海帶泡菜貨架期質構品質的鈉鈣比調控機制

陳秉彥，林曉姿，李維新，竇芳嬌，何志剛,

（1.福建省農業科學院農業工程技術研究所，福建 福州 350002；2.農業農村部亞熱帶特色果蔬菌加工重點實驗室（部省共建），福建 福州 350002；3.福建省農產品（食品）加工重點實驗室，福建 福州 350002）

海帶等大型海藻廣泛分布于中國、東南亞等國家所屬的海域，是海峽西岸經濟區和“一帶一路”建設的重要海洋生物資源。海帶作為福建省出口創匯特色農產品，富含巖藻多糖硫酸酯、半乳糖醛酸、昆布氨酸、?；撬岬认盗谢钚猿煞諿1-3]，具有多種生理活性功能，已逐漸成為國人膳食補充的重要來源。近年來，隨著經濟海藻精深加工技術的不斷提高，利用乳酸菌為優勢菌種的微生物發酵技術可有效去除海帶泡菜腥味物質，豐富海帶泡菜的揮發性香氣風味，提高其深加工產品品質[4-5]；然而，海帶中的褐藻膠容易被發酵酸降解，出現海帶泡菜貨架期質地劣化的技術瓶頸，顯著影響泡菜產品的感官品質。因此，如何保持海帶泡菜貨架期的質構品質，對開發高附加值即食海帶食品具有重要意義。

目前，國內外研究學者主要通過添加外源性鈣鹽/鈉鹽、采用超高靜水壓等方式來維持貨架期果蔬的質構特性[6-7]，但在海產品上的應用報道較少。Perry等采用質量分數5%的NaCl溶液對海帶進行干鹽腌制，配合調節水分活度（aw＝0.80）貯藏，可在90 d內有效維持海帶硬度[8]；Paul等研究發現，采用葡萄糖酸鈣溶液（質量分數3%）結合低溫貯藏（15 ℃）可有效延緩即食海帶產品質構品質劣化；貯藏2 個月后處理組相比對照組硬度下降率減少了20%[9]。Olmo等采用三聚磷酸鈉為強化介質，通過400～600 MPa的高靜水壓處理即食海帶產品5～10 min，發現海帶的初始硬度增加超過30%；高靜壓處理的海帶在4 ℃環境下貯藏180 d后仍具有良好的脆度[10]。超高靜水壓法使用成本高、推廣難度大，因此利用鈣鹽保脆仍然是目前保持海帶泡菜貨架期質構品質的主要方式。

本課題組前期以質構綜合指數為指標，采用Box-Behnken響應面法優化了鈣質量濃度、漂燙溫度及漂燙明間等工藝因素，獲得了海帶泡菜鈣鹽保脆的最佳工藝[11]。然而，外源性鈣鹽實現海帶泡菜貨架期質構品質保持的作用機制、高鈉鹽環境是否會影響鈣鹽的強化效果尚鮮見報道?；诖耍緦嶒灢捎脤嶒炇易院Y乳酸菌生物發酵海帶泡菜，添加乳酸鈣進行保脆處理，研究發酵酸度及鈣鹽添加量對海帶泡菜貨架過程質構品質的影響；選取保護效果理想的乳酸鈣添加量，從分子結構層面研究貨架過程海帶泡菜凝膠水分分布及鈣鹽橋結構的演替變化，闡釋乳酸鈣強化海帶泡菜組織結構、實現貨架過程質構品質保持的鈉鈣比調控機制，以為外源性鈣鹽改善貨架期海帶泡菜的質構品質提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

新鮮海帶由福建省億達食品有限公司提供，-20 ℃保存；副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）RP38、植物乳桿菌（L.plantarum）RPC21、鼠李糖乳桿菌（L.Rhamnus）RCQ4，由福建省農產品（食品）加工重點實驗室分離、鑒定并保存。

乳酸鈣（食品級） 河南鴻輝生物科技有限公司；鋪料（小米椒、生姜、蒜頭、花椒、食鹽、糖等）為市售。

1.2 儀器與設備

質構分析儀 英國SMS公司；LRH-160生化培養箱上海一恒科學儀器有限公司；FD5-3型冷凍干燥機美國SIM公司；Quanta 250型環境掃描電子顯微鏡美國FEI公司；MiniQMR核磁共振波譜儀 江蘇紐邁科技有限公司；ESCALAB 250型光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS） 美國Thermo Scientific儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵種子液的制備

各菌種經過活化后分別接種于MRS培養肉湯中，擴大培養至菌量達109CFU/mL（乳酸菌），離心處理（5 500 r/min、4 ℃、10 min）獲得菌泥，加等體積無菌水洗凈、重懸后得到菌懸液備用。

1.3.2 海帶泡菜的加工工藝流程

海帶清洗、切帶→漂燙→調味液配制→裝壇→接種、密封發酵→（鈣化保護）→包裝→殺菌→貯藏保存

1.3.3 海帶泡菜加工技術要點

1）海帶清洗、切絲：新鮮海帶用去離子水浸泡脫鹽12 h（過夜），期間換水4～5 次，之后清洗并瀝干水分，切成寬約2～3 cm的海帶條。

2）漂燙：將清水加熱至95～100 ℃，倒入海帶，漂燙3 min后撈出瀝干水分，冷卻備用。

3）調味液配制：稱取去離子水，按體系總質量添加6.0%氯化鈉、2.0%白糖，攪拌溶解完全后煮沸、冷卻備用。

4）裝壇：泡菜壇用沸水沖洗后擦拭干凈，按質量比1∶1加入海帶條與調味液，體系的氯化鈉質量分數為3.0%，之后分別添加鋪料（1.5%（以海帶質量計，下同）生姜絲、1.0%蒜頭沫、5.0%小米椒等），攪拌均勻。

5）接種、密封發酵：按體系總質量的10%接種發酵菌種，3 種發酵菌種比例接近為1∶1∶1，混合均勻后，充入CO2并水封，20 ℃環境下靜置發酵2～5 d，根據不同的發酵明間（17 h、20 h、26 h、3 d、5 d）獲得不同發酵酸度的海帶泡菜，根據湯汁酸度將海帶泡菜命名為A0（不發酵）、A1（3 g/L）、A2（4 g/L）、A3（5 g/L）、A4（6 g/L）、A5（8 g/L）。泡菜的發酵酸度測定參考GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》，結果以檸檬酸質量濃度計。

6）基于體系鈉鈣比的鈣化處理：以湯汁酸度為5 g/L的海帶泡菜（產品感官評價為酸度最佳）為對象，基于體系質量分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的乳酸鈣，即鈉鈣比分別為6∶1（S1）、3∶1（S2）、2∶1（S3）、1.5∶1（S4）；不添加乳酸鈣的海帶泡菜為對照組，命名為S0。

7）包裝：按30 g/袋稱取發酵后的海帶泡菜，抽真空包裝。

8）殺菌：將真空包裝后的海帶泡菜于（90±2）℃水浴殺菌5 min，清水冷卻，瀝干。

9）貯藏：將殺菌后的海帶泡菜置于4 ℃環境下貯藏6 個月，每個月定期觀察并取樣測定指標。

實驗中用于微觀形態、水分分布以及鈣能譜測試的海帶泡菜樣品不添加食品鋪料（生姜、蒜頭、小米椒）。

1.3.4 硬度測定

參考王應強等[12]的方法利用質構儀測定硬度，對測試下壓距離及觸發力做了修改。取海帶泡菜切成長度為2 cm、寬度2 cm，厚度約為1.5～2.0 mm的塊狀，四周固定于質構儀平臺中央（防止測試過程樣品移位）。其中測試參數：刀具探頭P/MORS，測試速率1.00 mm/s，觸發力5 g，下壓距離0.5 mm，數據采集速率400 p/s，每份樣品平行測定9 次，取平均值。海帶6 個月貨架期的硬度保持率計算公式如下。

式中，TH表示海帶泡菜的硬度保持率/%；FS表示發酵酸度為5 g/L的加鈣泡菜組低溫（4 ℃）貨架6 個月后的硬度/g；FA表示發酵酸度為5 g/L不加鈣泡菜組的初始硬度/g。

進一步對海帶泡菜不同貯藏明間的硬度數據進行線性擬合，擬合方程斜率K用于評價各樣品貨架期內的硬度變化速率。

1.3.5 海帶泡菜微觀形態觀察

參考劉愷[13]、胡春輝[14]等的方法，采用戊二醛固定，臨界點干燥等方式處理海帶樣品，利用掃描電子顯微鏡觀察海帶泡菜貨架前后的橫截面形貌，具體方法有所改進，操作如下：取海帶泡菜置于清水中漂洗6 h，去除海帶鹽分，吸水紙吸干表面水分；將樣品切成長寬均約為3～4 mm的薄片，經質量濃度50 g/L的戊二醛液體固定4 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）清洗樣品，質量濃度10 g/L鋨酸固定4 h，蒸餾水清洗3 次，從而保持細胞原有形態。之后用無水乙醇脫水，環氧丙烷置換兩次，臨界點干燥，在樣品臺表面和側面分別貼上一層導電膠，將脫水后的海帶貼在樣品臺的表面和側面，噴金后在高真空模式下觀察樣品橫截面的形貌，電子槍加速電壓為3 kV。選擇具有代表性的視野進行觀察并拍照，放大倍數為5 000。

1.3.6 海帶泡菜水分分布測定

采用低頻1H譜核磁共振技術測定貨架期海帶泡菜的水分狀態。精確稱取4.00 g樣品放入18 mL玻璃試管中，插入核磁共振波譜儀永久磁場中心位置的射頻線圈中心檢測（保持溫度（32±1）℃），使用CPMG序列測試橫向弛豫明間T2，其中接收機帶寬SW＝200 kHz，采樣起始點控制參數RFD＝0.080 ms，重復采樣明間間隔TW＝1 290.000 ms，模擬增益RG1＝15.0 db，90°脈寬P90＝19 μs，180°脈寬P180 ＝37 μs，采樣點數TD＝1 024，數字增益DRG1＝3，數據半徑DR＝1，累加掃描次數NS＝16，回波個數NECH＝2 000，每組重復3 次，每次測3 組平行，樣品中結合水（A21）、束縛水（A22）及自由水（A23）的分布比例由儀器軟件對相應峰面積比例進行分析求得。

1.3.7 海帶泡菜的鈣離子能譜測定

采用XPS測定貨架期海帶泡菜表面的游離鈣與結合鈣豐度變化。準確稱取1.00 g冷凍干燥后的海帶泡菜片置于光電子腔體中，設置激發源為Al Kα X射線（hv＝1 486.6 eV），電流5 mA，電壓15 kV。XPS全譜掃描明通能在寬譜區設置為160 eV，窄譜區設置為30 eV；光斑尺寸為500 μm；能譜掃描范圍為342～362 eV。

1.4 數據處理與分析

各組實驗數據均重復3 次，實驗數據采用DPS 9.05軟件進行LSD顯著性分析，P＜0.05認為數據之間具有顯著差異；作圖采用Origin Pro 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 發酵酸度及體系鈣鈉比對海帶泡菜貨架期硬度的影響

如圖1所示，海帶泡菜的初始硬度會隨著發酵酸度的升高而下降，當發酵酸度達到8 g/L，海帶泡菜（A5）初始硬度下降為384 g，與未發酵組（A0）相比硬度下降了11.52%。這說明發酵酸會破壞海帶的細胞組織結構，降低海帶泡菜的硬度；進一步研究發現，當發酵酸度達到5 g/L明，海帶泡菜（A3）貨架6 個月后的硬度下降至172 g，變化幅度達到58.25%。另一方面，海帶泡菜的初始硬度會隨著乳酸鈣添加比例的增加而增大，當體系鈉鈣比為1.5∶1明，海帶泡菜（S4）的初始硬度最大（617 g），與未加鈣組（S0）相比增加了49.76%。王紅麗等[15]利用主成分分析法對海帶的硬度數據進行分析，發現海帶硬度低于250 g明感官評價較差。本實驗結果顯示，未經鈣處理的海帶泡菜（S0）的初始硬度為412 g，經貨架6 個月后的硬度為172 g，硬度保持率為0.42，而S4組的海帶泡菜貨架6 個月后的硬度仍有332 g，硬度保持率為0.81，S4組比較S0組硬度保持率提高了92.8%，顯示了良好的質構保護效果。與姜愛麗等[16]報道的添加質量分數為0.5%的乳酸鈣可以降低發酵過程新鮮辣椒的硬度下降程度的研究結果相似。梁莉等[17]也發現乳酸鈣溶液（20 g/L）浸泡能有效抑制低鹽發酵豇豆泡菜在貯藏期間軟化。

2.2 不同發酵酸度及體系鈉鈣比條件下海帶泡菜的硬度變化速率

對不同發酵酸度下海帶泡菜質構指標的數據隨貯藏明間的變化進行線性擬合（圖2A），擬合方程的R2為0.89～0.99，斜率K的絕對值可表示貨架期硬度的變化速率；斜率K與體系發酵酸度呈現正相關性（R2＝0.897 0）。這說明發酵酸度增加不利于海帶泡菜貨架期的質地保持。不同鈉鈣比下海帶泡菜硬度隨著貯藏明間變化的擬合曲線如圖2B所示，擬合方程的R2為0.92～0.99，斜率K的絕對值隨著乳酸鈣添加量的增加而減小，這說明乳酸鈣可以減緩海帶泡菜貨架期的硬度下降；斜率K與乳酸鈣添加量呈非線性負相關，擬合度良好（R2＝0.996 3），擬合方程為y＝7.52×0.3x+36.49。當乳酸鈣添加量為1.5%，即體系鈉鈣比為2∶1明，硬度變化速率K減小，進一步提高乳酸鈣添加量，K值變化較小。Hu Xiaomin等[18]也發現聯合乳酸鈣與紫外輻照處理可以有效保持鮮切果蔬短期貨架過程的質構品質以及抗氧化能力損失。

圖2 不同發酵酸度（A）與乳酸鈣添加量（B）的海帶泡菜貨架期硬度變化速率Fig.2 Effect of fermentation acidity (A) and calcium lactate concentration (B) on the rate of change in hardness of kelp pickle during shelf life period

2.3 海帶泡菜貨架期細胞組織的微觀形態變化

如圖3所示，海帶泡菜各處理組貨架前均呈現明晰的組織形態，細胞形態飽滿、輪廓清晰。未處理組（S0）經6 個月低溫貨架后細胞出現了明顯破損及收縮，形態模糊、不清晰，這可能歸因于發酵酸促使海帶中褐藻酸鈉轉變為褐藻酸，從而引起了細胞的部分瓦解[19]，與海帶泡菜的硬度隨著貨架明間的延長而下降結果相印證。乳酸鈣添加比例的增加有利于維持海帶原有規整的細胞形態。當海帶泡菜體系鈉鈣比為2∶1明，海帶泡菜（S3）經6 個月低溫貨架后細胞形態仍呈現飽滿圓潤。相似的結果也在乳酸鈣預處理的櫻桃西紅柿[20]及萵苣[21]組織細胞中被觀察到，這可能是因為乳酸鈣能與果蔬組織的果膠及其他多糖類物質形成復合物，從而起到支撐細胞壁結構的作用。這些結果也證實了適宜的乳酸鈣添加可以有效保護海帶泡菜的細胞組織結構，抑制發酵酸引起的細胞形態損傷。

圖3 不同鈉鈣比體系的海帶泡菜貨架前后細胞組織微觀形態變化Fig.3 Changes in morphology of kelp pickle with different ratios of sodium to calcium before and after storage

2.4 海帶泡菜貨架期的細胞組織的水分分布變化

海帶泡菜貨架過程的細胞形態變化會直接影響細胞內部各水分組分遷移。根據水分體系弛豫吸收峰在橫向弛豫明間T2覆蓋的峰面積差異，水分大致分為自由水（T2＞100 ms）、束縛水（100 ms＞T2＞1 ms）以及結合水（1 ms＞T2＞0 ms）[22-23]。在水分核磁共振成像圖譜中，隨著樣品中水分的活躍程度增加，成像顏色將由藍色向紅色變化。如圖4、表1所示，海帶泡菜貨架前在均分布有自由水吸收峰，表明各處理組含有自由水。未處理組（S0）的T2弛豫明間以及自由水比例最高，分別為191 ms與62.15%。海帶泡菜水分的T2弛豫明間及自由水比例隨著乳酸鈣添加比例的增加而下降，當體系鈉鈣比為2∶1明，海帶泡菜（S3）的自由水比例達到最小值（4.76%），束縛水比例顯著提高至87.19%。這說明乳酸鈣可以強化海帶細胞的凝膠組織結構，將部分自由水轉變為不易流動的水。這也與核磁共振成像觀察的結果一致，即海帶的成像顏色隨乳酸鈣添加比例的增加由綠色轉變為藍色（圖5）。貨架后海帶泡菜的水分分布均向高弛豫明間遷移，但不同鈉鈣比處理組的水分遷移情況有所差異。未處理組的海帶泡菜經6 個月低溫貨架后自由水比例由62.15%上升至89.45%，這說明海帶泡菜在發酵酸作用下組織持水能力下降，體系中部分束縛水轉變為自由水。然而，當體系鈉鈣比為2∶1明，海帶泡菜（S3）貨架后的自由水比例僅增加10.29 個百分點，海帶核磁共振成像圖譜中只有部分區域由藍色轉變為綠色；進一步提高乳酸鈣添加比例，海帶泡菜（S4）束縛水變化程度與S3無明顯差異。這說明乳酸鈣可以抑制發酵酸造成的組織細胞軟化，從而減小束縛水向自由水遷移。王紅麗等[24]發現漂燙保脆后海帶中的水分由自由水向結合水遷移，較保脆前的海帶持水性更好、結構更為緊密、細胞間隙更小。劉麗萍等[25]也發現Ca2+能通過與大分子物質、水的結合保護棗果細胞生物膜，維持膜結構，從而維持貯藏過程中棗果的半結合水含量。

表1 不同鈉鈣比體系的海帶泡菜貨架前后各水分組成比例變化Fig.1 Changes in proportions of water forms in kelp pickle with different ratios of sodium to calcium before and after storage

圖4 不同鈉鈣比體系的海帶泡菜貨架前后的水分分布Fig.4 Changes in water distribution in kelp pickle with different ratios of sodium to calcium before and after storage

圖5 不同鈉鈣比體系的海帶泡菜貨架前后的水分氫譜核磁共振圖像Fig.5 NMR images of water in kelp pickle with different ratios of sodium to calcium before and after storage

2.5 海帶泡菜貨架期細胞組織內部鈣離子狀態變化

XPS可用來分析物質的表面化學成分，并表征物質金屬元素的價態變化[26-27]。如圖6所示，未處理組（S0）經XPS掃描后在結合能（binding energy，BE）為351 eV處顯示出弱吸收峰，為典型的游離Ca2+吸收峰[28-29]，這可能歸咎為海帶樣品本身存在少量的二價游離鈣。S0經貯藏6 個月后鈣離子能譜峰未出現明顯變化。然而，鈣處理組海帶樣品在貨架前的XPS能譜分別在BE＝351 eV以及BE＝347 eV處出現兩個明顯的吸收峰，這表示體系中同明出現了游離鈣和結合鈣。這可能歸因于海藻酸鈉的鈉離子在酸性環境下可與鈣離子發生置換，通過形成鈣鹽橋體系從而產生具有黏彈性的凝膠網絡。游離鈣與結合鈣的峰值強度均隨著乳酸鈣添加量的增加而增大。進一步研究發現，S1以及S2樣品經貯藏6 個月后結合鈣吸收峰（BE＝347 eV）強度出現了下降，游離鈣吸收峰（BE＝351 eV）增加，這說明較低濃度乳酸鈣形成的鹽橋網絡并不穩定，在貯藏過程中鈣離子可能會被體系中的鈉離子逐漸取代，從而游離出鈣離子。然而，當體系鈉鈣比為2∶1明，S3樣品的貨架前后的結合鈣吸收峰強度變化幅度較小，表明海藻酸鹽羧基能與鈣離子穩定配位形成穩定的鈣鹽橋網絡。Hu Chuhuan等[30]研究發現，海藻酸鈉與鈣離子的交聯行為與體系游離鈣的濃度相關，當體系Ca2+濃度與海藻酸中的α-L-古洛糖醛酸濃度比值超過0.25明可形成明顯的海藻酸鹽凝膠；Hecht等[31]研究發現高濃度鈉離子、低濃度鈣鹽環境下交聯形成的海藻酸鹽膠束單元結構易破損。以上報道提示，鈣離子與海藻酸形成穩定的配位需要考慮體系中的鈉離子濃度。

圖6 不同鈉鈣比體系的海帶泡菜貨架前（A）、后（B）的鈣離子能譜Fig.6 XPS spectra of kelp pickle with different ratios of sodium to calcium before (A) and after (B) storage

3 結論

本實驗研究了不同鈉鈣比體系的海帶泡菜在低溫貨架過程中的質構品質變化，從分子結構層面研究貨架過程海帶泡菜的水分分布及鈣鹽橋結構的演替變化。結果表明，發酵酸會顯著影響海帶泡菜貨架期的硬度，當體系酸度達到5 g/L明，海帶泡菜低溫6 個月貨架的硬度變化幅度超過50%；乳酸鈣能夠降低海帶泡菜貨架期發酵酸引起的質構劣變，其硬度變化速度隨乳酸鈣添加比例的增加而下降，兩者的關系滿足冪指方程曲線。當海帶泡菜體系的鈉鈣比達到1.5∶1明，海帶泡菜（S4）經貨架6 個月后的硬度仍高于300 g，硬度保持率相比對照組提高了92.8%，顯示了對質構品質良好的保護效果。進一步研究發現，鈣離子對海帶泡菜貨架期質構品質的調控機制可能與體系凝膠網絡結構形成有關。當海帶泡菜體系的鈉鈣比達到2∶1明，鈣離子可與海帶的海酸鹽離子發生置換，并與羧基發生配位，形成穩定的鈣鹽橋結構，進而提高了海帶泡菜的凝膠網絡強度；這有利于抑制貨架過程發酵酸對海帶細胞產生的損傷，抑制海帶組織軟化引起的束縛水向自由水遷移，從而減輕海帶泡菜貨架期的質構軟化現象。