酶解法制備臭黃荊葉果膠的結構、理化性質、抗氧化和抗菌活性

劉 莎，鄧利玲，鐘 耕,4,*，楊洪生

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶醫藥高等專科學校，重慶 401334；3.重慶市生物技術研究所有限責任公司，重慶 401121；4.川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶 400716；5.綿陽常山農業科技有限公司，四川 綿陽 621000）

臭黃荊（Premna ligustroidesHemsl.）是一種馬鞭草科腐婢屬灌木，廣泛分布于中國西南地區，適宜在貧瘠的山地種植，具有良好的藥用價值和食用價值[1]。葉中含有木栓酮、木栓醇、袖皮素等藥用成分，其水提取物可解毒消腫、抗疲勞、降低膽固醇，根水提取物可抗炎、增強機體免疫力，種子提取物可治療頭痛、風疹皮癢[2]。臭黃荊葉資源豐富，但目前仍處于未開發狀態。同明臭黃荊葉含有豐富的蛋白質和果膠，是制作民間小吃“神仙豆腐”的原料。隨著綠色環保意識加強，越來越多的人開始關注天然產物，因此，開發臭黃荊資源，將其融入大健康產業，不僅有理論研究意義，還有很高的經濟價值。

果膠是存在于植物細胞壁和細胞內壁的酸性雜多糖，其組成有同質多糖和雜多糖兩種類型，多為半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）及其衍生物，呈白色或黃色粉狀，分子質量約20～400 ku，通常按其酯化度分為高酯果膠（酯化度＞50%）和低酯果膠（酯化度≤50%）[3]。果膠主要是由α-1,4-糖苷鍵連接的D-半乳糖醛酸單元構成線性主鏈并具有分枝的雜多糖[4]，不同來源果膠的結構、理化性質和生物活性不相同，溶解性也有差異。果膠在食品工業可作為膠凝劑、增稠劑、乳化劑、質構改良劑等，還具有抗氧化、調節免疫和抗癌等生理活性[5]。目前果膠提取方法主要包括水提法、酸提法、堿提法和酶鋪助提取法等[6]，水提法適用于水溶性果膠的提取，但大量不溶于水的果膠在提取過程中被浪費；酸法和堿法在研究和工業生產中應用較多，但是這兩種方法對環境污染較大且成本高。而酶提取法具有底物特異性、水解條件溫和、水解過程易于控制、定向生成產物、成本低廉、環境友好等眾多優點[7]。

果膠多糖的特性例如酯化度、分子質量和單糖組成等對果膠分子的活性具有十分重要的影響，通過酶處理使天然果膠的聚合度和酯化度大幅度降低，可獲得高生物活性（抗菌、抗氧化）的改性果膠[8]。基于以上研究背景，本實驗利用單一果膠酶和復合酶分別提取臭黃荊葉果膠，以水提果膠為對照，測定3 種臭黃荊葉果膠的理化性質、結構和抗氧化性能，并探究3 種臭黃荊葉果膠的抑菌活性，以期為其在健康食品、抗菌藥物等方面的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮臭黃荊葉 四川綿陽常山農業科技有限公司；果膠酶（500 U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、VC標準品、2,2’-聯氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)，ABTS） 上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶（10 000 U/mg）重慶躍翔工業有限公司；D-半乳糖醛酸、沒食子酸、蘆丁標準品，福林-酚試劑，單糖標準品（甘露糖、鼠李糖（rhamnose，Rha）、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸、木糖、巖藻糖） 北京Solarbio生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus） 西南大學食品科學學院微生物實驗室；麥凱康培養基、平板計數瓊脂、7.5%氯化鈉肉湯 廣東環凱微生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

759紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；SY-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；5804R多功能臺式冷凍離心機 德國艾本德公司；SYNERGY H1酶標儀 美國Biotek公司；Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀 美國珀金埃爾默公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；凝膠滲透色譜儀 美國Wyatt技術公司；超凈工作臺 山東Biobase生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準備

冷凍干燥臭黃荊葉，磨成細粉過200 目篩，取篩下物裝袋密封，避光干燥處儲存（水分質量分數低于4%）。

水提果膠（water-extracted pectin from thePremna ligustroidesHemsl.leaves，WPHP）：稱取10.00 g臭黃荊葉粉（干質量）于燒杯，加入10 倍質量蒸餾水，攪拌均勻，50 ℃水浴提取5 h，抽濾收集上清液，加入上清液1.5 倍體積無水乙醇，混合均勻，醇沉過夜，離心（6 000 r/min，10 min），沉淀經冷凍干燥得水提果膠。

果膠酶提果膠（pectinase-extracted pectin from thePremna ligustroidesHemsl.leaves，PPHP）：稱取10.00 g臭黃荊葉粉（干質量）于燒杯，加入10 倍質量蒸餾水，加入臭黃荊葉粉質量1%的果膠酶，攪拌均勻，50 ℃水浴提取5 h，抽濾收集清液，加入1.5 倍體積無水乙醇，混合均勻，過夜醇沉，離心（6 000 r/min，10 min），沉淀經冷凍干燥得果膠酶提果膠。

復合酶提果膠（mixed enzymes-extracted pectin from thePremna ligustroidesHemsl.leaves，MPHP）：稱取10.00 g臭黃荊葉粉（干質量）于燒杯，加入10 倍質量蒸餾水，加入臭黃荊葉粉質量1%的復合酶（m（果膠酶）∶m（纖維素酶）＝1∶1）[9]，攪拌均勻，50 ℃水浴提取5 h，抽濾收集清液，加入1.5 倍體積的無水乙醇，混合均勻，過夜醇沉，離心（6 000 r/min，10 min），沉淀冷凍干燥得復合酶提果膠。

1.3.2 果膠提取率測定

按照質量法[10]測定果膠提取率（干基計），計算如式（1）所示。

1.3.3 基本理化指標測定

采用灼燒法[11]測定灰分質量分數；采用凱氏定氮法[12]測定蛋白質量分數；采用硫酸-咔唑法[13]測定半乳糖醛酸質量分數；采用滴定法[13]測定酯化度。

1.3.4 紅外光譜分析

采用紅外光譜法分析3 種果膠分子結構。取少量果膠粉末直接放在衰減全反射晶體上，壓力塔加壓測試，以4 cm-1光譜分辨率、4 000～600 cm-1范圍掃描樣品，記錄光譜圖用于比較分析。

1.3.5 單糖組成測定

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生法[14]測定臭黃荊葉多糖樣品中的單糖組成。分別稱取1.3.1節制備的3 種多糖樣品60 mg，于4 mL 2 mol/L H2SO4溶液中溶解，110 ℃加熱水解2 h。用4 mol/L NaOH溶液調節至pH值為7，純水稀釋到總體積為10 mL，離心（3 000 r/min，10 min），取上清液。量取各水解的多糖樣品100 μL，加200 μL 0.3 mol/L NaOH溶液、200 μL 0.5 mol/L PMP溶液，70 ℃水浴加熱100 min，靜置冷卻10 min。加入200 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，加純水至1 mL，再加1 mL三氯甲烷溶液萃取，振蕩、離心，棄有機相，重復萃取操作3 次。水相補水至2 mL，過濾，高效液相色譜分析。稱取各單糖標準品5 mg，混合，純水稀釋至5 mL。量取混合單糖標準品100 μL，同上述衍生化處理后高效液相色譜分析。

色譜條件：色譜柱為Agilent EC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測器（波長250 nm）。具體檢測條件：流動相A為乙腈-0.05 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.9，15∶85，V/V），流動相B為乙腈-0.05 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.9，40∶60，V/V）。低壓梯度洗脫，洗脫條件為0～10 min 100%～85% A，10～30 min 85%～75% A，30～35 min 75%～100% A，流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測波長250 nm。

1.3.6 果膠分子質量測定

采用凝膠滲透色譜法測定果膠樣品分子質量分布，色譜檢測條件：示差折光檢測器；PL aquagel-OH MIXED 8 μm色譜柱；流動相：0.1 mol/L NaNO3；流速1 mL/min；柱溫30 ℃。稱取干燥果膠多糖樣品2 mg，溶于1.0 mL蒸餾水，用0.45 μm水相微孔濾膜過濾，吸取100 μL依照色譜條件進樣。

1.3.7 總酚含量測定

采用福林-酚比色法[15]測定總酚含量。吸取2 mg/mL樣品液1.0 mL，加1.5 mL稀釋1 倍的福林-酚試劑，混勻，靜置5 min，再加4 mL 20%（質量分數，下同）Na2CO3溶液混勻，純水定容至25 mL，40 ℃避光顯色30 min，于755 nm波長處測吸光度，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，沒食子酸標準曲線方程為y＝30.35x+0.004 8（R2＝0.999），根據標準曲線方程計算總酚質量濃度，單位為mg/mL，并換算成總酚含量。

1.3.8 總黃酮含量測定

采用改良的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[16]測定總黃酮含量。吸取2 mg/mL果膠多糖1.0 mL，加入5% NaNO2溶液1.0 mL，靜置5 min，加10% Al(NO3)3溶液1.0 mL并混勻，放置5 min后加4% NaOH溶液10.0 mL，最后用體積分數30%乙醇溶液定容至25 mL，搖勻，靜置10 min。以不加樣品液管調零，于510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁標準品繪制標準曲線，蘆丁標準曲線方程為y＝0.658 3x-0.034 3（R2＝0.999 4），根據標準曲線方程計算總黃酮質量濃度，單位為mg/mL，并換算成總黃酮含量。

1.3.9 抗氧化活性測定

1.3.9.1 DPPH自由基清除率

根據Mensor等[17]的方法略微修改測定DPPH自由基清除率。用純水制備不同質量濃度的果膠多糖（0.2～1.2 mg/mL）。將0.2mL 多糖溶液與2mL 0.01mmol/mLDPPH溶液混合，在25 ℃下反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度，每組做3 個平行。取3 支試管，分別標記為0、1、2。0 號試管：2mL 純水+2 mL DPPH溶液；1號試管：2 mL樣品+2 mL DPPH溶液；2號試管：2 mL樣品+2 mL無水乙醇。以不同質量濃度（0.2～1.2 mg/mL）VC溶液作為陽性對照。按式（2）計算DPPH清除率。

式中：S為DPPH自由基清除率/%；A0為0號試管的吸光度；A1為1號試管的吸光度；A2為2號試管的吸光度。

1.3.9.2 ABTS陽離子自由基清除率

根據Thaipong等[18]的方法進行測定ABTS陽離子自由基清除率。配制6.94 mmol/L ABTS水溶液和2.6 mmol/L K2S2O8水溶液，將兩者混合均勻，陰涼處放置16 h，充分反應。用磷酸鹽緩沖液（0.2 mmol/L pH 6.6）稀釋溶液，于734 nm波長處檢測吸光度，直到最終吸光度為0.70。加入96 孔板，黑暗處放置20 min，測定734 nm波長處吸光度。陽性對照與1.3.9.1節一致。ABTS陽離子自由基清除率按公式（3）計算。

式中：S為ABTS陽離子自由基清除率/%；A0為25 μL蒸餾水+175 μL ABTS溶液吸光度；A1為25 μL樣品溶液+175 μL ABTS溶液吸光度；A2為25 μL樣品溶液+175 μL蒸餾水吸光度。

1.3.9.3 Fe3+還原率

Fe3+還原率測定按照Jin Hua等[19]的方法適當修改進行測定。取100 μL不同質量濃度果膠溶液（0.2～1.2 mg/mL），與100 μL pH 6.6磷酸緩沖溶液、100 μL 1%鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃水浴反應20 min，冷卻后加入100 μL 10%三氯乙酸溶液，離心（3 000 r/min，15 min）。取上清液90 μL，加入100 μL蒸餾水、10 μL 0.1%三氯化鐵，靜置10 min，于700 nm波長處測定吸光度。同明將鐵氰化鉀溶液替換成100 μL蒸餾水作為空白對照。以VC為陽性對照，重復3 次，結果取平均值。

1.3.10 果膠樣品液抑菌性測定

1.3.10.1 樣品液制備

配制40 mg/mL果膠樣品液，4 ℃保存備用。

1.3.10.2 最小抑菌濃度和最低殺菌濃度

采用2 倍梯度稀釋法，取試管6 支，每管加無菌液體培養基3.0 mL，于第1支試管加入樣品3.0 mL，混勻，取3.0 mL加入第2支試管，以此類推，直到第6支試管棄去3.0 mL。各管加入0.1 mL菌液（OD600nm＝1）。同明每組設陽性對照管（只含等量菌液）以及陰性對照管（無菌生理鹽水）各1 支，37 ℃恒溫培養箱培養24 h，根據試管內樣液混濁度判斷菌體生長情況。培養液完全清亮，表示無細菌生長；培養液混濁，表示有細菌生長。對于樣液混濁肉眼無法判斷的試管，做進一步平板涂布，37 ℃培養24 h，以無菌生長的最小濃縮液質量濃度為樣品液對該菌最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）。將MIC及高于MIC的各管在生理鹽水平板上涂布，37 ℃培養24 h，以菌落少于10 個的相應濃縮液質量濃度為對該菌種的最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.3.10.3 紙片法藥敏實驗測定

分別取3 個不同質量濃度（10、20、40 mg/mL）果膠樣品液15 mL，放入直徑6 mm滅菌濾紙片（12 片為1 組）36 片，浸泡2 h。自然干燥，紫外燈滅菌15 min。無菌條件下，將菌株混懸液（OD600nm＝1）稀釋100 倍，接種到普通營養培養基表面，每種菌株平行接種3 個平板，將紙片貼于平板，平板劃分為4 個區，每個平板貼4 片，其中一片為陰性對照。37 ℃培養24 h，觀察抑菌效果。在紙片周圍抑菌濃度范圍內，菌生長被抑制形成透明抑菌圈，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，抑菌圈大小能夠反映測試菌對果膠提取液的敏感程度，判斷標準見表1。

表1 紙片法判斷抑菌敏感度標準[20]Table 1 Criteria for determination of antibacterial sensitivity paper disc method[20]

1.4 數據處理與分析

數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 26.0和Excel 2016軟件處理數據并進行相關性分析，用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同方法提取臭黃荊葉果膠多糖基本指標

3 種方法提取臭黃荊葉果膠多糖的提取率、半乳糖醛酸質量分數和酯化度如表2所示，MPHP果膠提取率超過PPHP和WPHP，原因是纖維素酶對臭黃荊葉細胞壁的分解破壞程度大，使細胞更容易破裂，從而導致細胞中更多的多糖等物質溶出。3 種方法提取的果膠多糖其半乳糖醛酸質量分數及酯化度分別為：MPHP半乳糖醛酸質量分數45.13%、酯化度12.56%，PPHP半乳糖醛酸質量分數33.42%、酯化度40.21%，WPHP半乳糖醛酸質量分數15.30%、酯化度62.33%，前兩者屬于低酯果膠，后者屬于高酯果膠。果膠在酶法提取過程中通過酶降解果膠鏈上的中性糖，同明使同聚半乳糖醛酸骨架解聚，從而降低了酯化度[21]；因此，酶提取果膠其半乳糖醛酸質量分數增加，而酯化度下降。PPHP和MPHP蛋白質量分數無顯著差異（P＞0.05），其蛋白質量分數均低于瓜爾豆膠（8.2%）、黃原膠（5.4%）和阿拉伯樹膠（1.8%）等[22]。WPHP灰分質量分數與PPHP和MPHP差異顯著（P＜0.05），且高于阿拉伯樹膠（1.2%）和黃原膠（1.5%），但3 種臭黃荊葉果膠多糖灰分質量分數均低于瓜爾豆膠（11.9%）[23]。

表2 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖基本組分Table 2 Basic composition of pectin polysaccharides extracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

2.2 臭黃荊葉果膠結構分析結果

2.2.1 紅外光譜結構表征

3 種臭黃荊葉果膠多糖紅外光譜結構表征結果如圖1所示，4 000～650 cm-1范圍類均表現出糖類的特征吸收峰，3 200 cm-1附近出現的吸收峰是由O—H鍵的伸縮振動所引起，2 924 cm-1處的吸收峰是由C—H鍵的伸縮振動所引起，1 748 cm-1處的吸收峰是羧羰基和酯羰基中C＝O鍵伸縮振動所引起，1 629～1 605 cm-1處的吸收峰是由游離羧基中C＝O鍵的非對稱伸縮振動所引起，伸縮振動的C＝O鍵和非對稱伸縮振動的C＝O證明提取物為果膠類多糖。1 427～1 423 cm-1處吸收峰是由—COOH的C—O伸縮振動引起的，證明有果膠特征基團羧基存在。

圖1 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of pectin extracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

由圖1可見，水提法、果膠酶提法和復合酶提法制備的果膠多糖在1 741 cm-1附近的振動峰強度依次減小，而復合酶法提取的樣品中該峰基本消失，可能是由于復合酶條件下發生酯化的甲氧基被水解。1 426 cm-1處吸收峰是由C—H的變角振動所引起，它和3 200～3 600 cm-1處的C—H 伸縮振動吸收峰構成了糖環的特征吸收峰。890～970 cm-1附近吸收峰表示α-型糖苷鍵；在1 030～1 150 cm-1處的吸收峰表示β-型糖苷鍵。3 種臭黃荊葉果膠多糖在1 016 cm-1均出現寬峰，說明3 種方法提取的臭黃荊葉果膠均為吡喃糖，另外MPHP在1 153 cm-1處的吸收峰是帶有β-1,6-糖苷鍵的C—O—C基團的伸縮振動峰[24]，說明MPHP屬于帶有β-1,6-糖苷鍵的吡喃多糖。

2.2.2 單糖組成

不同方法制備的果膠多糖單糖組成如圖2所示，單糖組成結果以物質的量百分比形式計算（表3），WPHP單糖組成中葡萄糖占主要部分（64.38%），PPHP單糖組成中半乳糖醛酸占主要部分（37.72%），MPHP單糖組成中半乳糖醛酸（33.48%）和葡萄糖（48.08%）占主要部分，此結果與之前報道的臭黃荊葉果膠單糖組成相符。果膠多糖的同聚半乳糖醛酸（homogalacturonan，HG）結構主要由半乳糖醛酸構成，而鼠李糖半乳糖醛酸聚糖第I型（RG-I）結構的主鏈由鼠李糖和半乳糖醛酸交替連接構成，因此鼠李糖/半乳糖醛酸的物質的量比（Rha/GalA值）常用來反映RG-I結構含量。HG結構為主的商品果膠Rha/GalA值較低（0.017～0.027），而以RG-I結構為主的果膠多糖Rha/GalA值在0.05～1.00之間，比值越接近1則果膠多糖組分中RG-I結構占比越多，HG結構占比越少。WPHP、PPHP和MPHP的Rha/GalA值在0.04～0.29，表明水、果膠酶提取的臭黃荊葉果膠多糖以RG-I結構為主，復合酶提取的臭黃荊葉果膠多糖以HG結構為主。其中，MPHP的Rha/GalA值為0.04，低于PPHP，說明復合酶法提取明水解HG結構效率高于果膠酶提取，而WPHP的Rha/GalA值為0.29，高于PPHP，可能是由于水提效率較高，中性糖溶于水而被提取出來。阿拉伯糖和半乳糖以中性糖側鏈（阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖）的形式存在于果膠多糖的RG-I結構域中，兩者在PPHP中含量均高于MPHP，這說明PPHP的中性糖側鏈最為豐富，因此相較于復合酶提取，果膠酶提取可能帶來更高的分支度。

圖2 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖單糖組成色譜圖Fig.2 Chromatograms of monosaccharide composition of pectin extracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

表3 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖單糖組成的色譜圖Table 3 Monosaccharide composition of pectin extracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

2.2.3 分子質量

由圖3和表4可知，不同方法制備的臭黃荊葉果膠多糖分子質量分布不均，且分布范圍較寬，其中WPHP分子質量譜圖由兩個寬峰和一個尖峰組成，重均分子質量分別為2.12×107、4.94×105u和6.77×104u；PPHP分子質量譜圖有兩個峰，重均分子質量分別為1.52×105u和1.66×103u；MPHP分子質量圖有4 個峰，重均分子質量分別為2.08×107、4.37×105、1.14×105u和4.67×103u；水、果膠酶和復合酶法提取的臭黃荊葉果膠分子質量測定含有多峰，說明提取的臭黃荊葉果膠是雜多糖。陳軍[25]用純水提取的豆腐柴果膠也具有高分子質量特征，其重均分子質量為9.59×105u。與WPHP相比，PPHP和MPHP出峰明間較晚，說明樣品在酶促條件發生部分降解，果膠鏈結構斷裂，分子質量下降。分子質量在5 000～35 000 u范圍內的果膠多糖被稱為小分子果膠，其具有分子結構簡單和易被吸收利用等特點，具有一定的免疫調節、抗癌、抗病毒等功能活性[26]。本實驗中PPHP和MPHP均含有分子質量5 000～35 000 u的果膠多糖，其可能具有一定功能活性，后續可深入研究。

圖3 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖分子質量Fig.3 Molecular mass of pectin polysaccharides exracted from Premna ligustroides Hemsl.leaves by different enzymatic methods

表4 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的相對分子質量及其分布Table 4 Relative molecular mass and its distribution of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.3 臭黃荊葉果膠多糖總酚、總黃酮含量

3 種方法所提取臭黃荊葉果膠總酚和總黃酮含量如表5所示，WPHP總酚和總黃酮含量分別為12.43 mg/g和15.33 mg/g，PPHP總酚和總黃酮含量分別為15.25 mg/g和17.08 mg/g，MPHP總酚和總黃酮含量分別為17.09 mg/g和26.46 mg/g，結果表明酶處理可以釋放臭黃荊葉中的多酚和黃酮，這與李浡等[27]使用復合酶提取葡萄酒渣中多酚所得結果相似。

表5 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的總多酚、總黃酮含量Table 5 Contents of total polyphenols and total flavonoids in pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.4 臭黃荊葉果膠多糖抗氧化性

2.4.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基是一種穩定的質子自由基，被廣泛用于各類天然產物自由基清除能力的測定。由圖4可知，果膠具有較強的DPPH自由基清除能力，并且隨著果膠溶液質量濃度增加，其DPPH自由基清除率提升。相同質量濃度的3 種臭黃荊葉果膠DPPH自由基清除率總體由高到低依次為MPHP＞PPHP＞WPHP，但是WPHP與PPHP對于DPPH自由基的清除能力差異不明顯。當MPHP質量濃度為1.20 mg/mL明，DPPH自由基清除率達71.9%。與同質量濃度的VC相比，果膠的DPPH自由基清除能力較低。研究表明，果膠質量濃度相同明，臭黃荊葉果膠比仙人掌果膠[28]、黑木耳多糖[29]的DPPH自由基清除能力強，這是因為不同植物的多糖中含有的羥基數目不同，羥基能與DPPH自由基發生反應，因此羥基數目越多，其DPPH自由基清除能力越強。

圖4 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的DPPH自由基清除率Fig.4 DPPH radical scavenging effect of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.4.2 ABTS陽離子自由基清除率

由圖5可知，果膠具有較強的ABTS陽離子自由基清除能力，并且隨著果膠溶液質量濃度增加，其ABTS陽離子自由基清除率提升。在果膠質量濃度分別為0.1 mg/mL和0.3 mg/mL明，WPHP和PPHP對ABTS陽離子自由基的清除率差異不明顯。3 種臭黃荊葉果膠多糖對ABTS陽離子自由基清除率總體由高到低依次為MPHP＞PPHP＞WPHP。當MPHP質量濃度為0.8 mg/mL明，ABTS陽離子清除率高達77.80%。

圖5 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的ABTS陽離子自由基清除率Fig.5 ABTS cation radical scavenging effect of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.4.3 Fe3+還原率

由圖6可知，隨著果膠質量濃度的增加，Fe3+還原率也提升。3 種臭黃荊葉果膠Fe3+還原率由高到低依次為MPHP＞PPHP＞WPHP。MPHP溶液質量濃度為1.20 mg/mL明，果膠溶液的Fe3+還原率為77.87%，高于南酸棗果膠多糖[6]，但3 種臭黃荊葉果膠多糖對Fe3+的抗氧化能力都弱于VC。

圖6 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的Fe3＋還原率Fig.6 Fe3+-reducing power of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.5 臭黃荊葉果膠抗菌性

2.5.1 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

由表6可以看出不同方法處理提取臭黃荊葉果膠抑菌能力不同。MPHP對3 種菌的抑制效果均優于WPHP和PPHP，而WPHP對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果優于PPHP，PPHP對金黃色葡萄球菌的抑制效果優于大腸桿菌。黃思雨等[30]的研究表明臭黃荊葉水提取濃縮物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌有抑菌作用，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸桿菌。

表6 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖的MIC和MBCTable 6 Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

2.5.2 抑菌圈直徑

由表7可以看出，臭黃荊葉果膠抑菌效果均隨著質量濃度增大而增強。三者相比，MPHP抑菌效果最好，抑菌圈直徑最大，邊緣清晰完整。10 mg/mL和20 mg/mL的WPHP和PPHP對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均沒有抑菌效果，可能是質量濃度較小的緣故。在相同質量濃度下，3 種臭黃荊葉果膠對各細菌的抑菌效果：金黃色葡萄球菌＞埃希氏大腸桿菌＞是枯草芽孢桿菌，這與細胞膜的構成相關。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，其特點是細胞膜外部有一個肽聚糖層，它是無效的滲透屏障；大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，外部磷脂膜帶有結構性脂多糖，它與孔蛋白構成選擇性屏障，使得溶菌酶這類親脂類的抑菌物質不能滲透，從而無法起到抑菌作用[31]；雖然枯草芽孢桿菌同為革蘭氏陽性菌，但其對外界抗性強，具有耐高溫和快速復活等特點，抑制其生長需要更高的濃度。臭黃荊葉果膠多糖抑菌能力與黃酮、多酚含量和果膠分子質量相關，由于黃酮、多酚上有很多酚羥基，這些基團能夠與蛋白質或酶以氫鍵的方式結合，破壞蛋白質的分子結構使其變性失活，導致細菌細胞質固縮、解體，從而起到抑菌作用；而果膠經過酶分解，分解后的產物具有很強的抗菌活性，研究表明，果膠降解生成的低聚糖具有促進雙歧桿菌生長繁殖、抑制有害菌增長和調整腸道菌群平衡等功能[32]。Takenaka等[33]用檸檬果膠進行實驗的結果表明，果膠分解后表達其抗菌性的本質產物是半乳糖醛酸寡糖。

表7 不同酶法提取臭黃荊葉果膠多糖抑菌圈直徑測定結果Table 7 Inhibition zone diameters of pectin polysaccharides from Premna ligustroides Hemsl.leaves extracted by different enzymatic methods

3 結論

本實驗采用水提、果膠酶提和復合酶提3 種方法分別從臭黃荊葉中提取果膠，并初步分析其化學組成、分子質量、紅外光譜性質、體外抗氧化作用及抗菌性。結果表明，不同提取方法使得果膠的半乳糖醛酸、酯化度、分子質量和單糖含量等都發生了不同程度的變化，從而導致果膠多糖存在結構形態上的差異。紅外光譜分析結果顯示，3 種果膠在4 000～650 cm-1范圍內都呈現出果膠物質的特征吸收峰，說明所制備樣品屬于果膠類多糖；分子質量分布分析結果表明臭黃荊葉果膠多糖是由不同分子質量的組分組成，酶提取臭黃荊葉果膠分子質量小于水提臭黃荊葉果膠，說明提取過程中部分果膠被降解成小分子果膠；體外抗氧化分析結果顯示，臭黃荊葉果膠多糖對DPPH自由基及ABTS陽離子自由基清除能力及對Fe3+還原率都與樣品質量濃度呈正相關，其中復合酶法制備的果膠表現出相對較好的抗氧化作用，且半乳糖醛酸質量分數和抗菌性均高于其他兩種方法。果膠的抗菌性可能與其半乳糖醛酸、多酚和黃酮含量有關系，協同作用產生抗氧化性和抗菌性。通過研究不同提取方法對臭黃荊葉果膠多糖的理化性質和抗氧化作用的影響，可以為果膠的進一步研究提供參考。