分散固相萃取-超聲波輔助提取葉菜型甘薯液中黃酮化合物的方法優(yōu)化

王和壽

（1.寧德市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心，福建寧德 352100；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南方薯類科學觀測實驗站，福建福州 350013）

0 引言

葉菜型甘薯是以藤蔓莖尖生長點及其以下10～15 cm的莖段作為蔬菜食用的甘薯專用類型。中國預(yù)防醫(yī)學科學院研究表明，與芹菜、番茄、菠菜等13種蔬菜相比，其蔓尖部分蛋白質(zhì)、維生素、鐵等13項營養(yǎng)物質(zhì)含量均位居首位，而且在莖葉部位富含多酚、黃酮類物質(zhì)[1]。黃酮化合物是葉菜型甘薯中重要的一類具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等生物活性[2]，在葉菜型甘薯研究中備受關(guān)注。傳統(tǒng)黃酮化合物提取方法主要有浸漬法、煎煮法、熱回流提取法等，但這些方法提取過程大多比較繁瑣，提取液和殘渣分離麻煩[3]，一定程度上減緩了富含黃酮化合物的優(yōu)質(zhì)葉菜型甘薯選育進程以及葉菜型甘薯中黃酮化合物的研究。所以，建立一種簡便、快捷的葉菜型甘薯中黃酮化合物的提取方法十分必要。

隨著提取技術(shù)的發(fā)展，酶提取法、微波萃取技術(shù)、超聲波輔助提取法等新手段被應(yīng)用于植物中黃酮的提取。超聲波提取法是利用超聲波破壞植物細胞壁和細胞膜，加速細胞質(zhì)中黃酮化合物溶出，從而達到更有效的提取。該方法具有提取率高、操作簡便，并且對黃酮化合物結(jié)構(gòu)不會造成損害等優(yōu)點。分散固相萃取方法是一種用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測的快速樣品前處理技術(shù)。該方法具有回收率高、分析速度快、污染小、操作簡便等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、獸藥殘留的檢測中。本文結(jié)合超聲波輔助提取技術(shù)和QuChERS方法，對甘薯葉片中主要的蘆丁、異槲皮苷、二氫槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等7種黃酮化合物進行提取[4]，對料液比、提取試劑濃度及超聲提取時間進行優(yōu)化，以期建立一種簡便、快捷、有效的葉菜型甘薯中黃酮化合物的提取方法。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗材料

試驗材料選用的葉菜型甘薯品種為福菜薯18，由福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所提供。

1.2 儀器與藥品試劑

1.2.1 儀器。三重四級桿質(zhì)譜儀LCMS8050（日本島津制作所），超純水機Direct-Q5（德國默克公司），冷凍離心機3-18KS（德國默克公司），超聲波清洗儀KQ-500E（昆山市超聲儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9245A（上海齊欣科學儀器有限公司）。

1.2.2 藥品試劑。凈化劑C18，40～63 μm；蘆丁、異槲皮苷、二氫槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等標準溶液，純度均在99.99%以上；甲醇、乙腈為色譜級。上述藥品均購于上海安譜科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理。將田間獲得的樣品經(jīng)干燥、粉碎、過篩（100目篩）制備成甘薯葉粉末。稱取0.2 g甘薯葉粉末，置于10 ml離心管中，加入10 ml甲醇+水（80+20，v+v），并充分漩渦振蕩。于60℃水浴超聲20 min，5 000 r/min，離心5 min。吸取2 ml上清液于10 ml離心管內(nèi)，往管內(nèi)加入0.2 g的C18凈化劑，充分振蕩后，5 000 r/min，離心3 min。吸取1 ml上清液過0.45 μm濾膜，待上機測定。

1.3.2 色譜條件。色譜柱：C18（2.1 mm×100 mm）。流動相：（A）水和（B）乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，80%A；1～3 min，80%A～50%A；3～6 min，50%A～10%A；6～7 min，10%A；7～7.1 min，10%A～80%A；7.1～9 min，80%A。流速：0.4 ml/min。柱溫：40℃。進樣體積：5 μl。霧化氣流量：3L/min。接口溫度：350℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件。葉菜型甘薯中蘆丁、異槲皮苷、二氫槲皮素、斛皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等7種黃酮化合物的質(zhì)譜條件（表1）。

表1 各黃酮化合物質(zhì)譜條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

式中，ω為黃酮化合物的得率（%）；

C為待測溶液中某黃酮化合物的濃度（ng/ml）；

F為稀釋因子；

V為定容體積（ml）；

M為樣品的質(zhì)量（g）。

利用SPSS.19對文中數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳料液比的篩選

按照1.3.1的試驗方法，分別精確稱取0.05 g、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.6 g、1.0 g葉菜型甘薯干粉，加入10 ml甲醇+水（80+20，v+v），用于檢測不同料液比下各黃酮化合物的得率。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，福菜薯18中不含有二氫槲皮素，另外6種黃酮化合物的得率隨著料液比的增加，均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。其中，蘆丁和異槲皮素在料液比達到0.2 g/10ml時，得率達到最高，分別為2.16 μg/g、16.27 μg/g。槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚在料液比為0.1 g/10ml時，得率最高，依次為0.012 μg/g、0.37 μg/g、0.27 μg/g、0.13 μg/g。從6種黃酮化合物總量來看，當料液比為0.2 g/10ml時，總黃酮得率達到最高，為18.93 μg/g（表2）。因此，選擇0.2 g/10ml作為黃酮化合物提取的最佳料液比。

表2 不同料液比對各黃酮化合物得率的影響（μg/g）

2.2 最佳甲醇濃度的篩選

按照1.3.1的試驗方法分別檢測60%、70%、80%、90%、100%甲醇含量對黃酮化合物得率的影響。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當甲醇濃度逐漸增加時，蘆丁等黃酮化合物的得率均隨之增加，當甲醇濃度達到80%時，蘆丁等黃酮化合物測的含量最高，依次為2.914 μg/g、16.279 μg/g、0.0096 μg/g、0.406 μg/g、0.0257 μg/g、0.128 μg/g（表3）。繼續(xù)增加甲醇濃度，蘆丁、異槲皮素、槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚等黃酮化合物得率開始下降，降幅分別達到13.21%、14.37%、24.69%、12.56%、19.84%、6.25%。因此，選擇80%甲醇濃度為最佳試驗條件。

表3 不同提取濃度對各黃酮化合物得率的影響（μg/g）

2.3 最佳超聲時間的確定

按照1.3.1的試驗方法，分別考察10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min超聲時間對不同黃酮化合物得率的影響。當超聲提取時間為20 min和60 min時，蘆丁、槲皮素、槲皮苷、柚皮素、山奈酚5種黃酮化合物的得率高于其他試驗組，這兩組所測得的得率差異不顯著（p＞0.05）。槲皮素的得率隨著超聲提取時間的延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，在60 min時測得的得率最高，為0.57 μg/g。從6種黃酮化合物總量來看，在20 min時黃酮得率達到23.69 μg/g，高于30 min時，但與40 min、50 min、60 min測得的總黃酮得率差異不顯著（p＞0.05）（表4）。綜合考慮提取效率，選擇提取時間20 min時為最佳試驗條件。

表4 不同超聲時間對各黃酮化合物得率的影響（μg/g）

2.4 驗證試驗

按照1.3.1試驗方法，在料液比0.2 g/10ml、甲醇體積分數(shù)80%、超聲時間20 min條件下進行驗證試驗。試驗結(jié)果表明，蘆丁、異槲皮素、槲皮苷、槲皮素、柚皮素、山奈酚、總黃酮的得率依次為3.01 μg/g、13.87 μg/g、0.0102 μg/g、0.375 μg/g、0.023 μg/g、0.124 μg/g、17.532 μg/g。

3 結(jié)論

本研究所建立的黃酮化合物分散固相萃取方法，具有操作簡便、快捷、經(jīng)濟、安全等特點。該方法可用于葉菜型甘薯中各黃酮化合物的提取，能夠為葉菜型甘薯品質(zhì)成分的提取與檢測提供科學參考，為選育工作及黃酮化合物的結(jié)構(gòu)與代謝途徑提供有力的技術(shù)手段。