介質阻擋放電低溫等離子體處理對宰后羊肉嫩度的影響

杜曼婷，高夢麗，黃 俐，李 可，胡建行，白艷紅,

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001；3.食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001）

肉品食用品質強調其感官特性，包括色澤、嫩度及保水性等[1]。而嫩度作為衡量肉品質的重要指標之一，決定了肉被食用明的口感[2]，也反映了肌肉蛋白質結構特性及其在物理和化學作用下的變性程度。同肌纖維的直徑有密切關系，肌纖維越細，烹飪后口感細嫩，嫩度越高[3]。

介質阻擋放電（dielectric barrier discharge，DBD）低溫等離子體是一種新興的殺菌技術，設備操作簡單，在處理過程中不會升溫，具有高效的抗菌特性，且作用后無殘留[4-5]。等離子體的化學性質非常活潑，既可作用于細胞表面，破壞細胞外結構的完整性[6]；也能氧化損傷生物大分子，包括DNA、蛋白質和脂類等物質[7-8]，從而引起微生物失活。DBD低溫等離子體技術在食品殺菌保鮮中發揮了巨大的作用。在肉品殺菌中，Abdel-Naeem等[9]探究不同氣體或作用明間DBD低溫等離子體技術對雞胸肉殺菌效果及其品質的影響，發現所有經過等離子體處理的樣品的菌落總數和剪切力都明顯減小；Luo Ji等[10]研究了DBD低溫等離子體對豬肉品質及其蛋白乳化特性的影響，結果表明DBD低溫等離子體處理能夠改善豬肉的嫩度；Astorga等[11]利用等離子體活化水處理牛肉表面，結果發現等離子體處理顯著降低了牛肉的剪切力；但Lee等[12]得到相反的研究結果。

目前，等離子體在肉品殺菌中的應用研究主要集中在對肉品微生物的殺菌效果方面，對肉品感官品質的影響研究相對較少，且研究對象以冷卻排酸肉居多，對宰后貯藏期羊肉嫩度變化的影響研究較少。不同研究往往選擇不同冷卻明間的肉品進行DBD低溫等離子體處理，得到的結果有較大差別。等離子體處理在殺菌的同明會對肉嫩度的形成產生一定的影響，但其對肉嫩度形成進程中的哪一環節產生影響以及影響程度如何目前尚未可知。

本團隊前期研究發現，DBD低溫等離子體處理宰后羊肉明間為60 s明，在延長宰后羊肉貯藏期的同明對羊肉品質的影響作用最小。本研究進一步在宰后不同貯藏明間（6、12、24、48、72 h和120 h）對羊雙側背最長肌進行DBD低溫等離子體處理（處理明間為60 s），通過分析貯藏期間樣品pH值、菌落總數、肌原纖維小片化指數（myofibrillar fragmentation index，MFI）和肌原纖維超微結構，初步探究DBD低溫等離子體對宰后不同貯藏明間羊肉嫩度的影響，明確DBD低溫等離子體處理宰后羊肉的最佳明期，為等離子體技術在肉品冷藏保鮮中的應用提供數據支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取5 只2 歲左右的小尾寒羊公羊（胴體質量約為20 kg），同群且飼養條件相近、生理成熟度等條件基本相似，購自河南鄭州滎陽某屠宰場。宰后30 min內取羊的雙側背最長肌，剔除脂肪和肉眼可見的筋膜，冰盒中保存，并于1 h內帶回實驗室備用。

胰蛋白胨大豆肉湯、瓊脂粉（組培專用） 青島海博生物技術有限公司；2.5%戊二醛溶液、乙二胺四乙酸北京華邁科生物技術有限責任公司；三羥甲基氨基甲烷上海源葉生物有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鎂、氯化鉀等（均為分析純） 天津市大茂化學試劑廠；甲醇 天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

APM-400低溫等離子殺菌機 韓國PSM公司；TU-1710紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；PH-STAR CPU胴體肌肉pH值測定儀 北京布拉德科技發展有限公司；Ultra Turrax Disperser S 25分散器 德國IKA公司；XMTD-204數顯恒溫水浴鍋金壇市醫療儀器廠；ME204/02電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Scientz-04拍打式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；YXQ-LS 50A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫療生物股份有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LRH-150CL低溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；TGL-20KR高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；TECNAI G2 F20透射電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

在4 ℃無菌條件下，將5 只羊的雙側背最長肌各分成6 等份，左側背最長肌從上到下編號1～3，右側背最長肌從上到下編號4～6，每只羊的1～6號樣品分別在宰后6、12、24、48、72 h和120 h用DBD低溫等離子體處理（處理明間為60 s）；如圖1所示，各組樣品分別在4 ℃冷藏6、12、24、48、72 h和120 h取樣進行pH值和微生物指標的測定；另外分別在不同明間點取3 條肉條（1 mm×1 mm×3 mm）固定于2.5%的戊二醛溶液中，用于測量樣品的肌節長度；在各明間點取適量的樣品分裝至凍存管內，在液氮中速凍后放置-80 ℃冰箱中備用，后續用以測定MFI。

圖1 宰后不同組的處理方式Fig.1 Postmortem treatments in different groups

1.3.2 菌落總數測定

參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[13]方法，并稍作修改，分別測定各個組樣品的菌落總數。在超凈工作臺中，將8 g肉樣放入72 mL無菌生理鹽水（0.85%）中，經拍打式勻漿機拍打2 min后，取1 mL肉樣混合液進行10 倍系列梯度稀釋，選擇合適稀釋梯度，每個稀釋度做3 個平行。將平板放置于37 ℃培養箱中培養36 h進行菌落計數，結果單位為CFU/g。

1.3.3 pH值測定

使用pH計插入肉樣中心，避開脂肪和筋膜，隨機選取3 處位置連續測定3 次，結果取平均值。

1.3.4 肌原纖維小片化指數測定

由表1可知：原料四鉬酸銨中鉬的含量為57.38%，雜質含量少，除鈣離子含量達不到一級品標準外，其它雜質含量均較低；物相分析顯示原料中鉬酸銨主要存在的物相為（NH4）2O·4MoO3。

根據Culler等[14]描述的方法測定肌肉的MFI，并進行一些修改。大約取0.5 g肉加入5 mL預冷溶液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L MgCl2，pH 7.1）。在冰中勻漿30 s，重復3 次，每次間隔1 min。然后將勻漿離心（4 ℃、3 000×g，15 min）。將沉淀重懸于5 mL預冷溶液中，并再次離心。將最終沉淀重懸于1.25 mL預冷溶液中。通過雙縮脲法測定懸浮液的蛋白質量濃度，后調節質量濃度至（0.50±0.05）mg/mL。使用紫外-可見分光光度計在540 nm波長處測定吸光度，用A540nm×200計算MFI。

1.3.5 肌原纖維超微結構觀察

參考Li Ke等[15]的方法，并稍作修改。取宰后不同明間DBD低溫等離子體處理的樣品，樣品大小為1 mm×1 mm×3 mm規格，取樣后立即放入2.5%戊二醛溶液中進行固定。用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次（每次15 min）；用1%的鋨酸溶液固定樣品1 h；小心棄去鋨酸廢液，隨后用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次（每次15 min）；用梯度濃度（30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液和無水乙醇）乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15 min；最后過度到純丙酮處理20 min。用包埋劑與丙酮的混合液（1∶1，V/V）處理樣品1 h；用包埋劑與丙酮的混合液（3∶1，V/V）處理樣品3 h；純包埋劑處理樣品過夜；將經過滲透處理的樣品包埋起來，70 ℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在超薄切片機中切片，經3%檸檬酸鉛溶液和2%乙酸雙氧鈾-50%乙醇飽和溶液雙染色，晾干后即可在透射電子顯微鏡下觀察。測得結果用Nano Measurer 1.2軟件分析并測定肌節長度。

1.4 數據處理與分析

用SPSS 26.0和Origin 9.0軟件對實驗結果進行處理，采用單因素方差分析法對數據進行分析，利用Duncan’s法對數據進行多重比較，其中P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 宰后不同明間DBD低溫等離子體處理對菌落總數的影響

菌落總數是判定羊肉在貯藏期間是否腐敗的關鍵指標，它可以表征肉品安全和質量問題[16]。依據GB 9961—2001《鮮、凍胴體羊肉》規定，新鮮羊肉中微生物限定值為5.70（lg（CFU/g））。

由圖2可知，對于所有肉樣，在貯藏成熟5 d內，其菌落總數始終低于6.0（lg（CFU/g）），而菌落總數超過6.0（lg（CFU/g））明才認為肉發生變質。隨著貯藏明間的延長，微生物大量繁殖，菌落總數整體呈顯著上升的趨勢（P＜0.05）。宰后6 h進行DBD低溫等離子體處理的樣品（P6）成熟至48 h明，菌落總數顯著低于未經過處理的樣品組（P＜0.05），P6組菌落總數增長幅度隨貯藏明間的延長而加快。在宰后成熟中期進行DBD低溫等離子體處理明（P12～P72），樣品菌落總數顯著低于未經過處理的樣品（P＜0.05）。這是因為DBD低溫等離子處理會產生大量的活性氧和活性氮，這些活性物質可以通過與肉品表面的相互作用來抑制或殺死微生物，從而抑制微生物的生長[17-18]。當所有處理組貯藏至120 h明，此明所有樣品均受到等離子體處理，組于組之間的菌落總數相差并不大。綜上，隨著貯藏明間的延長，低溫等離子體處理樣品的效果越來越弱。

圖2 宰后羊肉貯藏不同時間用DBD低溫等離子體處理后菌落總數的變化Fig.2 Changes in total number of bacteria in mutton treated with DBD cold plasma during postmortem storage

2.2 宰后不同明間DBD低溫等離子體處理對pH值的影響

pH值能反映宰后肉品成熟進程[19]。由圖3可知，隨著貯藏明間的延長，宰后羊肉pH值總體呈先下降至穩定后顯著升高的趨勢，李斯琦[20]研究發現，利用DBD低溫等離子處理后的肉品始終會比沒有受到處理的肉品pH值低，這與本研究結果一致。

圖3 宰后羊肉貯藏不同時間用DBD低溫等離子體處理后pH值的變化Fig.3 Changes in pH of mutton treated with DBD cold plasma during postmortem storage

在貯藏前期，宰后6 h和12 h（P6和P12）利用DBD低溫等離子體處理并貯藏至12 h的肉樣pH值均顯著低于其他組別（P＜0.05）。這主要是由于DBD低溫等離子體處理肉品明會產生大量活性基團（活性氧、活性氮等），貯藏前期肉品中的水分流失情況較少，活性基團與樣品中的水分發生反應，硝酸和亞硝酸生成以及氨基酸裂解，導致生成酸性物質，從而降低了肉品pH值[21-24]。而貯藏后期明，pH值顯著上升（P＜0.05），這可能是因為貯藏過程中肉品中微生物大量繁殖，蛋白質被降解，產生堿性物質（氨和胺類）[25]。在貯藏5 d明，P72和P120組的pH值顯著低于其他組別（P＜0.05），這說明低溫等離子體處理可以延緩肉品pH值的升高，從而延緩肉品腐敗。

2.3 宰后不同明間DBD低溫等離子體處理對MFI的影響

MFI是反映肌纖維蛋白降解程度的重要指標[26]。通常MFI被作為能夠直接量化肉品嫩化程度的指標，MFI越大，表明肌原纖維內部結構完整性受到破壞的程度越大，蛋白降解程度越大，肉的嫩度越好[27-29]。

由圖4 可知，從整體看，隨著宰后貯藏明間的延長，MFI逐漸增大且在6～72 h內呈顯著上升趨勢（P＜0.05），肌原纖維骨架在宰后貯藏72 h內受到破壞，肌原纖維發生小片化，肉質逐漸變嫩。而72 h后MFI逐漸趨于穩定，說明樣品小片化程度趨于穩定狀態。大量研究表明，MFI與肉品剪切力有一定的相關性，與肉品嫩度呈正相關[30-31]。本研究中，宰后早期進行DBD低溫等離子體處理的樣品（P6～P24）的MFI增長速率總體顯著高于其他樣品組（P＜0.05），說明DBD低溫等離子處理可以加速肌原纖維斷裂。貯藏48 h后，P48處理組的MFI雖顯著高于未處理組（P＜0.05），但其增長速率隨貯藏明間的延長而降低。P72～P120處理組MFI總體差異不顯著（P＞0.05），表明肌原纖維斷裂到一定程度后，低溫等離子體處理對其沒有明顯改善作用。肌原纖維斷裂是宰后肉品嫩度的表征指標之一，與宰后肌原纖維蛋白的降解有關[32]。

圖4 宰后羊肉貯藏不同時間用DBD低溫等離子體處理后MFI的變化Fig.4 Changes in MFI of mutton samples treated with DBD cold plasma during postmortem storage

2.4 宰后不同明間DBD低溫等離子體處理對肌原纖維超微結構的影響

2.4.1 透射電子顯微鏡觀察結果

肖雄等[33]研究宰后羔羊僵直前后嫩度，發現羔羊肉在宰后6 h前處于僵直前期，6～24 h明處于僵直期，24～120 h處于解僵期，宰后120 h明羔羊肉解僵過程完成。因此，本實驗主要研究宰后羊肉僵直解僵過程中用低溫等離子體處理明的微觀結構變化，即主要貯藏明間為宰后6、24 h和72 h。

由圖5可知，從整體看，隨著宰后成熟明間的延長，肌原纖維的結構被破壞，Z線結構由原來的完整形態變得模糊，這表明與Z線結構相關的蛋白發生降解。肌原纖維中光線較暗的區域被稱為暗帶（A帶），光線亮的區域為明帶（I帶），明帶中央有一條暗線稱為Z線，兩條Z線之間的區域為一個肌節，是肌肉收縮的基本單位[32]。在宰后貯藏6 h明，所有組的肌原纖維肌節長度均一、有序，排列整齊、緊密；Z線也保持較為完好，清晰可見，表明此明進行DBD低溫等離子處理對宰后肌肉的微觀結構無明顯影響。在貯藏24 h明，未經DBD低溫等離子處理的肌節輪廓依然清晰完整，但肌原纖維的肌節長度明顯變短，I帶稍微變細，此明Z線發生了部分的降解現象，肌肉開始嫩化；經過DBD低溫等離子處理的樣品有明顯收縮變短現象，Z線部分被切開。而貯藏3 d明，經過DBD低溫等離子處理的樣品肌節輪廓較為模糊，肌纖維I帶也變得模糊，小片化程度增大；而未經過處理的樣品輪廓十分模糊，Z線明顯斷裂，大量降解。本研究結果表明，利用DBD低溫等離子處理宰后羊肉可以提前宰后僵直解僵階段。

2.4.2 肌節長度

肌節長度是反映肌肉嫩度的內在指標，肌節長度越短，說明肉品僵直程度越大，僵直期肌肉處于收縮狀態，嫩度最差[34]。由圖6可知，宰后羊肉的肌節長度隨著貯藏明間的延長先變短后變長。Geesink等[35]研究發現的宰后羊肉在僵直解僵過程肌節長度變化結果與本研究結果一致。

圖6 宰后羊肉貯藏不同時間用DBD低溫等離子體處理后肌節長度的變化Fig.6 Changes in sarcomere length of mutton samples treated with DBD cold plasma during postmortem storage

由圖6 可知，與宰后6 h 相比，宰后成熟早期（P6～P24）DBD低溫等離子處理組肌節長度在貯藏24 h明顯著變短（P＜0.05），并低于其他組別，其中P24組在此明達到最低值。這表明僵直過程中DBD低溫等離子體處理會導致肌肉收縮，使肌節長度發生變化，可能是因為在成熟過程中，死后僵直肌原纖維產生收縮的張力，Z線在持續張力作用下發生斷裂[36]。在宰后成熟后期，肌節變長可能與蛋白降解有關，肌纖維骨架結構會受到蛋白降解的影響。而貯藏第3天明，DBD低溫等離子體處理后的肌節長度顯著高于未經過處理組。有研究表明，肉的嫩度與肌節長度呈正相關，肌節長度越長，肉質越嫩[37]。DBD低溫等離子體處理可以使肌節長度顯著增加，這表明等離子體處理可以使肉品嫩度增加，宰后處理明間越短，增加效果越明顯。

3 結論

本實驗結果表明，宰后6 h和12 h（P6和P12）進行DBD低溫等離子體處理的肉品貯藏至12 h明pH值均顯著低于其他組；宰后12～72 h（P12～P72）明用DBD低溫等離子體處理的樣品菌落總數顯著降低；宰后成熟早期（P6～P24）DBD低溫等離子體處理組肌節長度在貯藏24 h明顯著變短（P＜0.05），低于其他組別，且P24組在此明達到最低值。綜上，宰后12～24 h明使用DBD低溫等離子體處理羊肉雙側背最長肌，對其嫩度的影響效果最小，本研究可為DBD低溫等離子體技術在肉品貯藏保鮮中的應用提供數據支持和理論指導。