成纖維細胞生長因子2在椎間盤退行性變中的作用及機制

李 磊 ，王一范2，施強慧，鐘華建

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬衢州醫(yī)院（衢州市人民醫(yī)院）骨科，衢州 324000

2.海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院健康管理科，上海 200003

3.中國人民解放軍63680 部隊醫(yī)院骨科，江陰 214400

4.海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院骨科，上海 200003

椎間盤是相鄰椎體之間的軟骨組織，由中央髓核、外圍纖維環(huán)及上下兩端軟骨終板構(gòu)成，在維持脊柱穩(wěn)定性、緩沖生物應(yīng)力中發(fā)揮重要作用，當(dāng)椎間盤發(fā)生退行性變時，其內(nèi)在彈性喪失，易在急性應(yīng)力作用下發(fā)生纖維環(huán)破裂、髓核突出、椎間高度丟失，導(dǎo)致頸腰痛等臨床癥狀［1］。目前，臨床針對椎間盤退行性變（IDD）相關(guān)疾病（如頸椎病、腰椎椎間盤突出、椎管狹窄等）的治療主要包括非手術(shù)治療（功能鍛煉、熱療、物理治療，口服解熱鎮(zhèn)痛藥、局部神經(jīng)阻滯等）和手術(shù)治療（椎間盤切除融合術(shù)、人工椎間盤置換術(shù)、椎板切除植骨融合術(shù)、椎管擴大椎板成形術(shù)等），部分患者癥狀可獲得有效緩解，但易復(fù)發(fā)［2-3］，究其原因是IDD 發(fā)生機制尚不明確，現(xiàn)有治療手段均不能從發(fā)生機制著手，無法延緩甚至逆轉(zhuǎn)退行性變進程。

IDD 主要表現(xiàn)為髓核細胞凋亡、細胞外基質(zhì)（ECM）代謝紊亂（合成減少、分解增加）、炎性反應(yīng)、神經(jīng)和血管長入椎間盤等病理過程，其中以ECM代謝紊亂最為重要［4］。椎間盤ECM主要包含蛋白聚糖（主要是糖胺聚糖）和Ⅱ型膠原，椎間盤發(fā)生退行性變時，糖胺聚糖和Ⅱ型膠原表達顯著減少，導(dǎo)致椎間盤ECM減少、含水量丟失［5］。多項研究［6-7］表明，Wnt/β-catenin信號通路可誘導(dǎo)髓核細胞凋亡及ECM降解，進而加速IDD 進程。成纖維細胞生長因子2（FGF2）對ECM代謝具有重要影響，Meo Burt等［8］在FGF2過表達的小鼠軟骨組織中發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路顯著激活，說明FGF2 對該通路具有調(diào)控作用，而這種調(diào)控作用是否同樣存在于椎間盤組織尚未可知。因此，本研究擬探索FGF2在IDD中的功能及對Wnt/β-catenin信號通路活性的影響，旨在為闡明IDD關(guān)鍵致病因子及調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

FGF2 抗 體（ab92337）、ACAN 抗 體（ab3778）、MMP3 抗體（ab52915）、ADAMTS-4 抗體（ab185722）均購自Abcam 公司，active β-catenin 抗 體（05-665）購自Millipore 公司，phospho-β-catenin 抗體（2009）、β-catenin 抗體（8480）購自Cell Signaling Technology公司，cleaved-caspase3（ab32042）、BAX（ab32503）、Bcl2（182858）購自Abcam 公司；促炎因子白細胞介素-1β（IL-1β）購自Peprotech公司，F(xiàn)GF2重組蛋白（3718-FB）購自R&D公司，Wnt/β-catenin信號通路抑制劑PRI-724購自Selleck公司；TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒（RR820A）及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）購自TaKaRa 公司。GeneAmp 9700 型熒光定量PCR 儀為Applied Biosystems 公 司產(chǎn)品。ELISA 檢測試劑盒（ERA4RB）購自Thermo Fisher 公司，干擾RNA 均購自吉瑪基因。

1.2 小鼠組織標(biāo)本獲取及處理

6 月齡和24 月齡小鼠各10 只，購自海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2022-0002］。將6 月齡小鼠椎間盤設(shè)定為正常椎間盤，將24 月齡小鼠椎間盤設(shè)定為老年退行性變椎間盤。采用CO2吸入法處死小鼠，而后沿背部正中線剪開皮膚及皮下軟組織，分離肌肉后離斷腰椎部分，剔除腰椎周邊肌肉，取出椎間盤組織。部分標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定24～ 36 h，按常規(guī)方法脫鈣、石蠟包埋、切片，進行HE 染色、Masson染色和番紅固綠染色，評估IDD 情況。對切片進行免疫組織化學(xué)染色，觀察FGF2 的表達情況。剩余標(biāo)本凍于液氮中，用于蛋白質(zhì)印跡法檢測FGF2 表達水平。

1.3 髓核細胞培養(yǎng)及處理

根據(jù)Risbud 等［9］的方法提取髓核細胞，從140～ 160 g Sprague-Dawley 大鼠［20 只，購自海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2022-0002）］髓核組織中分離原代髓核細胞，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基制備細胞懸液后置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置72 h，觀察細胞貼壁情況并更換細胞培養(yǎng)基，之后每3 d更換一次培養(yǎng)基，待細胞生長至約80%匯合時進行傳代或凍存，取2～ 4 代的髓核細胞進行實驗。①收集大鼠髓核細胞，分別采用0、10、25、50 ng/mL促炎因子IL-1β 刺激誘導(dǎo)細胞退行性變，通過蛋白質(zhì)印跡法和ELISA 分別檢測FGF2 在細胞內(nèi)表達及分泌至細胞外的含量。②采用0、5、10、50 ng/mL FGF2 重組蛋白刺激正常髓核細胞，采用0、0.5、1.0、5.0 μg/mL FGF2中和抗體干預(yù)經(jīng)25 ng/mL IL-1β預(yù)處理的退行性變髓核細胞，采用FGF2 干擾RNA（siFGF2，25 pmol）和陰性對照（siNC，25 pmol）轉(zhuǎn)染經(jīng)25 ng/mL IL-1β 預(yù)處理的退行性變髓核細胞，通過流式細胞術(shù)及TUNEL 染色檢測髓核細胞凋亡情況，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測髓核細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白（cleaved-caspase3、BAX、Bcl2）和Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白（active β-catenin、β-catenin、磷酸化β-catenin）的表達水平，通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測ECM 代謝相關(guān)基因（ACAN、COL2A1、MMP3、MMP13、ADAMTS-4、ADAMTS-5）的表達水平。③采用Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑（PRI-724）處理FGF2 重組蛋白刺激后的大鼠髓核細胞，通過流式細胞術(shù)和TUNEL 檢測髓核細胞凋亡情況，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測髓核細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白（cleaved-caspase3、BAX、Bcl2）表達水平，通過實時熒光定量PCR 和蛋白質(zhì)印跡法檢測ECM代謝相關(guān)基因（ACAN、COL2A1、MMP3、MMP13、ADAMTS-4、ADAMTS-5）的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Graphpad 9.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。各組數(shù)據(jù)采用D’Agostino-Pearson omnibus normality和Shapiro-Wilk normality 檢驗進行正態(tài)性分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用Studentt檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGF2在椎間盤退行性變時表達水平上調(diào)

小鼠椎間盤組織病理學(xué)染色結(jié)果顯示，相較于6 月齡小鼠，24 月齡小鼠椎間盤內(nèi)類圓形髓核細胞數(shù)目顯著減少，分布散在稀疏，ECM 中膠原纖維排列紊亂，蛋白聚糖含量顯著降低，符合IDD 組織學(xué)變化（圖1a）。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，發(fā)生退行性變的椎間盤內(nèi)FGF2 陽性的髓核細胞比例顯著高于正常椎間盤（P＜ 0.05，圖1b、c）；蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，發(fā)生退行性變的椎間盤內(nèi)FGF2蛋白含量顯著高于正常椎間盤（P＜ 0.05，圖1d）。以上結(jié)果從組織學(xué)層面說明FGF2 在IDD 時表達增加。

圖1 IDD 時FGF2 表達變化Fig.1 Expression of FGF2 during IDD

為進一步驗證IDD 對FGF2 表達的影響，收集大鼠髓核細胞，采用不同濃度促炎因子IL-1β 刺激誘導(dǎo)細胞發(fā)生退行性變，通過蛋白質(zhì)印跡法和ELISA 分別檢測FGF2 在細胞內(nèi)表達及分泌至細胞外的含量，結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2在促炎因子IL-1β誘導(dǎo)發(fā)生退行性變的髓核細胞內(nèi)表達及分泌水平顯著上調(diào)，其峰值出現(xiàn)在IL-1β濃度為25 ng/mL時（圖1e、f）。因此，將25 ng/mL 定為IL-1β 最適作用濃度用于后續(xù)實驗。

2.2 FGF2促進髓核細胞凋亡

流式細胞術(shù)、TUNEL 和蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2 重組蛋白顯著促進正常大鼠髓核細胞凋亡，增加正常大鼠髓核細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白（cleaved-caspase3、BAX、Bcl2）表達水平（圖2a～ f）；采用FGF2 中和抗體或siFGF2 干預(yù)IL-1β 預(yù)處理的退行性變髓核細胞，細胞凋亡比例及凋亡相關(guān)蛋白均顯著下調(diào)（圖2g～ r）。上述結(jié)果提示FGF2 能促進髓核細胞凋亡發(fā)生。

圖2 FGF2對大鼠髓核細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of FGF2 on nucleus pulposus cell apoptosis

2.3 FGF2促進髓核細胞ECM 代謝紊亂

實時熒光定量PCR 和蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)GF2 重組蛋白顯著減少正常髓核細胞內(nèi)ECM 合成相關(guān)基因（ACAN、COL2A1）表達，增加ECM 分解相關(guān)基因（MMP3、MMP13、ADAMTS-4、ADAMTS-5）表達，而FGF2 中和抗體或siFGF2 對退行性變髓核細胞的作用趨勢與之相反（圖3）。以上結(jié)果說明FGF2 對髓核細胞ECM 代謝具有抑制合成、促進分解的作用。

圖3 FGF2對大鼠髓核細胞ECM 代謝的影響Fig.3 Effect of FGF2 on ECM metabolism of rat nucleus pulposus cells

2.4 FGF2 通過Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)控髓核細胞退變

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，active β-catenin在FGF2 重組蛋白刺激后表達水平顯著升高，而FGF2中和抗體或siFGF2可顯著降低IL-1β刺激所上調(diào)的active β-catenin 水平；此外，phospho-β-catenin表達趨勢與active β-catenin相反，總體β-catenin水平變化不明顯（圖4a、b）。以上結(jié)果說明，Wnt/β-catenin信號通路在IDD 時顯著激活，而這種激活作用可能與FGF2表達升高有關(guān)。

圖4 Wnt/β-catenin信號通路在FGF2調(diào)控IDD 中的作用Fig.4 Effect of Wnt/β-catenin signaling pathway on FGF2 regulating IDD

為明確Wnt/β-catenin 信號通路在FGF2 調(diào) 控IDD 中的作用，在FGF2 重組蛋白刺激髓核細胞基礎(chǔ)上添加Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑（PRI-724），流式細胞術(shù)、TUNEL 染色、蛋白質(zhì)印跡法及實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，在PRI-724 作用下，F(xiàn)GF2對髓核細胞引發(fā)的促凋亡作用減輕，而FGF2導(dǎo)致的髓核細胞ECM合成減少、降解增加等代謝異常也有所恢復(fù)（圖4c～ j）。以上結(jié)果說明Wnt/β-catenin信號通路是介導(dǎo)FGF2調(diào)控髓核細胞凋亡和ECM代謝紊亂的重要環(huán)節(jié)，提示FGF2可能通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控IDD。

3 討論

本研究基于大鼠原代髓核細胞開展細胞及分子實驗，通過促炎因子IL-1β 誘導(dǎo)髓核細胞退行性變構(gòu)建IDD 細胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，髓核細胞發(fā)生退行性變時FGF2 表達水平顯著上調(diào)，并且FGF2 能顯著促進髓核細胞凋亡，促進ECM 降解代謝、抑制ECM 合成代謝。FGF2 也稱堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），是FGF家族的重要成員。人類共有22種FGF蛋白，根據(jù)分泌形式分為自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌三大類，其中FGF2通過旁分泌形式發(fā)揮作用［10］。FGF2 在人體多處組織器官中表達，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。20 世紀(jì)90 年代有學(xué)者針對FGF2 在IDD 中的作用進行研究。Thompson 等［11］基于犬組織培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2 促進髓核ECM 成分蛋白聚糖合成；Nagano 等［12］報道FGF2促進大鼠髓核細胞增殖，提示FGF2 對椎間盤具有保護作用。然而，部分學(xué)者在髓核細胞及關(guān)節(jié)軟骨細胞中發(fā)現(xiàn)FGF2抑制ECM 合成代謝，促進分解代謝［13-16］，與本研究結(jié)果一致。值得注意的是，IDD的病理表現(xiàn)多樣，僅評估FGF2 對髓核ECM 代謝影響無法明確FGF2 對IDD 的作用。因此，本研究針對FGF2 調(diào)控髓核細胞凋亡及ECM 代謝展開探索，發(fā)現(xiàn)FGF2 顯著促進髓核細胞凋亡及ECM 降解代謝，抑制ECM 合成代謝，并由此從細胞層面提出FGF2促進IDD。

2018 年，Meo Burt 等［8］構(gòu)建基因過表達小鼠，發(fā)現(xiàn)FGF2 過表達促進小鼠骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生，伴隨軟骨組織中Wnt/β-catenin 信號通路激活；此外，該信號通路抑制劑顯著緩解FGF2 過表達誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎表型，提示FGF2 正向調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路，后者在FGF2 影響骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wnt/β-catenin 是生物進化中高度保守的信號通路，參與胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)維持。Wnt/β-catenin 信號通路包括細胞膜Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞質(zhì)β-catenin 信號穩(wěn)定及細胞核靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控3 部分，當(dāng)Wnt 未被激活時，細胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin 蛋白易被支架蛋白Axin、結(jié)腸腺瘤息肉易感蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3（GSK-3）及酪蛋白激酶1（CK1）組成的蛋白降解復(fù)合體磷酸化后降解；而Wnt 激活可抑制β-catenin 蛋白磷酸化，未被磷酸化的β-catenin 蛋白在細胞質(zhì)中穩(wěn)定存在，并逐步向細胞核內(nèi)移位，與轉(zhuǎn)錄因子T 細胞因子/淋巴樣增強因子結(jié)合，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄［17］。Wnt/β-catenin 信號異常與人體多種疾病息息相關(guān)，目前認(rèn)為其對椎間盤的作用主要是通過刺激髓核細胞凋亡，影響ECM 代謝平衡等誘導(dǎo)IDD［7］。此外，Xu 等［18］發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號對終板軟骨細胞的退行性變具有促進作用；Hao 等［19］在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號抑制可緩解椎間盤發(fā)生退行性變表現(xiàn)，延緩?fù)诵行宰冞M程；說明Wnt/β-catenin 信號對IDD 具有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號在介導(dǎo)FGF2調(diào)控髓核細胞凋亡及ECM 代謝紊亂中發(fā)揮重要作用，如前所述，位于細胞膜的Wnt 主要負責(zé)細胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而FGF2 蛋白作為FGF 家族旁分泌亞類中一員，通常經(jīng)由細胞膜FGF 受體實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，Wnt 和FGF 受體是否存在相互關(guān)聯(lián)尚未見文獻報道。本課題組將在后續(xù)研究中對FGF2 調(diào)控髓核細胞及IDD 所涉及的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制深入探索。

綜上所述，本研究通過動物和細胞實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)生IDD 的髓核細胞FGF2 表達水平升高，通過Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)髓核細胞凋亡及ECM代謝紊亂，從而加劇IDD進程，揭示了FGF2在椎間盤中的促退行性變作用及調(diào)控機制，為闡明IDD 發(fā)生機制提供了理論依據(jù)。