褪黑素對消炎痛所致胃潰瘍小鼠的保護作用機制

田華, 張占華, 李曉利, 劉奇, 黃靜

西安交通大學附屬紅會醫院 1.老年病科,2.急診科,3.兒科,4.臨床藥學科,陜西西安 710054

胃是容易受到外界因素影響的器官,各種因素都會導致胃潰瘍形成[1-2]。臨床上消炎痛可引起胃酸釋放和胃蛋白酶活性增加,黏液層和碳酸氫鹽釋放減少;同時也引起胃黏膜脂質過氧化和活性氧(reactive oxygen species,ROS)形成增加[3]。褪黑素是一種有效的ROS代謝清除劑和抗氧化劑,可促進胃腸道分泌、運動、消化和吸收[4]。此外,褪黑素還具有抗炎功能,有助于保護胃腸黏膜[5];但是褪黑素在消炎痛誘導胃潰瘍中作用未見相關報道。本研究旨在探討褪黑素在消炎痛誘導小鼠胃潰瘍模型中的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器和主要試劑

光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司);總抗氧化態(total antioxidant status,TAS)、總氧化態(total oxidant status,TOS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6、IL-10檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);消炎痛、兔源多克隆核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和Caspase-3抗體(美國Sigma公司)。

1.2 實驗動物及分組

40只5周齡雄性BALB/c小鼠(22～28 g),購于西安交通大學動物中心,室溫下自由進食和飲水。將BALB/c小鼠隨機均分成對照組、潰瘍組、低劑量褪黑素組和高劑量褪黑素組,每組10只。對照組僅腹腔注射二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)。潰瘍組小鼠皮下注射2.5 g/L消炎痛NaHCO3溶液[6]。低劑量、高劑量褪黑素組分別用褪黑素1、5 mg/kg預處理,24 h后注射消炎痛。造模成功7 h后,全麻處死各組小鼠,收集胃組織待用。

1.3 ELISA檢測

各組小鼠胃組織在10%冰冷磷酸鹽緩沖液中勻漿,4 000 r/min離心,取上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測胃組織中TAS、TOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平。氧化應激指數(oxidative stress index,OSI)=TOS/TAS。

1.4 組織病理學分析

各組小鼠胃組織用10%福爾馬林緩沖液固定,石蠟包埋,4 μm連續切片。HE染色,顯微鏡下評估各組胃組織損傷程度[7]。

1.5 免疫印跡分析

提取各組小鼠胃組織100 mg,加入全細胞裂解液2 mL,勻漿、超聲破碎,BCA法進行蛋白定量,制備成電泳樣品。取30 μg電泳樣品進行SDS-PAGE電泳,然后轉至PVDF膜上。經5%牛奶孵育1 h。分別用兔源NF-κB(1∶1 000)和Caspase-3(1∶1 000)4 ℃孵育3 h。用山羊抗兔二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h。采用Quantity one圖像分析軟件對目標條帶進行分析。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠TAS、TOS、OSI及炎癥細胞因子比較

與對照組比較,其他各組TAS、TOS、OSI水平升高(P<0.05);潰瘍組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平升高(P<0.05)。與潰瘍組比較,高劑量褪黑素組TAS水平升高,TOS和OSI水平降低(P<0.05);低劑量和高劑量褪黑素組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平降低(P<0.05)。與低劑量褪黑素組比較,高劑量褪黑素組TNF-α和IL-1β降低(P<0.05;表1)。

表1 褪黑素對小鼠TAS、TOS、OSI及炎癥細胞因子的影響

2.2 褪黑素對小鼠胃潰瘍的影響

對照組胃黏膜層由單層柱狀上皮組成,排列整齊。潰瘍組胃黏膜層上皮壞死、脫落、炎癥細胞浸潤及出血嚴重。低劑量褪黑素組胃黏膜層上皮壞死、脫落、炎癥細胞浸潤及出血較潰瘍組改善。高劑量褪黑素組胃黏膜層上皮壞死、脫落、炎癥細胞浸潤及出血較低劑量褪黑素組減輕(圖1)。

圖1 各組小鼠胃組織病理檢測結果(HE染色,200×) 箭頭表示出血處。

2.3 褪黑素對小鼠NF-κB和Caspase-3的影響

與對照組比較,其他各組小鼠胃組織中NF-κB和Caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)。與潰瘍組比較,高劑量褪黑素組胃組織中NF-κB和Caspase-3蛋白表達水平降低(P<0.05;圖2、表2)。

圖2 各組小鼠胃組織典型NF-κB和Caspase-3表達

表2 各組小鼠NF-κB和Caspase-3比較

3 討 論

胃潰瘍為常見的胃腸道疾病,臨床上主要是由于服用非甾體抗炎藥而導致出血和黏膜病變[8]。研究證實,消炎痛會引起嚴重胃腸道損傷和氧化應激[9];消炎痛誘導胃潰瘍主要是通過ROS生成[10]。臨床上,胃潰瘍通常采用組胺-2受體阻滯劑或質子泵抑制劑治療,但長期使用會引起不良反應。研究表明,褪黑素在應激性潰瘍模型中對胃潰瘍有保護作用[5],但是對于消炎痛引起胃潰瘍損傷的機制仍不明確。

消炎痛誘導潰瘍模型顯示胃潰瘍過程中ROS產生,導致細胞蛋白氧化和抗氧化劑耗竭[11]。ROS也可引起氧化損傷,破壞抗氧化防御系統。TAS被廣泛用于測定總抗氧化能力[12]。OSI是一種能顯示脂質、蛋白質氧化和DNA損傷指標,而DNA損傷是由于氧化劑增加或抗氧化劑減少而產生的非代償性自由基引起的。本研究結果顯示,在消炎痛誘導潰瘍中,褪黑素升高TAS,降低TOS和OSI。NF-κB在潰瘍愈合過程中起著重要作用,胃潰瘍期間組織中NF-κB激活增加[13]。NF-κB也在調節免疫反應中起著重要作用,并觸發IL-6、IL1-β和TNF-α等促炎癥細胞因子轉錄上調[14]。在本研究中,褪黑素可能通過NF-κB信號通路降低誘導期炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)水平來減輕消炎痛誘導胃潰瘍。細胞凋亡是免疫系統發育和組織重建過程中,清除正常細胞的調節過程。細胞凋亡調節障礙與多種疾病有關。在消炎痛誘導消化性潰瘍研究中發現Caspase-3水平升高[15]。在另一項研究中,褪黑素能減少黑質中線粒體DNA損傷,并減少ROS產生,抑制細胞凋亡[16]。在本研究中,與對照組比較,潰瘍組Caspase-3水平升高,褪黑素預處理后,Caspase-3水平降低。褪黑素的胃潰瘍保護機制可能是通過抑制凋亡而發揮作用。

總之,本研究結果提示,褪黑素可能通過NF-κB來調節炎癥細胞因子,以及調節細胞凋亡在消炎痛誘導胃潰瘍小鼠中發揮保護作用。