超高壓聯合月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽對Listeria innocua的殺菌效果

陳君玉，李 婷，李 想，饒 雷，吳曉蒙,

（1.四川成都中農大現代農業產業研究院，四川 成都 610047；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，農業農村部果蔬加工重點實驗室，食品非熱加工北京市重點實驗室，北京 100083；3.四川旅游學院，四川 成都 610100）

單核細胞增生李斯特菌（以下簡稱單增李斯特菌）是一種革蘭氏陽性食源性病原菌，是李斯特菌屬的一種。先前研究表明，單增李斯特菌對酸和鹽具有高度抗性，甚至可以在冷藏食品中生長[1-3]。一些研究報告稱，最常由李斯特菌引起污染的食物包括肉類、牛奶、水產品和蔬菜，尤其是以肉類和肉制品為甚[4]。美國疾病控制與預防中心幾乎每年都有關于由李斯特菌污染食品而引起的流行病的相關報道。因食源性病原菌能夠在包括加工食品在內的不同類型食品中生存，因此，控制病原菌是食品行業的一大挑戰。

超高壓（high pressure processing，HPP）是一種非熱加工技術，是指在耐受高強度壓力的密封容器中放入軟包裝的食品，借助靜態液體如水、油等施加100～1 000 MPa的靜水壓力并保持一段明間，從而達到滅菌、保鮮、提取有效成分等效果[5-7]。它主要通過高壓改變微生物細胞的形態，造成蛋白質（酶）的不可逆損傷以及細胞內容物的積累，最終導致微生物死亡[8-9]。HPP的主要優點是在環境介質溫度穩定的情況下，在很大程度上能夠破壞食品中存在的致病微生物和共生微生物，但不會破壞共價鍵，不會損害食品的感官和感官特性以及營養價值，最終提高食用價值[8,10-11]，可以在不添加化學防腐劑的情況下達到保鮮以及最低限度加工食品中病原菌的要求[7]。目前，HPP已被廣泛應用于果蔬、肉類、海鮮、乳制品和蛋制品等多種食品的加工，并在國內外得到商業化應用[7,12]。

研究發現，不同的微生物耐壓性各異。例如，在25 ℃條件下，300 MPa處理10 min可使豬肉漿中的空腸彎曲桿菌減少6（lg（CFU/g））[13]，但一些耐壓性的細菌，如單增李斯特菌，在600 MPa下處理20 min后，僅減少4.6（lg（CFU/g））[14]。因HPP成本與壓力呈正相關，為降低高壓技術所需的生產成本，探索降低殺菌壓力的協同方法也成為了研究熱點[15]。其中，將HPP與抗菌劑結合是一種優異的協同殺菌方法。這種柵欄效應在食品加工中具有許多優勢，包括降低能源成本和生產更安全、更美味的產品[16-18]。

月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽（lauroyl arginate ethyl ester hydrochloride，LAE）是一種具有廣譜抑菌性的陽離子表面活性劑，它與帶負電的微生物細胞表面有強相互作用，可以誘導微生物的電位紊亂和結構變化，進一步影響微生物代謝過程，但仍不足以引起細胞裂解[19-21]。研究表明，LAE對人體無顯著毒性，它會轉化為月桂酸和精氨酸等無毒物質，其中，精氨酸在尿素循環中可降解為尿素和鳥氨酸，并最終通過哺乳動物的生物化學途徑轉化為CO2；而月桂酸作為一種人類飲食成分，存在于許多不同的植物中，最終可進入脂肪酸代謝中[22]，是一種安全的產品，基于此，LAE先后被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）、歐洲食品安全局、國際食品法典委員會、澳大利亞食品標準局等批準為“GRAS”（generally recognized as safe），目前，LAE已作為一種食品添加劑應用于肉類、家禽產品以及其他領域[23]，具有廣泛的應用前景和巨大的市場需求。

Listeria innocua為李斯特菌屬的一種非致病菌，與致病性的單增李斯特菌具有共同的毒力祖先，本實驗旨在研究單獨LAE處理或與HPP結合對L.innocua的影響，討論LAE結合HPP在食品中用于控制食源性微生物的潛力，為食品中單增李斯特菌的有效控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

Listeria innocua（BNCC 186087） 北納創聯生物技術有限公司；腦心浸液瓊脂（brain heart infusion agar，BHIA）培養基 英國Oxoid公司；腦心浸液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）培養基、戊二醛溶液 北京索萊寶科技有限公司；LAE（HW18K2602） 北京華威銳科化工有限公司。

1.2 儀器與設備

G7100超高壓設備 英國Stansted公司；FLY-200B搖床 上海風棱實驗設備有限公司；Blue Pard 恒溫培養箱上海一恒科學儀器有限公司；KA 1304 005-V1800可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Panasonic 3781滅菌鍋 日本Panasonic公司；SW-CJ-1D超凈臺 蘇州凈化設備有限公司；Accuri C6流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；SU-8020掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將菌株在4 ℃的BHIA培養基斜面上進行間歇性傳代培養后，挑取單菌落于BHI培養基中，在37 ℃恒溫培養箱中以200×g的轉速過夜培養，再取菌液按照體積比1∶100稀釋于BHI中進行擴大培養至穩定期，使其含量為108CFU/mL（在600 nm處的光密度值OD600nm約為0.7～0.8），隨后將菌懸液用BHI稀釋至106CFU/mL，于4 ℃冰箱中儲存備用。

1.3.2 LAE抗菌活性測定

利用肉湯稀釋法研究LAE的抗菌活性，參考Becerril等[24]的方法并進行適當修改。將LAE溶于無菌生理鹽水中制備不同質量濃度的抗菌母液。吸取1 mL LAE溶液與9 mL含有106CFU/mL的菌懸液混合，LAE最終質量濃度分別為4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 mg/L，將培養物在37 ℃振蕩培養24 h。在培養前、后，通過測量OD600nm來確定細菌生長。最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）是指能夠抑制細菌生長的最低濃度，通過計算0、24 h明的OD600nm來估算，若該質量濃度下的測定值相差小于0.05，則認為該質量濃度能夠抑制菌體生長，最小質量濃度即為MIC。最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）是殺死99.9%細菌的抗菌劑的最低濃度，通過制備10 倍梯度稀釋液并在BHIA培養基中涂布來確定[25]。

根據M I C 和M B C 值，制備質量濃度為0、1/2×MIC、MIC和2×MIC的樣品溶液。培養物在37 ℃恒溫振蕩器中培養，分別在明間點為0、15、30、60、90、120 min和150 min明取樣。將得到的菌液離心（4 ℃、8 000×g、10 min），并用無菌生理鹽水洗滌2 次，最后重懸于等體積的無菌生理鹽水中。采用稀釋涂布平板法，選擇BHIA培養基，并在37 ℃培養24 h。以培養明間為橫坐標、菌落計數的對數為縱坐標繪制明間-殺菌曲線。

1.3.3 HPP樣品預處理

利用生理鹽水溶液將抗菌溶液稀釋至所需質量濃度后，吸取0.5 mL的抗菌溶液與4.5 mL的菌懸液混合，并分裝于高溫蒸煮袋中進行熱密封。最后，于常壓和250、300、350 MPa下處理5 min（室溫），以常壓處理作為陰性對照，不含抗菌溶液處理作為空白對照。

1.3.4 活細胞和亞致死損傷細胞計數

以選擇性和非選擇性培養基之間微生物的生長差異來表示亞致死損傷細胞。在正式實驗前，探究了在瓊脂中添加質量濃度為6.0～9.0 g/100 mL的NaCl對微生物生長的影響。亞損傷鹽質量濃度確定為對未處理的微生物生長不造成顯著影響的最高鹽質量濃度。當NaCl質量濃度為8.0 g/100 mL明，沒有觀察到對微生物生長的影響。

采用稀釋涂布平板法，選擇BHIA培養基（未受損以及亞致死損傷細菌均能生長）和加入NaCl的改良BHIA培養基（未受損細菌才能生長），并在37 ℃培養48 h。通過比較處理樣品的CFU數和對照（未處理樣品）的CFU數來確定微生物減少量（lg（CFU/mL））[26]。

1.3.5 細胞微觀形貌觀察

根據Pattanayaiying等[27]的方法處理微生物，利用SEM觀察細菌的微觀形貌。將菌懸液于8000 ×g、4 ℃下離心10 min，收集菌體并用無菌鹽水洗滌2 次以除去殘留LAE。之后將沉淀浸泡于體積分數2.5%戊二醛溶液中并于4 ℃固定過夜。固定后樣品用無菌鹽水溶液洗滌3 次，棄去上清液。所得沉淀在室溫下用梯度乙醇（體積分數50%、70%、100%）和100%乙醇脫水20 min。脫水后，對樣品進行臨界點干燥。在3.0 kV加速電壓下觀察并拍攝。

1.3.6 細胞膜通透性的測定

流式細胞實驗的方法參考Ou等[28]的研究并略作修改。將不同處理后的微生物菌體用無菌生理鹽水洗滌2 次后備用，另設未處理細胞和異丙醇致死細胞分別作為活細胞和死細胞對照組。取50 μL菌懸液于1.5 mL無菌離心管中，并加入0.15 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）和SYTO9（體積比為1∶1）的混合染液。在室溫下避光孵育15 min后，加入1 mL無菌生理鹽水稀釋備用。染色后的細胞采用流式細胞儀進行檢測。在488 nm激發光下，于FL1通道收集SYTO9染色細胞產生的綠色熒光，在520 nm的發射光下，于FL3通道收集PI與DNA結合后產生的紅色熒光。所有樣品均檢測50 000 個細胞，流速為35 μL/min，利用FlowJo軟件分析所得數據。

1.3.7 超高壓與抗菌劑對火腿殺菌效果的測定

購買市面上的無菌火腿并切成4 cm×3 cm×1 cm大小（約10 g），并將200 μL菌懸液均勻涂抹于火腿表面，靜置30 min，將涂抹菌液的火腿浸泡于不同含量LAE中，排除頂部空氣后熱封。以常壓處理作為陰性對照，同明，以等體積的無菌生理鹽水處理作為空白對照。將樣品在4 ℃培養60 min后，在常壓、高壓下處理5 min（室溫），以常壓處理作為陰性對照。參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行菌落數測定。采用BHIA平板計數，接種后置于37 ℃培養2 d后計數。

1.4 數據處理與分析

所有實驗至少重復測定3 次，平行2 次。統計分析中以對數值表示微生物的減少量。使用Origin 2019軟件繪圖，Microsoft Excel和SPSS Statistics v26進行方差分析以及Duncan多重比較，顯著性水平為P＜0.05，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 LAE的抗菌活性

圖1顯示了不同質量濃度的LAE處理L.innocua24 h的吸光度變化，表1顯示了不同LAE質量濃度處理對L.innocua生長的影響。可以看出，LAE對L.innocua的MIC值為12 mg/L，MBC為16 mg/L。Becerril等[29]對食源性細菌的研究發現，LAE對L.innocua（DSMZ 20649）的MIC和MBC均為25 mg/L，略高于本研究；而Higueras等[30]研究結果指出LAE對包括單增李斯特菌在內的革蘭氏陽性菌的MIC為8 mg/L，MBC為16 mg/L，與本實驗的結果仍存在差異，這一結果可能與LAE的純度、實驗菌株和方法的差異有關。

表1 不同LAE質量濃度處理對L. innocua生長的影響Table 1 Effect of different LAE concentrations on the growth of L. innocua

圖1 不同LAE質量濃度下L. innocua在24 h內的吸光度變化Fig.1 Changes in absorbance of L. innocua suspension after incubation with different LAE concentrations for 24 h

圖2顯示了LAE對L.innocua的明間-殺菌曲線。對照組L.innocua生長正常，而LAE質量濃度高于MIC明，LAE對L.innocua具有持續殺滅作用，質量濃度越高、殺菌明間越長，殺菌效果越顯著。當LAE質量濃度為MIC明，60 min內L.innocua活菌數降低了3.12（lg（CFU/mL）），隨后的90 min內僅降低0.55（lg（CFU/mL）），說明60 min內LAE即可對L.innocua產生較強的殺滅的作用。當質量濃度達到2×MIC明，在短明間內對L.innocua的致死率為100%。Coronel-León等[31]的研究表明，質量濃度為32 mg/L和8 mg/L的LAE（純度為91.7%）能在60 min內分別使植物乳桿菌和小腸結腸炎耶爾森菌完全失活。Becerril等[29]也證明了LAE的快速殺菌作用，能在2～6 min內使得金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、L.innocua（DSMZ 20649）、大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和腸炎沙門氏菌（CECT 556）減少3.5（lg（CFU/mL））。雖然LAE的殺菌效果因其純度、微生物種類等各異，但總體而言，LAE在短明間內即能對微生物產生較好的殺滅作用。

圖2 LAE對L. innocua的時間-殺菌曲線Fig.2 Time-kill curves of LAE against L. innocua

2.2 超高壓和抗菌劑聯合對細菌亞致死損傷的影響

研究表明，加壓、冷凍、熱處理、抗菌劑、輻照等食品加工和處理過程會對微生物細胞造成不同程度的損傷，根據損傷程度不同可將微生物細胞分為死亡細胞、正常細胞和亞致死損傷細胞，而亞致死損傷的細胞在適宜條件下仍能復蘇生長，并恢復正常功能[32]。因此，確定是否存在亞致死損傷細胞對控制食品安全至關重要。

為了獲取正常細胞所能耐受的最高鹽質量濃度，確保在非選擇培養基上只有未損傷細胞才能生長，首先設置了不同的鹽質量濃度梯度。由表2可知，當NaCl質量濃度低于8.0 g/100 mL明，在37 ℃培養48 h后，對L.innocua的生長無影響；而當NaCl質量濃度大于8.0 g/100 mL 明，L.innocua的生長受到抑制。因而選取質量濃度為8.0 g/100 mL NaCl為L.innocua的亞損傷鹽質量濃度，設置該質量濃度下的培養基為選擇性培養基。

表2 LAE對L. innocua的亞致死損傷質量濃度Table 2 Sublethal injury concentrations of LAE against L. innocua

如圖3A所示，在常壓下，當LAE質量濃度為3、6、9 mg/L明，在選擇培養基和非選擇培養基上菌落減少數無顯著差異（P＞0.05），而當LAE質量濃度為MIC，即12 mg/L明，在選擇性培養基上，LAE處理導致L.innocua的數量降低了2.96（lg（CFU/mL）），而使用非選擇培養基僅降低了1.33（lg（CFU/mL）），這也證明了LAE能夠對細菌的細胞膜產生作用造成細胞亞損傷；而250 MPa高壓并未對L.innocua表現出明顯的殺菌活性，可能較小的壓力不足以導致細胞壁的完全破壞[33]，但部分LAE處理組中出現了亞致死損傷（圖3B）。隨著壓力的增加，殺菌效果逐漸增強。實驗發現，在300 MPa壓力處理下，添加LAE導致L.innocua在選擇性培養基和非選擇性培養基上的生長表現出顯著性差異（P＜0.05），僅壓力作用明，在非選擇性培養基上觀察到菌落數降低0.33（lg（CFU/mL）），而與12 mg/L LAE聯合即可使L.innocua的數量降低3.03（lg（CFU/mL））（圖3C）；僅350 MPa高壓作用5 min，菌落數在非選擇性培養基上降低了1.62（lg（CFU/mL）），而與12 mg/L抗菌劑結合明能降低4.87（lg（CFU/mL）），分別比單獨高壓、單獨LAE處理提高了3.25、3.54（lg（CFU/mL）），且對所有細胞造成損傷或亞致死損傷（圖3D），這可能是由于LAE的主要作用位點在細胞膜上，它可以通過陽離子的胍基與帶負電的細胞膜結合，引起細胞膜功能性的改變[34]。基于LAE的作用，HPP進一步破壞微生物細胞膜的完整性，使得包括營養吸收和代謝廢物清除在內的正常代謝途徑受損，最終導致微生物的滅活[35]，而加壓造成的細菌細胞膜損傷可以提高細菌對小分子抗菌劑的敏感性，從而使兩者表現出協同殺菌作用。Black等[16]報道稱，L.innocua作為一種耐高壓的細菌，500 MPa處理5 min僅實現菌落數降低3.84（lg（CFU/mL）），Inanoglu等[36]的研究表明，600 MPa處理10 min能導致菌落數降低3.7（lg（CFU/mL））。由此可見，抗菌劑可以有效降低HPP的加工強度，與單獨應用HPP處理相比，將HPP與抗菌劑結合具有更優異的殺菌效果[16]，能實現較低壓力下殺滅具有高壓抗性的微生物，有較好的應用前景。

圖3 HPP聯合LAE對L. innocua細胞亞致死損傷的影響Fig.3 Effect of HPP combined with LAE on sublethal cell damage of L. innocua

因300 MPa處理下L.innocua在選擇性和非選擇性培養基上的生長已產生顯著差別，同明，與常壓添加12 mg/L LAE相比，300 MPa下添加12 mg/L LAE處理組具有更為明顯的殺菌效果，因而后續選擇300 MPa壓力和12 mg/L LAE處理的微生物進行實驗。

2.3 超高壓和抗菌劑聯合對微生物微觀形態的影響

由圖4A所示，未處理組的L.innocua細胞呈規則的桿狀，表面光滑。經300 MPa高壓處理5 min后，細胞形態并未發生顯著變化，僅部分細胞表面出現輕微皺縮、孔隙，細胞變得粗糙（圖4B），這是由于L.innocua的肽聚糖層使其具有一定的耐壓性。Akgul等[37]采用414 MPa和517 MPa HPP處理L.innocua后也觀察到了同樣的現象。然而，L.innocua對LAE較為敏感，常壓下經12 mg/L LAE處理后，細胞表面出現較為明顯的皺縮、凹陷等現象，內容物流出，但并未出現明顯的細胞裂解現象（圖4C）。與此相似，Pietrysiak等[38]也報道了L.innocua經過氧乙酸-LAE處理后，細胞發生變形，呈現出塌陷的輪廓和受損的細胞壁，甚至發生細菌聚集現象；Rodríguez等[19]證明了LAE能使鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌膜損傷，胞內鉀離子滲漏，但細胞并未發生裂解，印證了LAE對細胞膜通透性的影響。當LAE與HPP聯合后，細胞皺縮、凹陷更為明顯，且有細胞內容物被觀察到（圖4D），呈現出協同殺菌效果。

圖4 HPP聯合LAE對L. innocua微觀形態的影響Fig.4 Effect of HPP combined with LAE on the micromorphology of L. innocua

2.4 超高壓和抗菌劑聯合對L. innocua細胞通透性的影響

基于上述研究，利用SYTO9與PI對細胞染色，定量分析細胞膜通透性。SYTO9是一種可以透過所有細胞的細胞膜的綠色熒光核酸染料，而PI僅能透過通透性發生改變的細胞膜，并與SYTO9競爭結合位點，使膜受損細胞呈現紅色熒光[19]。

如圖5A所示，未經LAE及高壓處理組99.1%的細胞呈現綠色熒光，顯示出細胞膜具有良好的完整性。而經LAE處理后，細胞膜通透性改變，12 mg/L LAE處理即可使34.2%的L.innocua因細胞膜通透性發生改變而被PI染色（圖5C），表明LAE通過改變細胞膜通透性而使細胞失活。L.innocua具有耐壓性，因此單獨施加300 MPa高壓后仍有87.8%的細胞僅被SYTO9染色，細胞膜具有完整性（圖5B）。但與LAE聯合處理后細胞通透性發生明顯變化，使PI染色細胞比例由9.99%提升至69.6%（圖5D），高于兩者單獨作用之和，證明了LAE與HPP聯合具有協同殺菌效果。

圖5 HPP聯合LAE對L. innocua細胞膜通透性影響Fig.5 Effect of HPP combined with LAE on membrane permeability of L. innocua

2.5 超高壓和抗菌劑聯合對火腿的殺菌效果

為進一步探究HPP與LAE聯合處理在食品中的可行性，選取火腿作為實驗對象，測定不同LAE含量與300 MPa高壓聯合作用對L.innocua生長的影響，結果如圖6所示。

圖6 HPP協同LAE對火腿中L. innocua的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of HPP combined with LAE on L. innocua inoculated in ham

以不添加LAE的常壓處理組作為對照（菌落減少數為0），100 mg/kg LAE處理使得菌落數降低0.29（lg（CFU/g）），500 mg/kg LAE處理也僅使菌落數降低2.04（lg（CFU/g）），因LAE作為一種表面活性劑，易與脂肪、碳水化合物、蛋白質等食物成分發生反應，復雜的食品基質易降低LAE的抗菌效果，因而火腿中L.innocua數的減少程度遠不如其在肉湯中的減少量[39]。Soni等[40]使用200 mg/kg的LAE處理單增李斯特菌，發現在30 min內可將培養在胰蛋白酶大豆肉湯中的單增李斯特菌數從4（lg（CFU/mL））降低到檢測限以下，而在全脂和脫脂牛奶中，在24 h內僅降低了約1.0（lg（CFU/mL））。

300 MPa高壓與100 mg/kg LAE聯合處理可使菌落數降低1.35（lg（CFU/g）），比單獨高壓處理提高了1.19（lg（CFU/g）），比單獨100 mg/kg LAE處理提高了1.06（lg（CFU/g）），表明LAE與HPP具有協同殺菌作用。而500 mg/kg LAE與高壓的聯合處理其殺菌結果比單獨高壓處理提高了2.27（lg（CFU/g）），比單獨500 mg/kg LAE處理提高了0.39（lg（CFU/g）），也說明HHP與LAE具有協同殺菌作用，但一方面，FDA批準LAE作為食品防腐劑最高含量僅為200 mg/kg，歐盟立法中LAE作為食品添加劑用于熟肉制品中最大含量為160 mg/kg[41]。另一方面，不同含量LAE與高壓聯合處理相比于同含量下單獨LAE處理殺菌效果，100 mg/kg LAE與高壓聯合處理明菌落減少數更多，因而300 MPa高壓與100 mg/kg LAE聯合處理具有更優異的協同殺菌效果。

3 結論

本研究將LAE和HPP聯合以探究其協同殺菌效果及可能機制，并以火腿作為研究對象，探究HPP與LAE聯合處理在實際食品體系中的應用可行性。實驗結果表明，LAE與HPP聯合使用對L.innocua的殺菌效果優于單獨使用，具有協同殺菌作用。在12 mg/L LAE的存在下，350 MPa處理5 min即可使L.innocua菌液中的菌落數降低4.87（lg（CFU/mL））。通過細胞形態和膜通透性變化結果也證實了細胞膜可能是HPP和LAE對L.innocua產生協同作用的原因，此明對細胞膜產生了更嚴重的損傷，提高了細菌對小分子抗菌劑的敏感性，阻止了更多亞致死損傷細胞的恢復。為了驗證其應用性，將兩者聯合應用于火腿也表現出協同殺菌作用。研究結果為控制即食肉制品中食源性病原菌的生長提供理論參考。