團裹住，抑制絲狀體對養分和光能的攝取，從而導致紫菜絲狀體生長緩慢［7］。

目前，關于紫菜種質污染的防治已有一些相關的研究，如張美如等［8］、薛學坤等［9］對條斑紫菜種質擴繁與保存中的污染控制技術進行了研究。但目前的研究大多專注于雜藻污染的控制方法，忽略了對雜藻本身的研究，如形態特征、繁殖特性和生態習性等。為了制定有效的策略來檢測或控制雜藻污染，了解污染雜藻的分類及特性是關鍵步驟。因此，本研究在形態觀察和分子系統發育的基礎上對污染雜藻進行鑒定，并通過對其繁殖方式及生態特性的分析，以期為紫菜種質污染的科學防治提供有效依據。

1 材料和方法

1.1 樣品分離和培養

從地處江蘇省南通市的國家級紫菜種質庫中挑選被雜藻污染的種質，在倒置顯微鏡（日本，奧林巴斯）下挑取單株純凈雜藻，放入培養皿中培養。培養溫度為25 ℃，光照強度為35 μmol/（m2·s），光周期12L∶12D。根據藻體形態特征進行初步分類，發現污染藍藻有4種，編號分別為JBCY01、JBCY02、JBCY03、JBCY04；污染綠藻有3種，編號分別為JBCH01、JBCH02、JBCH03；污染硅藻有5種，編號分別為JBBA01、JBBA02、JBBA03、JBBA04、JBBA05。

1.2 藻體形態觀察和測量

將純化后的雜藻制作成顯微玻片標本，置于Nikon-Eclipse Ni光學顯微鏡下進行形態學觀察，用NIS-Elements Ds圖像軟件系統進行拍照，并測量藻體細胞大小、直徑等。隨機選取60個以上藻體進行測量統計。

1.3 藻株基因組DNA提取和PCR擴增

稱量約20 mg藍藻樣品，按照天根生化科技（北京）有限公司的試劑盒操作流程提取DNA。

擴增藍藻16S rRNA序列所用引物為F1和1 492R［10-11］，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。聚合酶鏈式反應（PCR）反應體系為42 μL，包含濃度為10 μmol/L的正反向引物各2 μL，基因組DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶20 μL，ddH2O 16 μL。擴增條件如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，此階段循環35次；最后72 ℃延伸10 min。

擴增綠藻所用ITS引物為ITS-F（5′-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′）和ITS-R（5′-TTCCTTCCGCTTATTGATATGC-3′）［12］。PCR反應體系為25 μL，包含濃度為10 μmol/L的正反向引物各1 μL，基因組DNA 0.5 μL，Taq DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 10 μL。擴增條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，此階段循環30次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序完成。

1.4 系統發育樹分析

測得的序列通過NCBI的比對工具BLAST進行比對，從GenBank數據庫中下載相關參考序列進行分子系統進化樹的構建。用MEGA-X軟件以鄰接法構建系統發育樹。所用的系統發育評估均計算1 000次重復。

2 結果

2.1 污染藍藻的形態學觀察及16S rRNA序列分析

JBCY01藻體為不分枝的單列藻絲，直徑1.6～2.6 μm。細胞呈圓柱狀，長1.3～2.4 μm，寬0.5～1.4 μm。末端細胞多數呈圓柱狀，不漸尖（見圖1-a）。繁殖依靠藻絲的斷裂或藻殖段的形成。藻絲間常相互聚集形成紅褐色膜狀藻層（見圖1-b）。

JBCY02藻體呈紅棕色，藻絲不分枝，直徑1.9～3.9 μm。細胞長1.2～3.2 μm，寬0.9～2.8 μm。膠質鞘很薄，無色透明，但清晰可見（見圖1-c）。頂端細胞易釋放出藻殖段形成新的絲狀體。污染嚴重時，許多藻絲交織而成長絲狀態，外觀上與紫菜絲狀體相似（見圖1-d）。

JBCY03藻體呈綠色，藻絲為細小的絲狀體，直徑0.8～2.0 μm。細胞呈長圓柱狀，長1.3～4.5 μm，寬0.7～1.5 μm。絲狀體的頂端略呈漸尖（見圖1-e）。繁殖主要依靠絲體的斷裂及藻殖段的形成。藻體常相互緊密纏繞生長，在瓶底或瓶壁上形成一種皮殼狀的藻層（見圖1-f）。

JBCY04藻體為單細胞，細胞呈圓球狀，直徑9～20 μm。隨著藻體細胞的成熟，形成孢子囊，直徑最大可

達30 μm。該藻以釋放內生孢子進行繁殖，內生孢子數量很多，呈球形，直徑3～6 μm（見圖1-g）。細胞常在瓶底聚生形成黃褐色扁平的層狀（見圖1-h）。

采用上述引物分別擴增4株藍藻的16S rRNA 基因，分別得到全長為1 377、1 388、1 412、1 404 bp的序列。4株樣品構建的分子系統發育樹見圖2。以GenBank數據庫中下載的細菌序列為外類群構建系統發育樹，顯示污染藍藻分成3個不同分支，JBCY01、JBCY02與細鞘絲藻屬（Leptolyngbya）形成1個分支，JBCY03與結絲藻屬（Nodosilinea）其他藻株形成另1個分支，JBCY04以100%的置信度與異球藻屬（Xenoco-ccus）形成分支。

對4組樣品進行16S rRNA基因序列分析，通過NCBI的在線比對工具BLAST進行比對，結果發現，JBCY01、JBCY02與GenBank數據庫中Leptolyngbya cf. Ectocarpi（KU951732）的相似度為98.47%，說明兩者與細鞘絲藻屬親緣關系較近；JBCY03與Nodosilinea sp.（KC695831）的相似度為100%，從而聚在一起；JBCY04與Xenococcaceae cyanobacterium（KT731136）的相似度為97%，且與異球藻屬聚為一支。

2.2 污染綠藻的形態學觀察及部分分子序列分析

JBCH01藻體為單細胞藻，細胞呈圓形或近圓形，直徑為8～13 μm。色素體周生，1個，占細胞的一半或稍多（見圖3-a）。生殖方式是無性生殖產生2個、4個、8個似親孢子，孢子經母細胞壁破裂釋放。根據《中國淡水藻類——系統、分類及生態》［13］進行比對，發現此藻體隸屬于綠藻門（Chlorophyta）、綠藻綱（Chlorophyceae）、綠球藻目（Chlorococcales）、小球藻科（Chlorellaceae）、小球藻屬（Chlorella）。本屬常在夏季高溫時節大量繁殖，多個細胞聚集成群，在瓶底或瓶壁形成綠色藻層（見圖3-b）。

JBCH02植物體常為單個細胞，有時幾個細胞連在一起構成絲狀體。細胞大多數呈長圓柱狀，長3～10 μm，寬1～3 μm（見圖3-c）。色素體為片狀，側位。繁殖方式是靠藻絲體斷裂。與《中國淡水藻類——系統、分類及生態》［13］描述的裂絲藻屬（Stichococcus）相同，隸屬于綠藻門（Chlorophyta）、綠藻綱（Chlorophyceae）、絲藻目（Ulotrichales）、絲藻科（Ulotrichaceae）。本屬一年四季都能發現，4—9月數量最多，常在瓶壁周圍及液面上方結成綠色薄層（見圖3-d）。

JBCH03藻體呈圓柱狀，一般具有分枝，多為中空管狀，長度在5～20 cm，主干直徑可達1～2 cm（見圖3-e）。藻體呈亮綠色或暗綠色（見圖3-f）。擴增藻體的ITS（internally transcribed spacers）基因片段長度約為535 bp，與NCBI數據庫中已收錄的石莼屬（Ulva）的ITS基因進行BLAST分析，結果發現，與曲滸苔（Ulva flexuosa）（MH298835）相似性為100%，在構建的ITS系統發育樹中（見圖4），JBCH03與Ulva flexuosa 的其他藻株以95%的置信度聚類在一起，與緣管滸苔（Ulva linza）形成2個分支。結合形態學及ITS序列分析結果，將JBCH03藻株鑒定為曲滸苔。該藻種在紫菜種質中的污染數量很少，遠不如上述兩種。

2.3 污染硅藻的形態學觀察

對紫菜種質保存和擴增中污染硅藻的分類鑒定主要依據程兆第等［14-15］、郭玉潔等［16］有關硅藻分類的文獻進行。

JBBA01藻體呈橢圓形，兩側對稱，末端為喙狀。細胞長7～19 μm，寬3～6 μm，色素體呈帶狀，多為2塊（見圖5-a）。根據《中國海藻志》［14］比對發現，此藻屬于硅藻門（Bacillariophyta）、羽紋綱（Pennatae）、雙殼縫目（Biraphidinales）、舟形藻科（Naviculaceae）、舟行藻屬（Navicula）。本屬是附生在紫菜種質上的污染硅藻中的優勢種類，一年四季均有發現。繁殖數量多的時候可見瓶底有一層厚厚的黃色藻膜，瓶壁四周布滿黃色斑點狀的藻落（見圖5-b）。

JBBA02藻體殼面呈窄梭形，由中部向殼端逐漸變窄。細胞長23～27 μm，寬5～9 μm（見圖5-c）。此藻隸屬于羽紋綱（Pennatae）、等片藻目（Diatomales）、等片藻科（Diatomaceae）、針桿藻屬（Synedra）。本屬是一種常見的附著硅藻，以一末端分泌膠質附著在紫菜種質上。當其大量繁殖時，細胞進行多次分裂，相互疊堆，如雜亂的柴火相互疊加。外觀可見瓶子底部呈鐵銹斑顆粒狀的藻落（見圖5-d）。

JBBA03藻體連成鏈狀，外觀如串成鏈的珍珠。藻體直徑10～14 μm，細胞呈短圓柱形，長11～18 μm，寬9～14 μm（見圖5-e）。這種硅藻常常由一端的細胞分泌膠質和膠質柄附著在紫菜種質上。經與《中國海藻志》［16］進行比對發現，此藻株是念珠直鏈藻（Melosira moniliformis），隸屬于中心綱（Centricae）、盤狀硅藻目（Discoidales）、直鏈藻科（Melosiraceae）、直鏈藻屬（Melosira）。本種一般只有在附著的情況下才能進行分裂，在紫菜種質制備前期階段（12月份）容易出現，此階段紫菜種質常常靜止不動，有利于念珠直鏈藻進行繁殖。

JBBA04藻體細胞呈三角形或扇形，常以一端借膠質柄附著在紫菜種質上組成群體。殼面長26～80 μm，呈棒形，一端寬，另一端窄，環面呈扇形或楔形（見圖5-f）。該藻體隸屬于羽紋綱（Pennatae）、等片藻目（Diatomales）、等片藻科（Diatomaceae）、楔形藻屬（Licmophora），為扇形楔形藻（Licmophora flabellata）。扇形楔形藻在紫菜種質上附生數量一般很少，它或成群體，或單獨附生，但都以尖端的膠質柄附著在絲狀體上，猶如一把扇子，易于鑒別。

JBBA05藻體殼面呈菱形，兩側中部縊縮，殼面具有羽狀排列的花紋，色素體片狀，1～2個（見圖5-g）。殼面長35～50 μm，寬10～20 μm。該藻體隸屬于羽紋綱（Pennatae）、曲殼藻目（Achnanthales）、曲殼藻科（Achnanthaceae）、曲殼藻屬（Achnanthes），為爪哇曲殼藻亞縊變種（Achnanthes javanica var. Subconstricta Meister）。本種在紫菜種質附著數量少，且主要出現在野生壇紫菜種質中，以分泌膠質柄的形式附著在紫菜種質上。

3 討論

從1999年到2023年，國家級紫菜種質庫已保存紫菜種質24年。在漫長的紫菜種質保存周期中，遇到的最大問題就是雜藻污染。由于藍藻形態特征簡單且具可塑性［17］，因此，本研究采用形態學和分子鑒定相結合的方法分析污染藍藻類型。結果發現，在污染藍藻中，JBCY01和JBCY02隸屬于細鞘絲藻屬，兩者在形態特征上非常相似，都是紅棕色絲狀藻體，但JBCY02相比JBCY01藻絲更粗，細胞更大；JBCY03具有綠色色素，該藻種細胞呈長圓柱狀，頂端漸尖，其細胞學形態與Deng等［6］描述的YCG3非常相近。此外，JBCY03與結絲藻屬形成一個獨特的分支，此屬最近從細鞘絲藻屬中分離出來，并在低光條件下具有在細絲中形成結節的能力［18-19］。以上3個藻種無性繁殖方式相同，主要依靠絲狀藻體的斷裂和藻殖段的形成，因此，受此藍藻污染的紫菜種質，在擴增中應避采用切割的方式，以產生大量藻殖段進行快速繁殖。本文首次報道發現紫菜種質保存中存在異球藻屬污染，此屬常在野生紫菜種質中出現。據《中國海藻志》［20］記載，異球藻屬藻株常附生在潮間帶上部的鞘絲藻（Lyngbya sp.）、江蘺（Gracilaria sp.）、剛毛藻等藻體上，可見從潮間帶采集回來的野生紫菜有可能附著異球藻。因此建議，藻體在種質制備前，應采用毛刷徹底去除附著在上面的雜藻，從源頭預防污染的發生。

本研究發現，紫菜種質保存和擴增中的污染綠藻有小球藻屬和裂絲藻屬，以及大型藻類盤苔。其中小球藻屬和裂絲藻屬污染數量較多，這兩類藻分布十分廣泛，在潮濕的土壤、墻壁、溫室的玻璃上均有分布［21］；其繁殖力強，在淡水或海水水體中均可快速生長［22］；而且小球藻屬、裂絲藻屬的孢子在空氣中可以存活并隨風傳播［23-24］。因此推測，在種質保存和擴增中，污染的小球藻屬、裂絲藻屬可能來源于空氣。建議在進行紫菜種質保存和擴增時，應單間獨立操作，做好房間消毒工作，從而避種質被污染。

在紫菜葉狀體生長期，常因硅藻的大量附生而嚴重影響產量和品質［25］。據Kim等［26］報道，條斑紫菜葉狀體附著硅藻的優勢種主要有舟行藻屬、脆桿藻屬（Fragellaria）、念珠直鏈藻、扇形楔形藻。壇紫菜葉狀體表面附著的硅藻主要有平片針桿藻小形變種（Synedra tabulata）、海生斑條藻（Grammatophora marina）、小鉤斑條藻（Grammatophora hamulifera）、念珠直鏈藻、短楔形藻（Licmophora abbreviata）、爪哇曲殼藻亞縊變種［27］。以上研究報道與本文發現的污染硅藻種類相似，表明紫菜種質保存和擴增中污染的硅藻可能來源于葉狀體。因此，在紫菜種質制備過程中應反復多次刷洗藻體，以充分去除附著在藻體表面的硅藻，從源頭阻斷硅藻污染。本研究發現，污染硅藻分別隸屬于5個屬，但有著相似的生態特點，均為固著類型硅藻，它們具有分泌膠質或以膠質柄附著于他物上的特點。因此，在紫菜培養早期，如出現硅藻，不宜搖動，以擴散污染。

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Morphological analysis and identification of contaminated algae in the preservation and expansion "of Pyropia/Porphyra germplasm

TIAN Cuicui1，2， ZHOU Wei1，2， DENG Yinyin1， XU Guangping1， WEI Liangdi1

（1. Jiangsu Marine Fisheries Research Institute，Nantong 226007，China;

2. Jiangsu Province Science and Technology Resources Coordination Service Center，Nanjing 210014，China）

Abstract： The germplasm bank of Pyropia/Porphyra provides technological support for the healthy and sustainable development of the seed industry.However，the preservation and expansion of Pyropia/Porphyra is easily contaminated with filamentous cyanobacteria，green algae and diatoms.The morphological characteristics of filamentous cyanobacteria were observed，and their phylogenetic relationship were analyzed by 16S rRNA sequence.The results showed that the polluted four filamentous cyanobacteria belonged to three genera，among which two strains were Leptolyngbya（JBCY01 and JBCY02），one strain was Nodosilinea（JBCY03），and one strain was Xenecoccus（JBCY04）.JBCY01，JBCY02 and JBCY03 had the same asexual reproduction mode which were easy to spread by releasing hormogonia to grow new filaments.Morphological observation showed that the polluted green algae belonged to three genera：Chlorella（JBCH01），Stichococcus（JBCH02） and Ulva flexuosa（JBCH03）.JBCH01 and JBCH02 reproduction mode were the mother cell produces autospores and breakage of algal filaments respectively，which could rapidly proliferate in a short period.Polluted diatoms belonged to five genera：Navicula（JBBA01），Synedra（JBBA02），Melosira（JBBA03），Licmophora（JBBA04），Achnanthes（JBBA05）.These five genera had similar ecological characteristics and were all sessile diatoms.In this paper，the morphological observation and molecular identification of the algae and the further analysis of their reproduction mode and ecological characteristics provided a reference for the prevention and control of contaminated algae in the preservation and expansion of Pyropia/Porphyra germplasm.

Key words： Pyropia/Porphyra; germplasm; morphological; 16S rRNA gene