馬藺花器官表型特征及色素分析

李 楠 田小霞 毛培春 鄭明利 孟 林 云 嵐

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010000； 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所，北京 100097）

馬藺（Iris lacteavar.chinensis）為鳶尾科（Iridaceae）鳶尾屬（Iris）多年生宿根草本植物，廣泛分布于我國西北、華北、東北等地區(qū)［1-2］，因其適應(yīng)性強，花色艷麗，花期較長，株型美觀等優(yōu)良特性，已成為重要的城市園林綠化觀賞植物。目前國內(nèi)外對馬藺的研究主要集中在生態(tài)修復(fù)、土壤改良和藥用價值等方面［3-5］，但關(guān)于馬藺花色的研究較少，僅對馬藺花青素合成途徑的DFR基因生物信息學(xué)特征進行分析［6］，關(guān)于馬藺花色分類和色素組成卻未見深入的研究。花色是觀賞植物最重要的觀賞性狀之一，也是品種分類的重要依據(jù)［7］，因此研究馬藺花瓣呈色機理，對其優(yōu)良種質(zhì)資源挖掘、品種鑒定及新奇花色品種培育具有重要意義。

目前植物花色的研究主要集中在色素成分含量測定、花瓣呈色機理和花色分子育種等方面，如菊 花（Chrysanthemum morifolium）［8］、月 季（Rosachinchinensis）［9］、麗格海 棠（Rieger begonias）［10］和黃牡丹（Paeonia delavayivar.lutea）［11］等植物都有相關(guān)研究報道。植物花色的形成受到色素種類和含量、花瓣表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、液泡pH、金屬離子螯合作用等內(nèi)部因素［12-13］及光照溫度等外部環(huán)境因素［14］的影響，其中最重要的是色素種類和含量，如類黃酮、類胡蘿卜素和花色苷等［15-16］。

以往研究將馬藺花色區(qū)分為淡藍(lán)色、藍(lán)紫色或深藍(lán)紫色［17-18］，但有關(guān)馬藺花色素組分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究鮮見報道。故本研究通過系統(tǒng)聚類和相關(guān)性分析等方法，對中國6個省市不同生境條件下22 份馬藺種質(zhì)材料的花色、垂瓣花斑和花葶等表型性狀進行測定描述，結(jié)合色素比較分析，揭示馬藺花色與色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)間相關(guān)關(guān)系，明確影響花色形成的主要物質(zhì)，以期為闡明馬藺花色呈色機理奠定基礎(chǔ)，為馬藺新種質(zhì)創(chuàng)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

將收集到的中國6 個省市不同生境條件下22 份馬藺種質(zhì)資源種子（見表1），于2018 年室內(nèi)育苗后單株定植移栽到位于北京市昌平區(qū)小湯山鎮(zhèn)的國家精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)研究示范園草種質(zhì)資源圃（40°9′16″N，116°24′32″E），生長環(huán)境養(yǎng)護管理一致。

表1 馬藺種質(zhì)材料種源及原生境信息Table 1 Provenance and original habitat information of I. lactea germplasm resources

1.2 方法

1.2.1 花部性狀的觀測

試驗于2022年4月20日—5月20日在國家精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)研究示范園草種質(zhì)資源圃進行，選擇晴天上午對供試的22份馬藺種質(zhì)材料（見表1）5年生的健康生長植株于初花期測定花葶高度，盛花期測定花的其他表型性狀（見表2）。重復(fù)3次，取平均值。

表2 馬藺花部表型性狀及描述Table 2 Phenotypic traits and description of I. lactea flower

在室內(nèi)自然光照下（無陽光直射），分別將旗瓣和垂瓣置于白色A4 紙上，用英國皇家園藝比色卡（RHS Color Chart）與其正面對比，用比色卡上最接近花色的代碼表示其顏色，確定所屬色系范圍和編號，初步確定旗瓣和垂瓣的花色；然后再用分光色差儀（NF555，日本）在C/2°光源下按CIE Lab表色系統(tǒng)測定垂瓣和旗瓣顯色位置（見圖1）的明度（L*）、紅度（a*）和藍(lán)度（b*），計算彩度（c*）和色相角（h）。重復(fù)3 次，取平均值。計算公式：c*=（a*2+b*2）1/2；h=arctan（b*/a*）。

圖1 花瓣測色部位A.垂瓣；B.旗瓣。Fig.1 Measuring parts for petal color A.Fall；B.Standard.

1.2.2 色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

每份馬藺種質(zhì)材料選擇10 個單株，每個單株采集10 朵花，隨后立即放入冰盒。每份去除雄蕊后，選擇前2/3 部位混合稱取0.1 g，置于2 mL離心管，經(jīng)液氮速凍后，放入冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

花瓣類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定參考高俊鳳［19］的方法。取花瓣0.1 g，置于10 mL 95%乙醇（NR-分析純）的溶液中，避光浸提48 h 直到花瓣變白，取浸提液，用分光光度計分別測定波長為665、649、470 nm 的吸光值（A665，A649，A470），按如下公式計算：

式中：Ca、Cb、C分別為葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度（mg·L-1），V為提取液體積（mL），m為樣品鮮質(zhì)量（g）。

類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法［20］測定，取花瓣0.1 g，加入2 mL 60%乙醇溶液充分研磨，60 ℃振蕩提取2 h，于10 000g常溫離心10 min，取上清液；分別吸取540 μL 上清液和蒸餾水置于2 個2 mL 離心管，各加30 μL 5% NaNO2溶液混勻；靜置6 min 后分別加30 μL 10% AlNO3溶液，5 min 后再加400 μL 5% NaOH 溶液，室溫靜置15 min 后用分光光度計測定510 nm 處的吸光值，按如下公式計算：

式中：ΔA類黃酮、A測定、A空白分別為類黃酮、測定組和空白組的吸光值，V樣總為加入提取液體積（mL），m為樣品鮮質(zhì)量（g）。

花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用pH 示差法［21］測定。取花瓣0.1 g，加入1 mL 含1% HCl 的甲醇溶液充分研磨，使用金屬震蕩儀震蕩4 h 后，于8 000g常溫離心10 min，取上清液；每個樣品各取100 μL上清液于2 mL 離心管中，分別加入pH=1.0 的KCl-HCl緩沖液和pH=4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖液900 μL，充分搖勻，40 ℃水浴20 min，用分光光度計分別測定波長為530 nm 和700 nm 處的吸光值（A530，A700），按如下公式計算：

式中：ΔA花色苷為花色苷吸光值，V為提取液體積（mL），M為花色苷的相對分子質(zhì)量（g·mol-1），F(xiàn)為稀釋倍數(shù)，ε為花色苷的摩爾消光系數(shù)（L·mol-1·cm-1），d為比色皿光徑（cm），m為樣品鮮質(zhì)量（g）。

各指標(biāo)測定時每份材料3次生物學(xué)重復(fù)，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel、IBM SPSS Statistics、Origin 2021 軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖。采用組間聯(lián)接法對測得的垂旗瓣測色參數(shù)L*、a*和b*值進行系統(tǒng)聚類分析，采用皮爾遜系數(shù)對垂旗瓣顏色參數(shù)和色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行相關(guān)性分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法對各指標(biāo)數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬藺花色表型特征

利用CIE Lab 測色體系，測得22 份馬藺種質(zhì)材料的旗瓣和垂瓣測色參數(shù)L*、a*和b*值并對其標(biāo)準(zhǔn)化處理，組間聯(lián)接法的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)歐式距離為5.5 時，可將22 份馬藺種質(zhì)材料花色劃分為4 大色系（見圖2），即淺藍(lán)色、淺藍(lán)紫色、深藍(lán)紫色和紫羅蘭色。其中深藍(lán)紫色的種質(zhì)材料有8份，占比達(dá)36.26%，淺藍(lán)紫色有7份，占比31.82%，紫羅蘭色有5 份，占比22.73%；數(shù)量最少的是淺藍(lán)色系，僅有2份。

圖2 基于L*、a*和b*值的22份馬藺種質(zhì)花瓣花色表型聚類分析Fig.2 Cluster analysis of petal color phenotypes of 22 I. lactea germplasm resources based on L*，a* and b* values

通過CIEL*、a*和b*顏色體系得到22 份馬藺種質(zhì)資源（4 大色系）花色參數(shù)分布范圍（見圖3）。馬藺種質(zhì)垂瓣和旗瓣顏色的L*值和b*值隨花色加深而逐漸下降，而a*值隨花色加深呈上升趨勢。各色系的垂瓣和旗瓣L*值均在20～70，a*值在0～50，b*值在-5～-55波動。

圖3 馬藺種質(zhì)4大色系的花色L*、a*和b*值箱式圖A.旗瓣L*值；B.垂瓣L*值；C.旗瓣a*值；D.垂瓣a*值；E.旗瓣b*值；F.垂瓣b*值。Fig.3 The box plot of L*，a* and b* values of four color lines I. lactea germplasm resources A.Standard L* value；B.Fall L* value；C.Standard a* value；D.Fall a* value；E.Standard b* value；F.Fall b* value.

馬藺種質(zhì)資源4 大色系中，淺藍(lán)色系花色L*最高，其次為淺藍(lán)紫色系和深藍(lán)紫色系，明度最低的是紫羅蘭色系，說明馬藺花色越淺，L*值越高，4 大色系間無重疊。a*值從高到低依次為紫羅蘭色系、深藍(lán)紫色系、淺藍(lán)紫色系和淺藍(lán)色系，說明馬藺花色越深紅度越大，其中淺藍(lán)色系和淺藍(lán)紫色系分布集中，深藍(lán)紫色系和紫羅蘭色系分布范圍大；而b*值最高的是淺藍(lán)色系，從高到低依次為淺藍(lán)色系、淺藍(lán)紫色系、深藍(lán)紫色系和紫羅蘭色系，說明藍(lán)度隨馬藺花色加深而增加，其中紫羅蘭色系分布最集中，4大色系均分布在負(fù)值范圍內(nèi)。

由圖4可知，馬藺旗瓣和垂瓣花色均集中分布在第Ⅳ象限，在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ象限沒有分布，4 大色系的分布規(guī)律大致呈條帶狀。其中，旗瓣淺藍(lán)紫色系和深藍(lán)紫色系存在部分重疊。a*和L*呈負(fù)相關(guān)，即隨紅度的增加，淺藍(lán)色、淺藍(lán)紫色、深藍(lán)紫色和紫羅蘭色的明度逐漸減小。4 大色系的b*和L*間呈正相關(guān)，即隨b*值增加，L*值逐漸增加。4 大色系的c*值與L*值間呈負(fù)相關(guān)。旗瓣和垂瓣的L*值均隨c*值增大而減小。其中，旗瓣L*值隨c*值增大而變小，且斜率較大，擬合線性方程為：L*=-0.80c*+78.60（R2=0.83）；垂瓣的趨勢類似于旗瓣，但c*和L*斜率更小，擬合線性方程：L*=-0.59c*+69.78（R2=0.76）。

圖4 馬藺種質(zhì)資源花色表型分布A.旗瓣a*與旗瓣b*分布；B.垂瓣a*與垂瓣b*分布；C.旗瓣a*與旗瓣L*分布；D.垂瓣a*與垂瓣L*分布；E.旗瓣b*與旗瓣L*分布；F.垂瓣b*與垂瓣L*分布；G.旗瓣c*與旗瓣L*分布；H.垂瓣c*與垂瓣L*分布。Fig.4 Flower color phenotype distribution of I. lactea germplasm resources A.The distribution of standard a* and standard b*；B.The distribution of fall a* and fall b*；C.The distribution of standard a* and standard L*；D.The distribution of fall a* and fall L*；E.The distribution of standard b* and standard L*；F.The distribution of fall b* and fall L*；G.The distribution of standard c* and standard L*；H.The distribution of fall c* and fall L*.

2.2 馬藺花器官表型性狀分析

馬藺種質(zhì)資源花器官表型性狀的分析結(jié)果表明，4大色系的馬藺種質(zhì)資源花器官表型性狀存在顯著差異（P<0.05）（見表3）。馬藺種質(zhì)資源花色越深，花瓣越大。紫羅蘭色系和深藍(lán)紫色的垂瓣長度和寬度均顯著高于藍(lán)紫色系和淺藍(lán)色系，紫羅蘭色系的垂瓣長度和寬度的平均值分別為5.98、1.27 cm，較淺藍(lán)色系顯著增加了30.00%和44.32%（P<0.05）；紫羅蘭色系和深藍(lán)紫色的旗瓣長度顯著高于藍(lán)紫色系和淺藍(lán)色系；淺藍(lán)紫色系的旗瓣寬度顯著低于其他色系，其中紫羅蘭色系的旗瓣長度和寬度最大，分別為5.68 和0.97 cm，較淺藍(lán)色系的增加了17.11%和21.25%；紫羅蘭色系平均花徑（5.09 cm）與淺藍(lán)色系的花莖呈顯著差異（P<0.05），為淺藍(lán)色系的1.17倍。

表3 馬藺種質(zhì)各色系花器官表型性狀Table 3 Phenotypic traits of floral organ of different color lines of I. lactea germplasm resources

隨花色的加深，花葶高度呈上升趨勢，紫羅蘭色系花葶高度達(dá)29.10 cm，較淺藍(lán)色系的增加了8 cm，且與淺藍(lán)色系的花葶高度呈顯著差異（P<0.05）。垂瓣花斑隨顏色的增加而減小，其中，紫羅蘭色系的平均垂瓣花斑大小（0.26）顯著低于其他色系，為淺藍(lán)色系花瓣的81.25%。

2.3 馬藺花瓣色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

馬藺種質(zhì)資源盛花期花瓣的類胡蘿卜素、類黃酮及花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析結(jié)果如圖5 所示，類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體處于較低水平，小于0.006 5 mg·g-1，且從高到低依次為淺藍(lán)色、淺藍(lán)紫色、深藍(lán)紫色、紫羅蘭色，其中淺藍(lán)色系類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，達(dá)0.004 9 mg·g-1，其他3 大色系的類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于0.001 5 mg·g-1。特別是紫羅蘭色系中沒有檢測到類胡蘿卜素（見圖5A）。類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.513 3～1.343 8 mg·g-1，其中紫羅蘭色系類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高且與淺藍(lán)紫色系和淺藍(lán)色系類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著差異（P<0.05），與深藍(lán)紫色系類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著（P>0.05）。淺藍(lán)色系類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.660 5 mg·g-1，較紫羅蘭色系類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低了44.59%（見圖5B）。花色苷作為一類重要的類黃酮物質(zhì)，對花色呈現(xiàn)非常重要。馬藺花瓣花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢與類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢相似（見圖5C），花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)從大到小依次為紫羅蘭色、深藍(lán)紫色、淺藍(lán)紫色、淺藍(lán)色，其中紫羅蘭色系花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.433 3 mg·g-1）顯著高于其他色系（P<0.05），其次是深藍(lán)紫色系和淺藍(lán)紫色系，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.223 5～0.326 7 mg·g-1，而淺藍(lán)色系花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.173 7 mg·g-1。

圖5 各色系馬藺花瓣色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)A.類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)；B.類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)；C.花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)。Fig.5 Pigment mass fraction of petals of different color lines of I. lactea A.Mass fraction of carotenoid；B.Mass fraction of flavonoid；C.Mass fraction of anthocyanin.

2.4 馬藺垂旗瓣顏色參數(shù)與色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性

由表4可知，馬藺種質(zhì)資源垂旗瓣顏色參數(shù)與花瓣中的色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)系密切，隨著類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)特別是其中的花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高，垂旗瓣的明度L*降低、紅度a*升高、藍(lán)度b*降低、彩度c*升高和色相角h升高。垂旗瓣L*與類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)（P<0.05）、與類黃酮和花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）；垂旗瓣a*與類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)、與類黃酮和花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；垂旗瓣b*與類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)、與類黃酮和花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)；垂旗瓣c*與類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）、與類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)（P<0.05）、與花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；垂旗瓣h與類胡蘿卜素呈負(fù)相關(guān)、與類黃酮和花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。

表4 馬藺種質(zhì)資源CIE Lab參數(shù)與色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的皮爾遜相關(guān)性Table 4 Pearson correlation analysis between CIE Lab parameters and the mass fraction of pigment in I. lactea germplasm resources

3 討論

花色是園林植物最重要的觀賞性狀，關(guān)于花色測定方法主要有目測法、比色卡比色法和色差儀測色法［22-23］。目測法因顏色分類標(biāo)準(zhǔn)的不同和測色人員的視覺差異，很難對花色特別是交叉色系進行準(zhǔn)確判定［24］。比色卡比色法是園林植物測色研究應(yīng)用最廣泛的方法，但測色環(huán)境的背景顏色和光照要求相對比較嚴(yán)格［25-26］。色差儀測色法具有精度高、環(huán)境因素影響小、顏色數(shù)據(jù)化等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于觀賞植物花色測定［27-29］。因此，本研究采用了比色卡比色法結(jié)合色差儀測色法對22份馬藺種質(zhì)材料的花旗瓣和垂瓣色彩參數(shù)進行測量分析，并依據(jù)色彩參數(shù)的聚類結(jié)果將供試的22 份馬藺種質(zhì)材料花瓣分為4 大色系，即淺藍(lán)色、淺藍(lán)紫色、深藍(lán)紫色和紫羅蘭色。這與王育青［18］對馬藺花器官表型的研究結(jié)果基本一致。

花色差異與花瓣色素成分和比例密切相關(guān)。植物花色素主要有類胡蘿卜素、類黃酮和甜菜色素［30-31］。類胡蘿卜素是一類脂溶性的天然色素，絕大多數(shù)呈黃色、橙色和紅色［32］。類黃酮即黃酮類化合物，包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、查爾酮、花色苷和黃烷酮類6大類，使植物呈藍(lán)色、紅色、紫色等顏色［33］。其中，類黃酮中的花色苷對植物花色表達(dá)發(fā)揮著重要作用［34］。Conner 等［34］研究發(fā)現(xiàn)青銅色和粉色漿果中花色苷含量低于100 mg·g-1，而高度色素化的黑漿果中花色苷含量超過5500 mg·g-1，且花色苷含量隨花色加深而增加。本研究結(jié)果表明，22 份馬藺種質(zhì)花瓣中只有少量種質(zhì)含有類胡蘿卜素，且隨花色加深呈下降趨勢，可見類胡蘿卜素對馬藺花瓣呈色的影響較小；類黃酮和花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨花色加深而逐漸增加，表明類黃酮和花色苷是決定馬藺花瓣顏色的主要呈色物質(zhì)，且垂瓣和旗瓣中花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同是引起馬藺花色表型特征變化的重要因素。

花色苷含量不同會影響植物花色明度（L*）、紅度（a*）、藍(lán)度（b*）和彩度（c*）的變化［35］。本研究22 份馬藺種質(zhì)垂旗瓣的L*值由低到高依次為紫羅蘭色、深藍(lán)紫色、淺藍(lán)紫色和淺藍(lán)色，且L*值與花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，即隨著花色苷的積累明度下降，這與Lu 等［36］對盆栽多花菊（Chrysanthemum×morifolium）、Li 等［37］對草莓屬（Fragaria）植物花色苷含量對花色明度影響的研究結(jié)果一致，說明花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化是影響馬藺花色明暗變化的重要因素之一。花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與馬藺垂旗瓣的紅度、藍(lán)度及彩度值相關(guān)性分析結(jié)果表明，隨著花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，垂旗瓣紅度和藍(lán)度值增加，這與Junka等［38］報道萬代蘭屬（Vanda）植物花瓣a*和b*值與花色苷含量呈極顯著正相關(guān)的結(jié)論相符。隨著花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，馬藺垂旗瓣的彩度值增加，這與Zhu 等［39］報道睡蓮屬（Nymphaea）植物c*值與花色苷含量呈顯著正相關(guān)的結(jié)論一致，即花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與彩度值呈顯著正相關(guān)。

綜上所述，通過對中國6個省區(qū)不同生境條件22份馬藺種質(zhì)花器官表型特征及色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析結(jié)果表明，不同色系馬藺花器官表型特征和色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異，即花瓣顏色越深，花瓣越大，垂瓣花斑越小；隨著馬藺花色越紫，類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，類黃酮和花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)則逐漸上升，并與測色參數(shù)L*、a*和b*值間存在一定相關(guān)性，結(jié)果可為馬藺種質(zhì)資源花色形成機制的研究及新種質(zhì)的創(chuàng)制奠定重要基礎(chǔ)。