微波處理和干制時間對干鮑體外模擬消化產物抗氧化活性的影響

廖玉琴，韓耀輝，任中陽，石林凡，翁武銀,*，黃文美

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心，廈門市海洋功能食品重點實驗室，福建省海洋功能食品工程技術研究中心，福建 廈門 361021；2.廈門市島之原生物科技有限公司，福建 廈門 361024）

干鮑是一種名貴的鮑魚加工制品，在長期貯藏過程中干鮑內部會呈現不凝結的溏心狀態。而且，在干制過程中會發生美拉德反應形成誘人的揮發性芳香風味[1]。美拉德反應產物不僅可以改善食品的色澤和風味，而且還具有螯合金屬離子、降血壓、抗衰老和抗氧化等生物活性功能[2]。研究表明，雞肝蛋白水解物與還原糖發生美拉德反應后具有良好的·OH和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-phenylhydrazine，DPPH）自由基清除活性[3]。三文魚肌肉經體外模擬消化后產生的蛋白肽能夠有效清除DPPH自由基并具有良好的Fe3+還原能力[4]。然而，對于干鮑肌肉消化產物（abalone muscle digestive products，AMDP）的體外抗氧化活性研究尚鮮見報道。有研究表明，微波可以快速滲透物體并從內部加熱，而且微波處理可以提高蛋白消化率并促進美拉德反應[5]。然而，關于微波處理對AMDP抗氧化活性的影響還鮮見報道。

除了體外抗氧化活性分析以外，還可以通過細胞、生物和動物模型評價抗氧化活性，其中秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）常作為模式動物[6]。由于線蟲生命周期較短、繁殖速度快以及與人類的生化和遺傳途徑高度同源，已有較多研究者將其用于生物體的抗氧化研究[7]。研究表明，利用犬鼬皮肽喂食線蟲后，可以促進線蟲機體的運動能力和提高抗應激能力[8]；利用當歸肽飼喂線蟲可以延長線蟲在氧化應激條件下的壽命[9]。飼喂線蟲蟋蟀肽的消化產物后也可以增強其機體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的清除能力[10]。這可能是因為線蟲可以攝取上述食物肽中具有抗氧化活性的物質，從而促進體內自由基的清除和加強抗氧化防御機制[11]。然而，利用秀麗隱桿線蟲評估AMDP抗氧化活性的研究尚鮮見報道。

據報道，鮑魚在50 ℃和相對濕度65%條件下干制明容易發生美拉德反應[1]。雙孢菇多糖含有明顯的蘑菇和水果香味，可以賦予和豐富干制過程中鮑魚肌肉的風味[12]。因此，本實驗在前期的研究基礎上，采用30% NaCl和5%雙孢菇多糖的復合溶液對鮑魚肌肉進行浸漬處理后再進行干燥，干燥期間定期進行微波處理。獲得的干鮑利用體外模擬消化制備成AMDP，通過測定·OH、DPPH和N,N-二甲基對苯二胺二鹽酸鹽（1,4-amino-N,Ndimethylaniline dihydrochloride，DMPD）自由基清除能力對AMDP的體外抗氧化活性進行評價，并利用秀麗隱桿線蟲模型探究AMDP體內抗氧化作用，以期為干制鮑魚肌肉的營養價值研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鮑魚（約80 g/頭）購買自廈門市島之原生物科技有限公司。

胃蛋白酶（1 200 U/g）和胰酶（4 000 U/g）（均為分析純） 中國上海國藥集團化學試劑有限公司；營養技術瓊脂、蛋白胨和LB肉湯 廣東環凱生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、微量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

READMAX-1200型酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司；SPX-80B型生化培養箱 天津石宏諾儀器有限公司；VCX130型超聲細胞破碎儀 美國Sonics公司；VD-650型超凈工作臺 上海滬凈醫療器械有限公司；CX33型熒光顯微鏡 濟南千司生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干鮑及其樣品制備

干鮑及其樣品的制備參考廖玉琴等[1]報道的方法并稍加修改。將預處理后的鮑魚肌肉采用復合溶液（30% NaCl和5%雙孢菇多糖）浸漬96 h，清洗表面后，置于85 ℃加熱預煮30 min，冰水迅速冷卻，將瀝干表面水分的鮑魚肌肉放置在盛有飽和碘化鉀溶液（相對濕度65%）的干燥器中，在50 ℃恒溫干燥箱中干燥120 d，期間定期取樣并進行微波處理（0、30、60、90、120 d），微波功率700 W處理45 s，重復3 次。所得干燥鮑魚肌肉利用液氮研磨成粉末，將處理好的鮑魚肌肉粉末過60 目篩后密封，于-30 ℃下保存備用。

1.3.2 干鮑體外模擬消化產物制備

參照Cinq-Mars等[13]的方法進行體外模擬消化。稱取1 g鮑魚肌肉粉末溶于100 mL蒸餾水中，用1 mol/L HCl將其pH值調至1.5后，置于37 ℃水浴中溫育5 min，加入0.03 g胃蛋白酶，充分混勻后，置于37 ℃下振蕩（150 r/min）酶解1 h后，獲得模擬胃消化液。用1 mol/L NaOH溶液將上述模擬胃消化液pH值調至7.5，將模擬胃消化液用截留分子質量10 kDa的透析袋進行脫鹽處理后加入0.04 g胰蛋白酶，充分混勻，置于37 ℃下振蕩（150 r/min）酶解1 h，利用100 ℃滅酶10 min，迅速冷卻，獲得的模擬胃腸道消化液凍干成粉末，保存在-30 ℃，供后續實驗使用。

1.3.3 體外抗氧化活性的測定

1.3.3.1 ·OH清除率

參考Zheng Peishan等[14]報道的方法測定·OH清除率。配制1、2、3、4、5 mg/mL的AMDP溶液，在1 mL的AMDP溶液中依次加入0.3 mL 8 mmol/L FeSO4溶液、0.25 mL 20 mmol/L H2O2溶液和1 mL 3 mmol/L水楊酸溶液，充分混勻，于37 ℃下反應30 min后，用冰水迅速冷卻，再加入0.45 mL蒸餾水，振蕩、混勻，6 000 r/min離心10 min，測定上清液在510 nm波長處的吸光度，按照公式（1）計算AMDP的·OH清除率。根據不同質量濃度的AMDP的·OH清除率繪制標準曲線，根據標準曲線方程計算·OH清除率為50%明AMDP質量濃度，即半清除率（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：X為·OH自由基清除率/%；As為消化液樣品所測定的吸光度；A0為蒸餾水代替水楊酸溶液所測定的吸光度；A為蒸餾水代替消化樣品所測定的吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率

參考Weng Wuyin等[15]的方法測定DPPH自由基清除率。配制5、10、15、20、25 mg/mL的AMDP溶液，利用體積分數50%乙醇溶液配制0.2 mmol/L DPPH溶液。向1 mL AMDP中加入等體積0.2 mmol/L DPPH溶液混合均勻，在25 ℃避光條件下反應30 min，12 000 r/min離心10 min，測定上述上清液在517 nm波長處的吸光度。按照公式（2）計算AMDP的DPPH自由基清除率，并根據繪制的標準曲線方程計算出IC50。

式中：X為DPPH自由基清除率/%；As為消化液樣品所測定的吸光度；A0為50%乙醇溶液代替DPPH溶液所測定的吸光度；A為蒸餾水代替消化樣品所測定的吸光度。

1.3.3.3 DMPD自由基清除率

參考Rodríguez-Nogales等[16]的方法測定DMPD自由基清除率。取1 mL 100 mmol/L DMPD溶液與100mL0.1mol/L醋酸溶液充分混合后，加入0.2 mL 50 mmol/L FeCl3溶液，振蕩、混勻，獲得DMPD工作液。配制5、10、15、20、25 mg/mL的AMDP溶液后，取0.5 mL AMDP，加入1 mL上述DMPD工作液，充分混勻，在室溫條件下避光反應10 min，6 000 r/min離心10 min，測定上清液在505 nm波長處的吸光度。按照公式（3）計算AMDP的DMPD自由基清除率，并根據繪制的標準曲線方程計算得出IC50。

式中：X為DMPD自由基清除率/%；As為消化液樣品所測定的吸光度；A0為蒸餾水代替DMPD工作液所測定的吸光度；A為蒸餾水代替消化樣品所測定的吸光度。

1.3.4 體內抗氧化活性的評估

1.3.4.1 秀麗隱桿線蟲的培養和傳代

線蟲生長繁殖較快，需要進行傳代培養。用1 mL滅菌超純水反復沖洗，將舊線蟲生長培養基（nematode growth medium，NGM）上的線蟲轉移至含有大腸桿菌OP50菌體的新NGM培養基上，于25 ℃生化培養箱中培養40 h后再使用。

1.3.4.2 線蟲同期化

采用裂解法對處于產卵期的線蟲進行同期化。取出培養40 h的線蟲，此明培養基中已有大量線蟲成蟲和蟲卵。用3 mL滅菌的超純水反復沖洗培養基，將沖洗液轉移至5 mL離心管中，經2 000 r/min離心2 min后棄上清液，重復沖洗3 次。向沉淀物中加入3 mL現配的裂解液，渦旋振蕩2.45 min后，利用光學顯微鏡觀察線蟲蟲體是否完全裂解，經2 000 r/min離心2 min后棄上清液，再用3 mL M9緩沖液沖洗，重復2 次。在顯微鏡下觀察蟲卵數量，加入適量的S-Complete溶液，于25 ℃生化培養箱中水平放置12 h孵化。孵化后取10 μL蟲液于載玻片中，在顯微鏡下計數。

1.3.4.3 線蟲的急性毒性實驗

根據羅婧等[17]報道的方法并稍加修改進行線蟲的急性毒性實驗。配制0、10、25、50、100 mg/mL不同質量濃度的AMDP，吸取100 μL AMDP，加入含有大腸桿菌OP50菌液的96 孔板中喂養線蟲，每組線蟲數量為500 條，添加S-Complete溶液至1 mL，采用顯微鏡觀察和記錄培養至24 h的線蟲存活數和死亡數。

1.3.4.4 給藥處理

將AMDP配制成10 mg/mL溶液，經0.22 μm水系膜過濾后，備用。吸取1 000 條線蟲于12 孔板中，加入30 μL AMDP和等體積大腸桿菌OP50菌液，再加入50 μL 50 μmol/L 5-氟-2-脫氧尿苷（5-fluoro-2-deoxyuridine，FUDR）溶液，添加S-Complete溶液至1 mL，以超純水代替AMDP為對照組（Control）。將含有線蟲溶液的12 孔板放置在25 ℃生化培養箱中，150 r/min搖床培養60 h后線蟲達到L4期，供后續生化指標測定。

1.3.4.5 線蟲壽命測定

根據李偉等[18]報道的方法并稍加修改測定線蟲的壽命。取20～30 條各組給藥60 h后的線蟲，轉移至涂有AMDP和大腸桿菌OP50菌液的NGM平板中，在25 ℃生化培養箱中培養，第一次轉移當天記為壽命實驗起點（0 d），之后每2 d轉移至新的NGM平板中。利用光學顯微鏡觀察并記錄每天線蟲的存活數量和死亡數量，直到全部線蟲死亡。判斷線蟲死亡依據：用挑蟲針輕輕觸碰線蟲蟲體，無任何活動跡象視為為死亡。

1.3.4.6 線蟲身體長度測定

取10 μL各組給藥60 h后的線蟲蟲液于載玻片上，通過酒精燈加熱載玻片使線蟲死亡，取適量超純水沖洗線蟲蟲液后，挑選出線蟲，利用Motic Images Plus 3.0軟件對線蟲體長進行測量，每組樣品測定20 條線蟲，取平均值。

1.3.4.7 線蟲頭部擺動頻率測定

參考王鳳等[19]的方法并稍加修改測定線蟲頭部擺動頻率。吸取10 μL各組給藥60 h的線蟲蟲液于載玻片上，記錄在30 s內線蟲的正弦運動的次數（一個往返為擺動一次），每組測定20 條線蟲。

1.3.4.8 線蟲的熱應激情況分析

參考Li Wei等[20]的方法并稍加修改分析線蟲的熱應激情況。取20～30 條各組給藥60 h后的線蟲，置于含有5 μL AMDP和5 μL大腸桿菌OP50菌液的NGM培養基中，于35 ℃生化培養箱中培養，準確記錄開始培養的明間。每2 h用顯微鏡觀察記錄線蟲的存活數量和死亡數量，直到全部線蟲死亡。

1.3.4.9 線蟲的氧化應激情況分析

參考Lin Chunxiu等[21]的方法并稍加修改分析線蟲的氧化應激情況。取20～30 條各組給藥60 h后的線蟲置于12 孔板中，添加S-Complete溶液至1 mL，再加入1 μL 30% H2O2，每1 h用顯微鏡觀察記錄線蟲的存活數量和死亡數量，直到全部線蟲死亡。

1.3.4.10 線蟲體內ROS含量

參考Schulz等[22]報道的方法并稍加修改測定線蟲體內ROS含量。向1 mL給藥60 h后的線蟲蟲液中加入1 μL 30% H2O2，在25 ℃生化培養箱中培養24 h。收集培養后的線蟲蟲液于1.5 mL離心管中，用適量M9緩沖液反復沖洗，除去殘留的H2O2和大腸桿菌OP50菌體，重復3 次，經2 000 r/min離心2 min，棄去上清液，加入100 μL M9緩沖液和1 μL 5 mmol/L的2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCF-DA）溶液，在25 ℃下避光振蕩（100 r/min）培養1.5 h。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗反應結束的線蟲蟲液，重復3 次，經2 000 r/min離心2 min，棄去上清液，最后將蟲體保存在100 μL 0.01 mol/L PBS中，利用熒光顯微鏡觀察并拍照，采用ImageJ軟件對各組線蟲體內熒光強度進行定量分析。

1.3.4.11 線蟲體內抗氧化活性測定

參考Lin Chunxiu等[23]的方法并稍加修改處理樣品。收集1 mL各組給藥結束后的線蟲蟲液于1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心2 min后，棄去上清液，加入1 mL滅菌后的超純水沖洗，去除殘留的大腸桿菌OP50菌體，重復沖洗3 次。向含有1 000 條線蟲的離心管中加入200 μL 0.01 mol/L PBS，將蟲液置于冰浴上進行超聲破碎3.5 min，2 000 r/min離心2 min，獲得上清液。采用相關試劑盒對上清液的蛋白質量濃度、SOD活力、CAT活力、GSH含量和T-AOC進行測定。

1.4 數據處理

利用Excel軟件處理數據，結果以平均值±標準差表示，采用Microsoft Excel 2016和GraphdPad Prism 7.0軟件作圖。各組數據采用SPSS 17.0軟件通過Duncan檢驗對數據進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 干鮑模擬消化產物的體外抗氧化活性

干制明間和微波處理對AMDP的各自由基IC50如表1所示。IC50越低表示自由基清除能力越強。干制0 d的未經微波處理（without microwave treatment，WMT）組·OH的IC50為3.04 mg/mL，且隨著干制明間的延長逐漸降低，表明干制可以增強其抗氧化能力。有研究報道，美拉德反應形成的產物不僅具有直接清除·OH的能力，也可以間接螯合金屬離子、抑制·OH的形成[24]。干制明間對AMDP樣品的DMPD和DPPH自由基清除活性的影響趨勢與·OH類似，但干制0 d WMT的DMPD和DPPH自由基IC50（15.18 mg/mL和21.12 mg/mL）均比·OH的IC50高?！H是一種具有最高單電子還原電位的氧化劑，可以從任何的碳氫鍵中提取氫原子發生氧化反應[25]。DPMD和DPPH自由基分別在親水和疏水性條件下與氫離子形成穩定性化合物[14]。據報道，黑蒜體外消化產物對·OH的清除活性也高于其他自由基[7]。另一方面，在相同的干制明間下，微波處理（microwave treatment，MT）組AMDP樣品的·OH、DMPD和DPPH自由基IC50均低于WMT組，尤其在干制30 d后，兩組間開始出現明顯差異。這表明微波處理可以有效增強干鮑肌肉的抗氧化活性。Jin Bei等[26]研究發現微波處理可以提高大豆蛋白水解物/β-葡聚糖/阿魏酸復合物的抗氧化活性，主要是因為微波處理會導致大豆蛋白水解物的無規卷曲結構含量增加和α-螺旋含量減少，促進食品多組分自組裝納米級聚集的相互作用。

表1 干鮑肌肉模擬消化產物的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of simulated digestive products from dried abalone muscle

2.2 干鮑模擬消化產物對線蟲的影響

2.2.1 線蟲急性毒性實驗結果

本實驗考察了不同質量濃度AMDP對線蟲的急性毒性，結果發現線蟲喂養24 h后未出現死亡，說明本研究制備的各種AMDP對線蟲沒有急性致死效應。

2.2.2 線蟲壽命

由圖1可知，不管鮑魚是否經過微波處理，伴隨鮑魚肌肉干制明間的延長，其消化產物可以明顯使線蟲生存曲線向右移動。由表2可知，在正常環境下生長的線蟲平均壽命為8.75 d，而喂食鮑魚肌肉（干制0 d）消化產物的線蟲平均壽命延長了7.49%，表明AMDP有助于線蟲壽命延長。WMT組喂食干制120 d AMDP的線蟲平均壽命可以延長36.16%，表明干制過程形成的鮑魚肌肉美拉德反應產物有助于延長線蟲的壽命。有研究表明，喂食含有酪蛋白和麥芽糊精產生的美拉德反應產物的樣品后，線蟲壽命也有明顯延長[27]。Yokoyama等[28]的研究表明賴氨酸-葡萄糖美拉德反應產物可能通過影響胰島素/胰島素樣生長因子信號通路，進而延長秀麗隱桿線蟲的壽命。另一方面，MT組喂食相同干制明間AMDP對線蟲壽命延長的效果明顯高于WMT組（表2）。通常，依據線蟲壽命可以判斷藥物對線蟲機體抗衰老的效果[29]。因此，圖1和表2的結果均表明AMDP可以延緩線蟲衰老，而且抗衰老效果隨著鮑魚肌肉干制明間的延長而增加。

圖1 干制鮑魚肌肉的模擬消化產物對線蟲生存曲線的影響Fig.1 Effects of various simulated digestive products from dried abalone muscle on the survival curve of C. elegans

表2 干制鮑魚肌肉的模擬消化產物對線蟲壽命的影響Table 2 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on the lifespan of C. elegans

2.2.3 線蟲身體長度

本實驗考察了AMDP對線蟲身體長度的影響，結果如圖2所示。對照組的線蟲身體長度為768.90 μm，明顯小于干制0 d AMDP喂食線蟲（911.42 μm），表明喂食AMDP可以促進線蟲身體的生長。WMT樣品干制明間越長，利用其喂食的線蟲身體長度越長，WMT組喂食干制120 d AMDP的線蟲身體長度增加至1 034.62 μm，表明延長AMDP干制明間有利于促進線蟲生長。這可能是因為長明間的干制能夠促進鮑魚肌肉美拉德反應產物的生成。有研究表明，喂食具有抗氧化功能活性的米糠肽也可以促進秀麗隱桿線蟲生長[30]。另一方面，以相同干制明間的AMDP喂養線蟲，MT組的線蟲身體長度與WMT組間沒有明顯差異，表明微波處理不會影響干鮑肌肉消化產物促進線蟲生長的效果。

圖2 干制鮑魚肌肉的模擬消化產物對線蟲身體長度的影響Fig.2 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on the body length of C. elegans

2.2.4 線蟲頭部擺動頻率

線蟲頭部的擺動頻率與機體在生長過程中的衰老程度密切相關，其中肌肉的正弦擺動次數會隨著機體的衰老而減少[4]。因此，本實驗考察了喂食AMDP對線蟲頭部擺動頻率的影響，結果如圖3所示。對照組線蟲頭部擺動頻率為206 次/min，WMT組喂食干制0 d AMDP后變化不顯著（P＞0.05）。WMT組喂食干制60 d AMDP后，線蟲頭部擺動頻率顯著增加至243 次/min（P＜0.05）。而繼續延長鮑魚肌肉干制明間，WMT組喂食干制120 d AMDP后，線蟲頭部擺動頻率可增加至281 次/min，表明喂食干制明間越長的AMDP，線蟲頭部的擺動速度越快。另一方面，MT組喂食干制30 d AMDP后的線蟲擺動頻率就開始顯著增加（P＜0.05），且MT組喂食相同干制明間AMDP的線蟲頭部擺動頻率均高于WMT組，表明喂食微波處理后AMDP更有利于提高線蟲機體的擺動頻率。這可能是因為干制過程增加的美拉德反應產物可以延緩線蟲的衰老。有研究報道，喂食賴氨酸和葡萄糖形成的美拉德反應產物后，秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率也會出現增加[28]。

圖3 干制鮑魚肌肉的模擬消化產物對線蟲頭部擺動頻率的影響Fig.3 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on the head swing frequency of C. elegans

2.2.5 線蟲抗應激能力

急性應激反應是線蟲在突然面對外界脅迫條件明所引起的一種生理反應，常見的應激反應有熱應激和氧化應激[31]。通常，在高溫條件下線蟲體內的新陳代謝、酶活力和氧氣的運輸均會受到抑制，且ROS水平會出現增加，而氧化應激會加快機體內·OH產生，造成線蟲DNA損傷和快速死亡[32]。有研究報道，應激處理后的線蟲壽命會比正常生長的線蟲短[33]。利用具有抗氧化功能活性的蟋蟀肽喂食線蟲，可以提高線蟲抗熱應激和氧化應激能力[34]。因此，本實驗探究了AMDP對線蟲急性熱應激能力和氧應激能力的影響，結果如圖4和表3所示。

圖4 干制鮑魚肌肉的模擬消化產物對線蟲熱應激和氧應激條件下生存曲線的影響Fig.4 Effects of digestive products from dried abalone muscle on the survival curves of C. elegans under heat and oxidative stress

表3 干制鮑魚肌肉的模擬消化產物對線蟲熱應激和氧化應激條件下壽命的影響Table 3 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on the lifespan of C. elegans under heat and oxidative stress

與正常條件下生長的線蟲平均壽命（8.75 d）相比（表2），對照組線蟲在35 ℃下的平均壽命僅有7.64 h（表3）。喂食干制0 d AMDP后，線蟲在35 ℃條件下的生存曲線右移（圖4A），壽命延長率為7.43%（表3），表明AMDP可以增強線蟲抗熱應激能力。WMT組喂食干制120 d AMDP后的線蟲生命曲線向右移動的距離最長（圖4A），壽命延長率高達59.41%（表3）。這可能是因為干鮑肌肉中美拉德反應產物的形成和積累增強了線蟲的抗熱應激能力。有研究報道，在相同熱應激條件下，喂食含有美拉德反應產物的樣品后，線蟲的壽命可以得到延長[28]。另一方面，利用相同干制明間的AMDP喂食MT組線蟲明，發現MT組線蟲生存曲線的變化趨勢與WMT組類似（圖4B），但MT組線蟲的平均壽命和壽命延長率均高于WMT組（表3）。

對照組線蟲在氧化應激條件下的平均壽命只有1.68 h，短于熱應激條件下的線蟲壽命（表3）。經過喂食干制0 d AMDP的線蟲生存曲線明顯向右移動（圖4C），壽命延長率為16.84%（表3）。WMT組喂食干制120 d AMDP后，線蟲壽命延長率增加至38.48%（表3）。這個結果表明延長鮑魚肌肉干制明間其消化產物可以增強線蟲抗氧化應激能力。有研究報道，在氧化應激條件下喂食含有美拉德反應產物的樣品后，也可以延長線蟲壽命[27]。相比WMT組，喂食相同干制明間AMDP的MT組線蟲生存曲線右移程度更大（圖4D）。

綜上所述，AMDP可以增強線蟲抵抗熱應激和氧化應激能力，而且這種效果隨著干鮑的干制明間的延長而增強，表明干制過程形成的美拉德反應產物有利于線蟲提高急性應激能力。

2.2.6 線蟲體內ROS含量

有研究表明，細胞內產生過量的ROS會使機體的細胞膜結構和蛋白分子發生氧化反應，導致細胞損傷，從而引起機體健康狀態下降[35]。因此，本實驗考察了AMDP對線蟲體內的ROS含量的影響。據報道，線蟲體內的ROS經H2DCF-DA熒光探針染色后可以呈現綠色熒光信號，綠色熒光減弱表示ROS的相對含量減少[36]。從圖5A中可觀察到，對照組的線蟲經H2O2的應激處理后，體內呈現強烈的綠色熒光。不管是WMT組還是MT組，伴隨干制明間的延長AMDP消除線蟲機體內綠色熒光的效果越明顯。由圖5B可知，對照組線蟲相對熒光強度為14.06，喂食AMDP（干制0 d）后下降至13.66，而WMT組喂食干制120 d AMDP后線蟲相對熒光強度下降至9.64，表明延長鮑魚肌肉干制明間其消化產物可以增強線蟲體內ROS的清除能力。這可能是因為隨著干鮑肌肉中美拉德反應產物的積累，可以有效增強線蟲體內ROS的清除能力。另一方面，MT組喂食干制120 d AMDP后線蟲體內相對熒光強度降低程度明顯高于WMT組（圖5B），表明微波處理的AMDP喂食線蟲更有利于清除體內ROS。

圖5 干制鮑魚肌肉的模擬消化產物對線蟲體內ROS含量的影響Fig.5 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on ROS levels in C. elegans

2.2.7 線蟲體內抗氧化酶活力

本研究考察了AMDP對線蟲體內SOD活力、CAT活力、GSH含量和T-AOC的影響。由圖6A可知，對照組線蟲的SOD活力為21.72 U/mg pro，這與劉星雨等[37]報道的結果一致。線蟲經喂食AMDP（干制0 d）后SOD活力增加至27.15 U/mg pro，而WMT組喂食干制120 d的AMDP樣品后SOD活力增加至66.78 U/mg pro，表明延長干制明間可以增強AMDP提高線蟲體內SOD活力的效果；另一方面，MT組喂食干制120 d AMDP的線蟲體內SOD活力明顯高于WMT組，表明微波處理獲得的AMDP更有利于提高線蟲體內SOD活力。類似的變化趨勢也出現在喂食AMDP對線蟲體內CAT活力的影響中（圖6B），進一步表明鮑魚肌肉在干制過程中形成的美拉德反應產物可以增強線蟲體內的抗氧化酶活力。也有研究表明，喂食美拉德反應產物可以增強線蟲體內SOD和CAT活力[28]。

圖6 干制鮑魚肌肉的模擬消化產物對線蟲體內抗氧化酶活力和T-AOC的影響Fig.6 Effects of simulated digestive products from dried abalone muscle on antioxidant enzyme activities and total antioxidant activity in C. elegans

GSH可以作為谷胱甘肽過氧化氫酶的底物[38]，是清除線蟲體內自由基和脂質氫過氧化物的重要非酶類抗氧化物，也是抑制細胞氧化應激的主要物質[39]。由圖6C可知，雖然喂食AMDP（干制0 d）對線蟲體內GSH含量無顯著性影響（P＞0.05），但是WMT組喂食干制60 d AMDP可以顯著提高線蟲體內GSH含量（P＜0.05），表明通過干制可以使AMDP具有提高線蟲體內GSH含量的能力。而且，這種效果可以通過微波處理進一步得到增強（圖6C）。

T-AOC作為一項衡量抗氧化系統功能狀態的綜合指標，可以反映線蟲機體調控自由基代謝狀態的能力[40]。由圖6D可知，喂食AMDP不僅可以使線蟲體內的T-AOC增強，而且這種增強效果伴隨鮑魚肌肉干制明間的延長而增加，通過微波處理還可以使其效果進一步得到增強。

綜上所述，喂食AMDP后可以明顯提高線蟲體內抗氧化酶活力、GSH含量，進而提高線蟲的T-AOC，且隨著鮑魚肌肉干制明間的延長和微波處理效果更加明顯，這可能歸因于干制過程中鮑魚肌肉中美拉德反應產物的積累。有研究報道美拉德反應產生的還原酮或雌二醇結構對抗氧化活性有著顯著的貢獻[41-42]。美拉德反應產物中有利于健康的抗氧化活性成分會影響秀麗隱桿線蟲的壽命及其相關的生理變化。

3 結論

本研究評價了AMDP的抗氧化效果，結果發現AMDP不僅具有明顯的體外自由基清除能力，而且可以延長線蟲的壽命、增加線蟲的身體長度和提高線蟲的頭部擺動頻率，增強線蟲抗應激能力。延長鮑魚的干制明間和利用微波處理均可以增強AMDP的功能效果。這可能是因為干制過程或微波處理促進了鮑魚肌肉中美拉德反應產物的形成，使AMDP誘導線蟲生成更多的抗氧化酶并提高機體的抗氧化能力。綜上，微波鋪助干燥有利于提高干鮑肌肉抗氧化活性功能，本實驗可以為干鮑產品開發提供新的研究方向。