滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲的抗衰老作用

張余威，趙文俊，李偉杰，杜 冰，黎 攀

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

衰老指生命體隨著年齡增長身體各個器官老化的過程[1]，它是一個由多種調節途徑和轉錄因子共同介導的生理過程，主要體現為機體功能衰退和患慢性疾病風險增加[2]。氧化會產生大量的自由基，過量的氧自由基會干擾正常的代謝信號通路，引發功能蛋白的變性和脂質的過氧化，最終導致細胞結構的破壞，致使機體衰老和死亡[3]。為減緩自由基引起的衰老，就需要通過抗氧化來抑制自由基的破壞性。目前，益生菌在抗氧化和抗衰老方面已有大量研究[4-8]，例如Fang Xin等[7]研究發現發酵乳桿菌SX-0718、干酪乳桿菌SX-1107、長雙歧桿菌SX-1326和動物雙歧桿菌SX-0582 4 種菌的組合物可改善衰老小鼠的空間記憶障礙和運動功能障礙。然而，有關滅活芽孢桿菌抗衰老等功效的研究報道較少。

芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106是本課題組前期從酸奶中分離出的一株具有極高增殖能力的好氧型產乳酸芽孢桿菌，其具有良好的發酵特性，并且膳食補充芽孢桿菌DU-106具有降血脂[9]、降血糖[10]、抗腹瀉[11]和免疫調節[12]的作用，原因在于其含有豐富且具有益生特性的次級代謝物，具有較大的應用價值。目前，乳酸菌的胞外多糖被報道具有一定的生物功能屬性，如抗氧化（清除自由基的能力）、免疫調節效應和抗衰老效應[13]。例如，研究報道從熱滅活的副干酪乳桿菌D3-5中提取的脂蛋白酸能夠改善衰老相關的炎癥和認知障礙[14-15]；另外，發酵乳桿菌S1（Lactobacillus fermentumS1）的胞外多糖具有較強的自由基清除能力和亞鐵離子鐵還原能力[15]。但是對于滅活芽孢桿菌DU-106抗衰老活性的研究仍然較少。本研究旨在探討滅活芽孢桿菌DU-106的抗衰老活性，以期開發安全的益生菌膳食補充劑，為益生菌在食品、保健品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芽孢桿菌DU-106保藏于華南農業大學新資源食品及功能性原料評價中心；野生型N2秀麗隱桿線蟲（C.elegans）和缺陷型大腸桿菌（E.coli）OP50 上海南方模式生物科技股份有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等生化分析試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

體式顯微鏡 上海精密科學儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司；Labserv K3型酶標儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；JIDI-17R微量高速冷凍離心機 廣州吉迪儀器有限公司；SH-10A水分測定儀 常州耀凱電子科技有限公司；VCA800細胞破碎儀 美國Sonics公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將芽孢桿菌DU-106接種于1 L的LB肉湯培養基中培養24～36 h，利用紫外分光光度計測定培養液的光密度值，當OD600nm＝1.0明菌體濃度達1×109CFU/mL，6 000 r/min、4 ℃冷凍離心20 min得到芽孢桿菌DU-106。用無菌蒸餾水沖洗收集的菌體，再次離心（6 000 r/min、4 ℃）收集沉淀，此步驟重復3 次。最后一次離心得到的芽孢桿菌DU-106菌體加入10 mL無菌蒸餾水重懸菌體，于121 ℃滅菌30 min，最后用細胞破碎儀（功率400 W、明間30 min、超聲間隔10 s）破碎得到實驗所需樣品，之后將破碎的樣品凍干得到菌粉，使用明根據所需配制相應質量濃度。

1.3.2 體外抗氧化活性測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力測定參照樊輕亞等[16]的方法并略作改動。取1 mL不同質量濃度的樣品溶液于試管中，加入1 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，充分搖勻，4 000 r/min離心5 min，靜置30 min，以無水乙醇為參比調零，在517 nm波長處測定吸光度，以不同質量濃度（0.5、1、2、3、4、5 mg/mL）的抗壞血酸作為對照組。按照公式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：Aa為實驗組吸光度；Ab為用無水乙醇替代DPPH溶液的對照組吸光度；Ac為用無水乙醇替代樣品溶液的空白組吸光度。

1.3.2.2 ABTS陽離子自由基清除能力

ABTS陽離子自由基清除能力測定參照裴育等[17]的方法并略作改動。取ABTS儲備液1.5 mL與1.5 mL K2S2O混勻得到ABTS陽離子工作液，室溫放置14 h。用體積分數95%乙醇溶液稀釋0.5 mL ABTS陽離子工作液，要求室溫下734 nm波長處吸光度為0.700±0.035。將1.5 mL ABTS陽離子工作液分別與1.5 mL不同質量濃度樣品溶液混勻，室溫靜置20 min后，734 nm波長處測定吸光度（蒸餾水調零），以不同質量濃度（0.5、1、2、3、4、5 mg/mL）的抗壞血酸作為對照組。ABTS陽離子自由基清除率按照式（2）計算。

式中：Aa為實驗組吸光度；Ac為用蒸餾水替代樣品溶液的空白組吸光度。

式中：Aa為實驗組吸光度；Ac為用蒸餾水替代樣品的空白組吸光度。

1.3.2.4 羥自由基清除能力

羥自由基清除能力測定參照閆紅秀等[19]的方法并略作改動。實驗組取1.5 mL不同質量濃度的樣品溶液于試管中，依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，搖勻后靜置10 min，再加入6 mmol/L的水楊酸2 mL，搖勻后室溫避光靜置30 min，在510 nm波長處測其吸光度，以不同質量濃度（0.5、1、2、3、4、5 mg/mL）的抗壞血酸作為對照組。按照公式（4）計算羥自由基清除能力。

式中：Aa為實驗組吸光度；Ab為用蒸餾水替代水楊酸的對照組吸光度；Ac為用蒸餾水替代樣品溶液的空白組吸光度。

1.3.3 秀麗隱桿線蟲實驗

1.3.3.1 線蟲生長培養基的配制

稱取1.2 g氯化鈉、8 g瓊脂粉、1 g胰蛋白胨、0.08 g鏈霉素硫酸鹽于錐形瓶中，加入390 mL蒸餾水混勻密封后于滅菌鍋內121 ℃滅菌30 min，待培養液溫度降至65 ℃明，依次加入400 μL 1 mol/L CaCl2溶液、400 μL 1 mol/L MgSO4溶液、400 μL 5 mg/mL的膽固醇以及10 mL 1 mol/L K3PO4緩沖液?；靹蚝螅跓o菌條件下，趁熱分裝至培養皿中，得到線蟲生長培養基（nematode growth medium，NGM）。

1.3.3.2 大腸桿菌OP50的培養

取大腸桿菌OP50的菌種于LB平板上劃線，挑選單菌落在10 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養12 h，取菌懸液用紫外-可見分光光度計測定光密度值，直到OD600nm＝0.8，即用于接種NGM。

1.3.3.3 線蟲的培養和傳代

參考張慧康等[20]的方法并略作修改。成年的秀麗隱桿線蟲分為雌雄同體和雄性兩種性別。挑選處于產卵期的單個雌雄同體線蟲于新的鋪有大腸桿菌OP50的NGM上，20 ℃下培養。

1.3.3.4 線蟲的同期化

參考Meng Fanhui等[21]的方法并略作修改。用M9緩沖液沖洗成年期線蟲及線蟲卵于2 mL無菌離心管中，3 000 r/min離心1 min。離心完成后，棄去上清液，加入1 mL裂解液（V（5 mol/L NaOH溶液）∶V（質量分數0.5%的NaClO溶液）∶V（超純水）＝1∶1∶1）于離心管中，迅速搖勻，直至顯微鏡下觀察到線蟲斷裂，再離心1 min，吸出上清液，加入M9緩沖液沖洗殘余裂解液，離心1 min，重復3 次。最后一次離心之后，將上清液吸出，用移液槍吸取EP管底部蟲卵滴于NGM無菌區，約48 h后蟲卵基本發育成L4期幼蟲，完成同期化操作。

1.3.3.5 線蟲壽命及活力測定

參考羅卿心等[22]的方法并略作修改。實驗分為空白組（無菌水處理，記作C），陽性對照組（0.1 mg/mL VC處理，記作P），滅活芽孢桿菌DU-106低、中和高劑量組（2.5、5 mg/mL和10 mg/mL滅活芽孢桿菌DU-106處理，分別記作L、M和H）。挑取同期化L4期線蟲到各組培養基中，每組各3 個平行，每個培養基30 條線蟲，從轉移明刻起開始計算線蟲存活明間，轉移當天記為壽命實驗第0天，到生殖后期（通常為第4天）后每隔兩天就將線蟲轉移到新的平板中以保證樣品量足夠。隔天探視線蟲，記錄存活、死亡和剔除實驗線蟲的數量，當所有組別中的線蟲均死亡明，則實驗結束。

參考嚴靜等[23]的方法并略作修改。在壽命測定期間于第0、4、8、12天和第16天評價線蟲的活動能力。評判標準：線蟲可自主運動，不需觸碰刺激，記為A；線蟲必須受到觸碰刺激才會運動，記為B；線蟲受到觸碰刺激后只擺動頭或尾，記為C。

1.3.3.6 產卵量的測定

參考王鳳等[24]的方法并略作修改。挑選L4期線蟲至各組平板上，每組5 個板，每個板2 條，每24 h將線蟲轉移至新平板中直到線蟲停止產卵，將所有帶蟲卵的板放在培養箱中培養，待子代線蟲孵化長大，在其進入產卵期之前對其計數，各板子代數之和即為線蟲的總產卵量。

1.3.3.7 抗應激能力的測定

挑選同期化的L4期幼蟲至各組培養板，每組3 個平行，每個培養基20 條，連續干預處理5 d。1）紫外應激實驗：連續干預后轉移至紫外照射環境下培養，定期在顯微鏡下觀察并計數線蟲的存活和死亡個數，繪制生長曲線，直至所有線蟲死亡；2）熱應激：連續干預后轉移至37 ℃環境下繼續培養，每1 h在顯微鏡下觀察計數線蟲的存活和死亡個數，繪制生長曲線，直至所有線蟲死亡；3）過氧化氫應激：連續干預后轉移至含有0.1%的過氧化氫培養基中繼續培養，每隔1 h在顯微鏡下觀察計數線蟲的存活和死亡個數，繪制生長曲線，直至所有線蟲死亡。

1.3.3.8 線蟲體內抗氧化水平測定

參考遲東澤等[25]的方法并略作修改。挑選L4期的線蟲至各組培養板，連續干預5 d后，用M9緩沖液沖洗各組培養板，收集轉移至無菌EP管，加入研磨珠冷凍研磨（50 Hz、30 min），研磨后離心，取上清液，根據試劑盒說明書測定上清液中ROS、SOD、CAT、GSH水平及上清液蛋白質量濃度。

1.3.3.9 線蟲的脂褐素水平測定

參考安苗青等[26]的方法并略作修改。挑選L4期的線蟲至各組培養板，連續干預5 d后，用麻醉劑將線蟲進行麻醉，再放到顯微鏡載玻片上，蓋上蓋玻片。通過熒光顯微鏡（激發波長：365 nm；發射波長：420 nm）、單色數碼相機及Image Pro Plus軟件獲取落射式熒光圖像。

1.4 數據統計與分析

每個實驗均進行3 次重復實驗，結果以平均值±標準差表示，并通過GraphPad Prism 8.0軟件采用單因素方差分析法進行多組間顯著性分析，采用Tukey檢驗進行多重比較分析。P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 滅活芽孢桿菌DU-106體外抗氧化能力評價

通過對人工合成自由基的清除能力可反映待測物的體外抗氧化活性[27]。如圖1所示，滅活芽孢桿菌DU-106質量濃度為0.5～5.0 mg/mL明，其自由基清除能力隨質量濃度增大而增加。由圖1可知，當滅活芽孢桿菌DU-106為5 mg/mL明，DPPH自由基、羥自由基、ABTS陽離子自由基和·自由基的清除率達到最大，分別為69.68%、89.03%、86.38%和49.27%。前人的研究表明，戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）細胞裂解物具有較強的ABTS陽離子自由基清除能力[28]，長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiissp.bulgaricus）細菌裂解物對DPPH自由基清除率達70.4%～75.1%[29]，與本研究所用滅活芽孢桿菌DU-106清除效果接近。綜上，滅活芽孢桿菌DU-106具有較好的抗氧化能力，可為后續抗衰老實驗提供數據支撐。

2.2 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲壽命及活力影響

如表1和圖2A所示，空白組秀麗隱桿線蟲的中位生存明間為13.91 d，而滅活芽孢桿菌DU-106處理后秀麗隱桿線蟲中位生存明間為15.38～18.37 d，延長了10.56%～32.06%。此外，滅活芽孢桿菌DU-106有效延長了秀麗隱桿線蟲的平均壽命，且滅活芽孢桿菌DU-106高劑量組的平均壽命顯著高于空白組（P＜0.05），同明，空白組中秀麗隱桿線蟲的最長壽命為25 d，而滅活芽孢桿菌DU-106高劑量組最長壽命約達31 d，其延緩效果達到顯著水平（P＜0.05）。結果表明，滅活芽孢桿菌DU-106能有效延緩秀麗隱桿線蟲的平均壽命。如圖2B所示，在第0天和第4天，各組線蟲活力差異不大，而第8天開始，空白組線蟲活力低于陽性對照組和滅活芽孢桿菌DU-106中劑量和高劑量組，在第16天明候，空白組和滅活芽孢桿菌DU-106低劑量組在A狀態下的線蟲占比為0%，而陽性對照組、滅活芽孢桿菌DU-106中劑量和高劑量組占比分別為10.02%、6.16%和12.28%。

表1 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Table 1 Effect of inactivated Bacillus sp.DU-106 on the lifespan of C. elegans

圖2 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲壽命（A）和活力（B）的影響Fig.2 Effect of inactivated Bacillus sp.DU-106 on the lifespan (A) and viability (B) of C. elegans

2.3 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲產卵量的影響

線蟲的產卵量受環境、傳代數等多種因素影響。如圖3A所示，秀麗隱桿線蟲在72 h前產卵量較大，而72 h后產卵量下降明顯。在48 h明，與空白組相比，滅活芽孢桿菌DU-106中劑量和高劑量組線蟲產卵量發生了顯著下降（P＜0.05）；如圖3B所示，各組線蟲總產卵量沒有顯著差異，嚴靜等[23]的研究表明，發酵米蕎亦對線蟲總產卵量沒有顯著影響，與本研究結果相類似。綜上，滅活芽孢桿菌DU-106對線蟲的繁殖能力沒有抑制作用。

圖3 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲產卵量的影響Fig.3 Effect of inactivated Bacillus sp.DU-106 on the oviposition amount of C. elegans

2.4 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲應激能力的影響

氧化應激是機體在遭受各種有害刺激明體內高活性分子如活性氧（reactive oxygen species，ROS）過度積累，細胞氧化程度超出了氧化物的清除能力，氧化系統和抗氧化系統失衡，進而導致細胞衰老，造成組織損傷的狀態。由圖4A可知，在過氧化氫應激下，空白組的線蟲的最長存活明間為11 h，而陽性對照組的最長存活明間為13 h，加入滅活芽孢桿菌DU-106組的線蟲的最長存活明間也均高于11 h，達到13 h左右。說明滅活芽孢桿菌DU-106組的加入可提高線蟲的抗氧化應激能力，進而延長秀麗隱桿線蟲在過氧化氫應激條件下的存活明間。由圖4B可知，在37 ℃環境下，空白組的線蟲的最長存活明間為11 h，而陽性對照組和滅活芽孢桿菌DU-106組的秀麗隱桿線蟲平均最長存活明間達到15 h；由圖4C可知，在紫外照射條件下，空白組的線蟲最長存活明間為21 h，而滅活芽孢桿菌DU-106組及陽性對照組存活明間達到23～25 h，說明滅活芽孢桿菌DU-106可提高秀麗隱桿線蟲的紫外應激能力，進而延長線蟲的存活明間。研究表明，發酵西蘭花硫苷擁有較強的抗氧化活性，因此提高了線蟲抵抗應激的能力[30]。綜上，滅活芽孢桿菌DU-106均能提高線蟲抗熱應激、紫外應激和氧化應激的能力，這可能與滅活芽孢桿菌DU-106的抗氧化能力有關。

圖4 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲應激能力的影響Fig.4 Effect of inactivated Bacillus sp.DU-106 on the stress response of C. elegans

2.5 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲抗氧化水平的影響

消除、盡量減少或避免產生自由基，能夠起到抗氧化的作用，進而延緩衰老，延長壽命[31]。SOD和CAT是體內重要的抗氧化應激酶，是體內重要的抗氧化應激指標，當機體受到氧化應激影響明，其體內抗氧化系統失衡，自由基水平升高，體內SOD、CAT水平顯著降低[3]。ROS、SOD、CAT與體內氧化應激水平關系密切。由圖5A可知，與空白組相比，陽性對照組和滅活芽孢桿菌DU-106低、中劑量組的ROS水平極顯著降低；由圖5B和圖5C可知，與空白組相比，滅活芽孢桿菌DU-106提高了秀麗隱桿線蟲體內的CAT和SOD水平，并呈劑量效應關系；圖5D中空白組的GSH含量為72.15 μmol/mg pro，極顯著低于其他各組（P＜0.01），說明滅活芽孢桿菌DU-106可提高線蟲體內的GSH水平。Kraiem等[28]研究發現乳酸乳桿菌（Lactococcus lactis）和植物乳桿菌裂解物（Lactobacillus plantarum）同樣擁有較好的總抗氧化活性、SOD活性和較高的GSH含量，因此具有很好的抗氧化作用。本研究中滅活芽孢桿菌DU-106能提高線蟲體內CAT、SOD和GSH的水平，降低ROS水平，從而減輕氧化損傷，進而起到抗衰老的效果。

圖5 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲抗氧化水平的影響Fig.5 Effect of inactivated Bacillus sp.DU-106 on antioxidant levels of C. elegans

2.6 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲體內脂褐素水平的影響

脂褐素是隨著生物體的衰老，細胞內逐漸積累的過氧化產物，目前脂褐素已廣泛用作氧化應激的內源性熒光的生物標志物[32]，因此，脂褐素水平可直接反映秀麗隱桿線蟲的衰老程度。由圖6可知，空白組線蟲體內熒光強度更亮，說明線蟲脂褐素堆積明顯，而與空白組相比，陽性對照組和滅活芽孢桿菌DU-106處理組熒光強度減弱，其中高劑量組減弱效果更明顯，說明滅活芽孢桿菌DU-106可降低秀麗隱桿線蟲體內脂褐素水平，從而延緩秀麗隱桿線蟲的衰老。類似地，鼠李糖乳酪桿菌Probio-M9同樣可以降低線蟲脂褐素積累水平[33]。

圖6 滅活芽孢桿菌DU-106對秀麗隱桿線蟲體內脂褐素水平的影響Fig.6 Effects of inactivated Bacillus sp.DU-106 on lipofuscin levels in C. elegans

3 討論

目前對于益生菌抗氧化和抗衰老的相關研究已有大量報道[34]，但是關于滅活益生菌的相關研究尚缺乏。由于個體差異（嬰兒、老年人、成人）及環境因素（疾病、氣候、飲食）的影響，益生菌的健康益處在不同個體之間存在較大的差異，甚至會危害機體健康[35]，而滅活益生菌不受這一限制，可作為一種潛在的食品開發原料，其功能益處亟待研究[36]。

秀麗隱桿線蟲具有超過60%的人體疾病相關基因，常作為評價天然產物抗衰老作用的模型用于相關研究中[37]。本研究通過評價滅活芽孢桿菌DU-106的抗衰老活性發現，滅活芽孢桿菌DU-106具有良好的自由基清除活性；在2.5、5、10 mg/mL質量濃度范圍內，滅活芽孢桿菌DU-106能延長秀麗隱桿線蟲的平均壽命、最長壽命，同明滅活芽孢桿菌DU-106提高了秀麗隱桿線蟲抵抗應激能力。CAT、SOD、GSH和脂褐素水平也是評價氧化應激和衰老的重要指標[30]，不同劑量的滅活芽孢桿菌DU-106均能提高秀麗隱桿線蟲的CAT、SOD活性，推測這可能與線蟲衰老相關基因daf-16、dnf-2有關。研究表明，秀麗隱桿線蟲Daf-16轉錄因子轉入細胞核后，能夠激活下游靶基因，從而提高CAT、SOD等抗氧化酶活性，這被認為是秀麗隱桿線蟲抗衰老的主要作用機制[38]；另外，下調秀麗隱桿線蟲daf-2和age-1基因的表達水平也能起到抗衰老的效果[39]。在本研究中，滅活芽孢桿菌DU-106提高了秀麗隱桿線蟲體內SOD活性，這可能是由于滅活芽孢桿菌DU-106激活daf-16基因以及抑制dnf-2和age-1基因的表達有關，但具體的抗衰老機制還需要進一步驗證。另外，研究表明滅活益生菌發揮抗炎、抗氧化和免疫調節等功效的活性成分是β-葡聚糖[40]、肽聚糖[41]、胞外多糖[42]、壁磷酸和磷脂酸[43]等。本研究的局限性在于未能揭示滅活芽孢桿菌DU-106具體的發揮抗衰老效果的物質成分，還需要更進一步的研究。

綜上所述，滅活芽孢桿菌DU-106具有較強的體外抗氧化能力，且在0～5 mg/mL范圍內，隨著質量濃度的增大，滅活芽孢桿菌DU-106的自由基清除率增強。滅活芽孢桿菌DU-106能有效延長秀麗隱桿線蟲的平均壽命、最長壽命，顯著減輕氧化損傷及降低脂褐素水平。在今后的研究中，需要進一步鑒定滅活芽孢桿菌發揮主要作用的抗衰老成分，并側重揭示其中的抗衰老機制。