不同加工方式下胡蘿卜對小鼠潰瘍性結腸炎的影響

趙明姣，鐘亞東，張 豪，胡婕倫，熊 濤，聶少平，謝明勇

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，中加食品科學與技術聯合實驗室（南昌），江西 南昌 330047）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因尚不明確、易反復發作的慢性腸道炎癥疾病，其主要臨床表現為體質量減輕、腹瀉、腹痛、便血、腸上皮屏障缺損等[1]，UC發病機制較復雜，主要與環境、免疫、遺傳和腸道微生物等因素有關[2]。近年來結腸炎發病率在世界各地范圍內呈上升趨勢，嚴重地影響了患者的身心健康，成為一個全球性公共衛生問題[3]。目前治療結腸炎的藥物主要為糖皮質激素、氨基水楊酸、免疫抑制劑和生物抑制劑等，但是這些藥物存在副作用大、復發率高、療效單一和價格昂貴等諸多問題[4-5]。研究證實中藥和一些常見的食用菌、蔬菜、水果及其提取物對結腸炎的防治具有較好的效果，并且副作用輕微，受到人們廣泛的關注[6-8]。

胡蘿卜（Daucus carotaL.）營養成分豐富，含有多種與抗炎、抗氧化、免疫調節、抗腫瘤、調節血脂、預防心血管疾病等有關的生物活性成分，如多糖、類胡蘿卜素、多酚、VC和葉酸等[9]，對人體具有良好的保健功效[10-11]。人群隨訪研究發現，每周攝入2～4 個或更多的生胡蘿卜（＞32 g/d）能夠使結直腸癌罹患風險降低17%[12]。本課題組前期的研究發現，10 mL/kgmb的胡蘿卜汁灌胃處理能緩解三硝基苯磺酸誘導的小鼠結腸炎的炎癥反應，抑制氧化損傷，明顯緩解結腸炎癥狀[13]，這些研究結果表明胡蘿卜在預防和緩解UC方面潛力巨大。研究證實，加工方法對食品結構上的修飾能夠顯著影響植物化學物質的釋放、吸收和轉化等，進而改變其生物利用度和生物活性[14]。Zaccari等[15]研究發現蒸煮可將生胡蘿卜中β-胡蘿卜素的生物利用度提高3～16 倍。人群實驗研究表明橙汁經乙醇發酵后類胡蘿卜素的生物利用度顯著提高，可使人血漿中β-隱黃質濃度提高23.6 倍[16]。乳酸菌發酵可有效提高壇紫菜上清液中總酚和總黃酮含量，促進乳酸、精氨酸、脯氨酸等代謝物的釋放，提高抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶抑制活性，具有減緩和鋪助治療糖尿病、肥胖等慢性疾病的潛在功效[17]。然而胡蘿卜經不同加工方式處理后，其在緩解結腸炎方面的效果如何尚不清楚。

因此，本研究通過葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導建立小鼠UC模型，評價不同加工方式下（打漿、高溫蒸煮、發酵）胡蘿卜對小鼠UC的影響，以期為胡蘿卜產品的進一步開發提供科學依據，為膳食預防和緩解UC提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級5 周齡C57BL/6J雄性小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。

AIN93G飼料定制自江蘇帆泊生物技術有限公司。

新鮮黃胡蘿卜購自天虹商場（產地安徽）；乳酸菌混合發酵劑（植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌）由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室熊濤老師課題組提供。

膳食纖維檢測試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司；α-淀粉酶（10080）、胃蛋白酶（P6887）、胰酶（P7545）美國Sigma-Aldrich公司；豬膽粉（LA1090）、4%組織固定液 北京索萊寶科技有限公司；葡聚糖硫酸鈉美國MP Biomedical公司；蘇木精、伊紅染料和阿利新藍-過碘酸席夫（Alcian blue-periodic acid Schiff，AB-PAS）染液 武漢賽維爾生物有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10和IL-1β酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 江蘇酶免生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（WST-8法）和脂質氧化（丙二醛（malondialdehyde，MDA））檢測試劑盒 上海碧云天科技有限公司；其他試劑都為國產分析純。

1.2 儀器與設備

破壁機 九陽股份有限公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；恒溫培養箱 上海森信實驗儀器公司；FreeZone?冷凍干燥機 美國Labconco公司；iMark多功能酶標儀美國Bio-Rad公司；KZ-II組織破碎儀 武漢賽維爾生物科技有限公司；冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Aperio LV1型病理切片掃描儀 德國Leica儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同加工方式胡蘿卜的制備

挑選新鮮的胡蘿卜，自來水清洗干凈，切成厚度約0.5 cm的片狀，加水（m（胡蘿卜）∶m（水）＝1∶1）打漿2 min，得到打漿胡蘿卜（RCP）。將打漿胡蘿卜105 ℃蒸煮20 min，得到高溫蒸煮胡蘿卜（SCP）。高溫蒸煮胡蘿卜快速冷卻至室溫，在無菌條件下接種0.02%（終質量分數）乳酸菌混合發酵劑，混勻，于37 ℃靜置發酵42 h，滅菌后（105 ℃，20 min）即得發酵胡蘿卜（FCP），3 種加工方式胡蘿卜于-20 ℃避光保存。

1.3.2 胡蘿卜類胡蘿卜素、膳食纖維含量測定

類胡蘿卜素的提取與測定參照文獻[18]的方法稍作調整。胡蘿卜與混合提取液（V（乙醇）∶V（正己烷）∶V（丙酮）＝1∶2∶1）以1∶3（m/V）比例混勻，45 ℃超聲30 min，多次重復提取至接近無色，離心（8 000 r/min，10 min），收集上層溶液，旋轉蒸發，正己烷定容。用紫外分光光度計于450 nm波長處測定吸光度，以正己烷作對照。

膳食纖維含量測定參照GB 5009.88—2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》。

1.3.3 類胡蘿卜素生物可及性的測定

本研究通過靜態體外消化模型測定類胡蘿卜素的生物可及性，體外模擬消化過程參考文獻[19]的方法。消化完成后離心（12 000 r/min，20 min），參考文獻[20]的方法從消化液中分離出含有混合膠束的上清液，加入混合提取液萃取、旋蒸、定容，用紫外分光光度計測定消化液中類胡蘿卜素含量，按照Wellala等[21]的方法計算類胡蘿卜素生物可及性。

1.3.4 小鼠飼料配方的確定

以《中國居民膳食指南》成年人（60 kg）每日新鮮蔬菜攝入推薦量（500 g）為參照，預設小鼠飲食劑量為3 g/d，按照成年人與小鼠的體質量-劑量折算關系進行換算[22]，最終得出AIN93G飼料中胡蘿卜凍干粉添加量為5.05%（以干質量計）。根據胡蘿卜的添加量及膳食纖維含量，調整干預組飼料中的淀粉與纖維素比例，飼料成分如表1所示。

表1 飼料成分表Table 1 Composition of experimental diets

1.3.5 動物實驗設計及分組

小鼠在室溫（25±0.5）℃和相對濕度（50±5）%環境下飼養，光/暗循環為12 h/12 h，所有小鼠適應性靜養一周后，按體質量隨機分成5 組（n＝10）：正常組（Normal組）、模型組（Model組）、打漿胡蘿卜組（RCP組）、高溫蒸煮胡蘿卜組（SCP組）和發酵胡蘿卜組（FCP組）。Normal和Model組全程給予AIN93G純化飼料，RCP、SCP和FCP組分別給予添加了打漿胡蘿卜、高溫蒸煮胡蘿卜和發酵胡蘿卜的定制飼料。實驗期間每天觀察并記錄小鼠的進食量、飲水量及體質量變化。飼喂7 d后，除Normal組外，其他組飲水更換為3% DSS進行造模；造模7 d后，停止給予DSS，24 h后，小鼠脫頸處死，量取結腸長度并記錄，收集小鼠各器官部分保存于-80 ℃冰箱或多聚甲醛溶液中。動物實驗設計如圖1所示。本研究中涉及動物的所有程序均按照國家衛生研究院實驗動物護理和使用指南進行，并經南昌大學實驗動物科學中心倫理委員會批準。

圖1 動物實驗設計Fig.1 Animal experimental design

1.3.6 疾病活動指數測定

造模期間，按照Wirtz等[23]的評分標準對小鼠的糞便性狀、便血情況和體質量下降情況進行評分，疾病活動指數（disease activity index，DAI）為3 個指標得分總分的平均值。

1.3.7 組織病理學觀察

結腸組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，經石蠟包埋、切片、脫蠟后用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，中性樹膠封片后于病理掃描切片儀下觀察結腸組織形態，根據Kang Yifei等[24]所描述的標準進行組織學損傷評分，得分為3 個指標評分之和。

1.3.8 小鼠結腸炎癥因子測定

根據ELISA試劑盒說明書測定小鼠結腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量。

1.3.9 結腸組織氧化應激指標的測定

精確稱取結腸組織，加入適量勻漿液勻漿混勻，按照相應試劑盒的說明，分別測定SOD活力和MDA含量。

1.3.10 AB-PAS染色

結腸組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，經石蠟包埋、切片、脫蠟后用AB-PAS染液進行浸染，經無水乙醇脫水，中性樹膠封片后在病理切片掃描儀下采集切片圖像信息，采用Image pro plus 6.0軟件對切片中杯狀細胞數量進行計算。

1.3.11 免疫組化檢測緊密連接蛋白的表達測定

將結腸切片進行脫蠟水化，再進行高壓抗原修復，使用體積分數3%的H2O2去離子水37 ℃孵育，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L pH 7.4）洗滌3 次；采用山羊血清孵育30 min，然后滴加一抗4 ℃過夜，PBS洗滌3 次，滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3 次。使用3,3-二氨基聯苯胺顯色，并用蘇木素進行復染，中性樹膠封片。用病理切片掃描儀觀察并拍照。細胞核為藍色，蛋白陽性表達為棕黃色。采用Image pro plus軟件按下式計算圖像中的蛋白表達面積百分比。

1.3.12 短鏈脂肪酸含量測定

稱取適量小鼠結腸內容物并記錄質量，加入0.6 mL生理鹽水和研磨珠，勻漿（70 Hz，1 min），渦旋1 min，13 000 r/min離心5 min，吸取0.5 mL上清液，加入0.2 mL體積分數10%硫酸溶液渦旋1 min混勻，加入0.4 mL無水乙醚，渦旋混勻，靜置2 min，13 000 r/min離心2 min，上清液過0.22 μm有機濾頭后上機，色譜條件參照鄭志天等[25]的研究條件。

1.4 數據處理與分析

統計結果以平均值±標準差表示。使用SPSS 26.0軟件對實驗數據進行統計分析，采用單因素方差分析及Tukey多重比較檢驗（P＜0.05被認為差異顯著，P＜0.1為傾向于顯著變化），采用GraphPad Prism 8.3軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 胡蘿卜主要成分及類胡蘿卜素生物可及性變化

由表2可知，高溫蒸煮處理對類胡蘿卜素含量無顯著影響，但可顯著降低可溶性、不溶性和總膳食纖維含量（P＜0.05），進一步的發酵處理不僅抑制了可溶性膳食纖維含量的顯著降低，且顯著提高了其在總膳食纖維中的比例（P＜0.05）。另外，加工方式顯著改變了胡蘿卜素的生物可及性，由大到小依次為FCP＞SCP＞RCP（P＜0.05）。

表2 胡蘿卜主要成分及類胡蘿卜素生物可及性變化Table 2 Changes of main components and carotenoid bioaccessibility in carrots

2.2 小鼠進食量和飲水量變化

實驗期間對各組小鼠的進食量和飲水量進行統計分析，計算每只小鼠每日平均進食量和飲水量，結果如圖2所示，在第1～10天，各組小鼠平均進食量穩定在2～3 g之間，飲水量穩定在2.7～4.0 g之間，各組小鼠之間進食量和飲水量無明顯差異。在第14天，與Normal組相比，DSS處理組小鼠的進食量和飲水量均顯著減少（P＜0.05），然而飼喂RCP、SCP和FCP對兩者無顯著性影響。

圖2 小鼠進食量（A）和飲水量（B）Fig.2 Food intake (A) and water consumption (B) of mice

2.3 胡蘿卜對小鼠體質量及疾病活動指數的影響

體質量變化和DAI能直觀地反映小鼠的健康狀況，是評價疾病發展的重要指標[26]。如圖3所示，飲用3% DSS的小鼠在實驗的第11天開始體質量下降，糞便稀松，部分出現腹瀉、肉眼血便的情況，隨著造模明間的延長病情逐漸加重，小鼠出現精神萎靡、體質量急劇下降、肛門腫脹、糞便呈水樣狀且帶血等現象。在第14天，Model組小鼠體質量下降至原體質量的85.6%，DAI增加到3.50，這表明急性UC模型造模成功。在第14天，與Model組相比，各胡蘿卜組干預均能顯著減緩DSS誘導的小鼠體質量減輕，并降低DAI（P＜0.05）。

圖3 胡蘿卜對小鼠體質量變化率（A）和DAI（B）的影響Fig.3 Effect of carrot-supplemented diet on the percentage change of body mass (A) and disease activity index (B) in mice

2.4 胡蘿卜對小鼠結腸長度和結腸組織病理的影響

如圖4所示，與Normal組相比，Model組小鼠結腸出現了明顯的水腫、充血、黏連等癥狀，結腸長度顯著降低（（6.77±0.52）cm對比（4.66±0.36）cm）（P＜0.05），HE染色結果顯示Model組小鼠結腸上皮細胞損傷嚴重，隱窩結構變形或大范圍消失，出現炎癥細胞浸潤；而經RCP、SCP和FCP干預后的小鼠結腸長度（（5.03±0.42）、（5.31±0.34）cm和（5.33±0.31）cm）和外觀均有所改善，HE染色結果顯示小鼠結腸結構較為完整，組織損傷輕微，黏膜上皮結構較為完整，隱窩結構基本完整與規則，其中SCP和FCP能顯著抑制結腸炎小鼠結腸縮短和減輕結腸組織損傷（P＜0.05）。

圖4 胡蘿卜對小鼠結腸長度和病理損傷的影響Fig.4 Effect of carrots on colonic length and pathological injury in mice

2.5 胡蘿卜對小鼠結腸炎癥因子的影響

如圖5所示，與Normal組相比，Model組小鼠結腸組織中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高（P＜0.05），IL-10水平顯著下降（P＜0.05），表明Model組小鼠發生了炎癥反應。與Model組相比，各胡蘿卜組小鼠結腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著降低（P＜0.05），IL-10水平顯著升高（P＜0.05）。FCP對DSS誘導的結腸組織IL-6含量升高的抑制作用顯著優于RCP和SCP（P＜0.05）。

圖5 胡蘿卜對小鼠結腸炎癥因子的影響Fig.5 Effect of carrots on colonic inflammatory factors in mice

2.6 胡蘿卜對結腸氧化應激的影響

如圖6所示，與Normal組相比，Model組結腸組織MDA水平顯著升高（P＜0.05）、抗氧化酶SOD水平顯著降低（P＜0.05），而FCP干預可顯著抑制DSS誘導的結腸組織MDA水平升高（P＜0.05）。

圖6 胡蘿卜對小鼠結腸氧化應激的影響Fig.6 Effect of carrots on colonic oxidative stress in mice

2.7 胡蘿卜對杯狀細胞的影響

黏液層主要由杯狀細胞及其分泌的黏蛋白組成，結腸組織中過多的炎癥細胞因子會引起杯狀細胞凋亡，導致黏膜屏障完整性被破壞[27]。如圖7所示，Model組與Normal組相比，結腸杯狀細胞數量顯著減少（（167±41）個對比（473±53）個）（P＜0.05），有些隱窩結構中幾乎不含杯狀細胞，表明DSS處理能夠誘導結腸組織杯狀細胞衰竭。胡蘿卜組小鼠結腸組織杯狀細胞均勻地分布在隱窩當中，其中FCP干預顯著增加了結腸炎小鼠結腸杯狀細胞的數量（P＜0.05），這說明FCP可以改善結腸炎小鼠杯狀細胞減少，其可能通過刺激杯狀細胞增殖并分泌黏液來維持腸道屏障的完整性。

2.8 胡蘿卜對緊密連接蛋白表達的影響

腸上皮緊密連接蛋白（ZO-1、Claudin-1和Occludin）是腸道屏障的重要組成部分，其表達的減少會引起免疫反應失調，從而誘發腸道炎癥[28]。如圖8免疫組化染色結果顯示，Normal組中ZO-1、Claudin-1和Occludin的表達量較高，主要分布在結腸組織表面與隱窩結構之間，排列整齊，呈連續分布；在Model組中，3 種緊密連接蛋白的表達量均顯著降低（P＜0.05），且排列紊亂，呈不連續分布，部分區域甚至出現完全丟失的情況；在RCP、SCP和FCP組中3 種蛋白的表達量均顯著高于Model組（P＜0.05），表明胡蘿卜通過調節緊密連接蛋白表達改善腸道機械屏障，這可能是緩解結腸炎的一個重要原因。

圖8 胡蘿卜對小鼠結腸緊密連接蛋白表達的影響Fig.8 Effect of carrots on colonic expression of tight junction proteins in mice

2.9 胡蘿卜對結腸內容物短鏈脂肪酸的影響

如圖9所示，與Normal組相比，Model組小鼠結腸內容物中丙酸和異丁酸水平顯著降低（P＜0.05），表明DSS處理誘導了小鼠腸道環境紊亂。與Model組相比，FCP組丁酸水平顯著增加（P＜0.05），丙酸水平傾向于顯著增加（P＜0.1），且后者丁酸和丙酸水平與Normal組無顯著差異。

圖9 胡蘿卜對小鼠結腸內容物短鏈脂肪酸水平的影響Fig.9 Effect of carrots on colonic levels of short-chain fatty acids in mice

3 討論

本研究結果顯示，3 種不同方式加工（打漿、高溫蒸煮、發酵）的胡蘿卜均可在不同程度上減輕小鼠UC，其中發酵胡蘿卜的改善作用最佳，高溫蒸煮胡蘿卜次之。本研究推測，胡蘿卜對結腸炎的緩解作用可能歸因于其抗炎特性和對腸道屏障的保護作用，且加工處理改善了胡蘿卜中功能物質的含量和/或性質，從而加強了其抗結腸炎作用。促炎因子和抗炎因子的平衡紊亂是UC發病機制之一，當結腸炎發生明，促炎因子和抗炎因子會發生相應的變化，前者大量釋放，后者的生成被抑制，導致炎癥反應加劇[29]。本研究發現，3 種加工方式下的胡蘿卜均可顯著降低促炎因子水平，并提升抗炎因子水平，這表明胡蘿卜在調節二者之間的平衡方面表現出良好的效果。此外，UC的典型癥狀是腸上皮屏障的緊密性和完整性被破壞，多項研究證實，腸上皮屏障的破壞與ZO-1、Claudin-1和Occludin的表達減少有關[30-32]。本研究發現緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin在所有胡蘿卜組均具有較高的表達，進而能夠加強腸道上皮屏障完整性。同明，結腸炎發生過程中也會產生大量的氧自由基，損傷腸黏膜，破壞腸道屏障[33]，而胡蘿卜及其制品具有較強的抗氧化活性可能是其保護腸道屏障功能的重要因素之一[34]。

胡蘿卜中富含類胡蘿卜素、多糖、多酚等多種功能物質，食品加工技術不僅可以促進這些物質的釋放，也可產生有益代謝物，更好地發揮抗炎效果，進一步幫助減輕結腸炎癥[35-36]。膳食纖維作為胡蘿卜的主要功能物質，本研究結果表明高溫蒸煮可顯著降低其含量，但進一步的發酵則抑制了以水溶性多糖為主的可溶性膳食纖維含量的降低。而萬宇俊[37]發現益生菌發酵不僅提高了胡蘿卜原漿的水溶性多糖得率，同明還改變了多糖的基本結構，導致其對2型糖尿病大鼠的健康改善作用更好。推測發酵引起的多糖性質改善可能是導致本研究中FCP效果最優的原因之一。同明，FCP顯著增加了多糖-菌群的代謝產物丁酸的含量，顯著抑制了結腸組織IL-6水平的升高。丁酸可能通過抑制炎癥細胞因子級聯反應發揮抗炎作用，進而抑制腸道IL-6生成。此外，丁酸還能夠促進腸道黏膜細胞的增殖，參與增強腸道屏障[38]，這進一步解釋了前文FCP可以改善結腸杯狀細胞數量減少的現象。

然而，本研究發現高溫蒸煮也可增強胡蘿卜的抗結腸炎作用，具體表現為對結腸縮短和病理損傷的抑制作用增強，表明膳食纖維之外的其他活性物質也參與其中。類胡蘿卜素是胡蘿卜中最廣為熟知的活性物質，多項研究均表明其具有良好的抗結腸炎作用[39-40]。這類物質的生物利用過程包括胃腸道消化（釋放）、吸收、代謝和排泄[41]。研究證實高溫、發酵等加工方式可以顯著增加類胡蘿卜素的釋放和吸收，提高其生理功能[34,42-43]。本研究結果表明高溫蒸煮和發酵對類胡蘿卜素含量無影響但可增加其生物可及性，且后者與抗結腸炎作用呈一定的劑量-效應關系，體現出類胡蘿卜素生物可及性的重要性。此外，多酚可能也是重要的抗結腸炎物質。Kim等[44]通過比較紫胡蘿卜與黃胡蘿卜的抗結腸炎癥作用及其多酚含量，總結出豐富的花青素含量是紫胡蘿卜具有較優效果的原因之一。本課題組前期發現益生菌發酵胡蘿卜原漿可顯著提高多酚含量及其體外抗氧化能力，而Yu Chenchen等[45]也有相似的發現。

胡蘿卜作為一個整體的食物，其中的有效成分十分復雜，其緩解結腸炎的作用應是多種有效成分共同作用的結果。這些活性成分如何聯系起來改善結腸炎的機制是非常復雜的，未來應繼續探索這些活性成分的協同作用。

綜上所述，高溫蒸煮和發酵可改變打漿胡蘿卜中膳食纖維含量及類胡蘿卜素生物可及性，增強其對小鼠UC的緩解作用，其中發酵胡蘿卜改善作用更為顯著。