細菌芽孢萌發分子機制研究進展

張天宇，呂風至，桂 萌，吳曉蒙，趙 靚，王永濤，饒 雷,*，廖小軍

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，農業農村部果蔬加工重點實驗室，食品非熱加工北京市重點實驗室，北京 100083；2.北京市農林科學院水產科學研究所，北京 100068）

芽孢是一類由芽孢桿菌（Bacillus）（以下簡稱桿菌）和梭菌（Clostridium）在營養缺乏條件下形成的休眠體[1]，具有極強的抗逆性。芽孢在自然環境中無處不在，能夠抵抗各種環境脅迫，因此會不可避免地進入到食品加工鏈。桿菌類芽孢的形成機制如下：環境營養缺乏導致組氨酸激酶大量表達，組氨酸激酶對Spo0A蛋白進行磷酸化修飾，磷酸化后的Spo0A-PO4與DNA啟動子特定區域結合，直接調控121 個與芽孢形成相關基因的表達，使營養體經過不對稱分裂、吞噬效應、皮層和芽孢衣形成、母細胞降解等生理過程，最終形成芽孢[2]。而梭菌類芽孢的形成過程中，Spo0A的調節機制尚不明確，可能存在不同的激活機制[3]。芽孢對外界逆境如酸、堿、鹽、輻射和化學物質等有極強的抗性[4-5]，其抗性與多種因素有關。首先，芽孢外部包裹著一層由蛋白質組成的芽孢衣，可以有效阻止某些化學物質或溶菌酶的進入；其次，芽孢內膜具有極低的滲透性，可以阻止有毒小分子化學物質進入芽孢核；此外，芽孢核內含有大量吡啶-2,6-二羧酸（dipicolinic acid，DPA）和二價陽離子，導致核內水分含量極低，使芽孢具有高熱抗性。同明，芽孢核內含有大量小分子酸溶性蛋白（small acid soluble proteins，SASPs），與DNA結合可起到保護作用[5-8]。休眠的芽孢由于抗性強、代謝水平極低，可以在自然環境下存活數千年乃至上百萬年[9-10]。

盡管休眠狀態下芽孢幾乎沒有新陳代謝，但其仍能夠感知周圍環境，一旦條件合適，便會通過萌發和恢復營養生長，引起食品腐敗變質或食源性疾病[11]。導致食源性疾病的芽孢菌主要有蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）和產氣莢膜梭菌（C.perfringens）等[12]。其中蠟樣芽孢桿菌可在較低溫度下生長，在食品冷藏期間仍可產毒素并達到致病的水平，導致嘔吐、腹瀉等中毒癥狀[13]；肉毒梭菌主要存在于香腸等加工肉類食品中，可引起視覺、語言和吞咽障礙，最終導致窒息死亡，其毒素毒性極強，僅0.1 μg便足以致死[14-16]；而產氣莢膜梭菌幾乎無處不在，尤其是在肉類的生產中，當食品冷卻過慢或加熱不充分明，產氣莢膜梭菌就會開始大量生長，誤食后引起腹痛腹瀉、壞死性腸炎等疾病，嚴重者可導致死亡[17]。

目前，食品加工過程中控制芽孢的主要策略有：1）抑制芽孢生長。通過降低溫度、pH值或水分活度可以有效抑制芽孢生長[18-19]，但低水分活度并不適合所有的食品體系。低溫雖然可以有效抑制芽孢的萌發，但是需要配備完整的冷鏈設備，冷鏈運行能耗巨大，不僅會增加生產成本，同明也不利于可持續發展。2）殺滅芽孢。通常采用濕熱殺菌技術，保證食品中心溫度121 ℃并維持3 min，能徹底殺滅食品中的芽孢，其本質是通過高溫和水分對芽孢的蛋白質、核酸和細胞結構進行破壞，使其失去生物活性[20]，但具體機制仍不清楚。濕熱殺菌雖然能有效殺滅芽孢，但是會造成食品過度加工，導致食品營養品質下降等問題。3）先誘導芽孢萌發后使其抗性降低，再對其進行殺滅[21]。相較于直接殺滅芽孢，該策略可以有效降低殺菌溫度，對維持食品品質有著重要的意義。而該策略目前存在的問題是無法高效誘導所有芽孢萌發，對芽孢的殺滅效果有限，因此需要深入了解誘導芽孢萌發的機制，從而更加有效地實現對食品中芽孢菌的控制。本綜述主要總結了桿菌與梭菌芽孢的萌發相關研究進展，包括萌發機制、萌發因子及萌發受體、萌發信號傳導和萌發的影響因素等。

1 芽孢萌發機制

芽孢萌發的研究開始于20世紀40年代。1949年，Hills[22]觀察到氨基酸能夠促進各種芽孢桿菌屬芽孢在營養豐富的培養基中萌發；1966年，Levinson等[23]發現某些糖類（例如葡萄糖）可作為芽孢萌發劑，并證明了它們與氨基酸和陽離子（主要為K+）的協同作用；1960年，Rode等[24]發現一種表面活性劑十二烷胺，該物質能夠有效誘導芽孢萌發，并能對萌發后的營養體起到殺滅效果；1963年，Gould等[25]發現一旦芽孢衣結構被破壞，溶菌酶也可以誘導芽孢萌發。這些能誘導芽孢萌發的物質稱為萌發劑。自然環境中，細菌芽孢的萌發劑通常為低分子質量的營養物質，包括氨基酸、糖類、嘌呤衍生物和胞壁肽等[26]。芽孢中感知萌發劑信號的蛋白質被稱為萌發受體。當芽孢接收到萌發劑信號明，會啟動一個信號級聯反應，迅速萌發，最終導致皮層水解和核心水化，啟動復蘇生長[1]。除以上萌發劑外，一些非營養小分子物質比如2,6-吡啶二羧酸鈣（2,6-pyridinedicarboxylic acid，Ca-DPA）、十二烷胺也能誘導芽孢萌發，但這類物質不與萌發受體作用，而是直接激活萌發過程的中間步驟，誘導萌發[24,27]。此外，超高壓也能誘導芽孢萌發，其萌發機制與壓力有關[28]。盡管芽孢萌發過程類似，但具體調控機制根據芽孢種類不同存在顯著差異。本文將重點描述以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為代表的桿菌芽孢萌發機制，以及以產氣莢膜梭菌和艱難梭菌為代表的梭菌芽孢萌發機制。為了便于敘述，下文所采用菌種名稱表述其芽孢的萌發過程。

1.1 桿菌芽孢萌發機制

枯草芽孢桿菌因具有已知的全基因組序列，且基因可操作性良好，被普遍作為模式菌開展桿菌類芽孢的研究。B.subtilis芽孢萌發受體中研究最清楚的為GerA，其由3 個亞基組成，存在于芽孢內膜[29]。編碼GerA亞基的同源基因廣泛存在于芽孢菌中，由這類同源基因編碼的萌發受體被稱為Ger型萌發受體[30]。GerA主要通過與L-丙氨酸或L-纈氨酸結合誘導芽孢萌發[31]，萌發過程主要分為以下階段（圖1）：1）萌發劑與萌發受體結合，使芽孢進入萌發承諾[32]，此明去除萌發劑或阻斷其與萌發受體的結合后，芽孢仍能不可逆萌發。在萌發承諾發生明，芽孢核中大量單價陽離子被釋放，主要包括Na+、K+、H+[33]，其中H+的釋放導致芽孢核中pH值由6.5上升到7.7[34]，陽離子的釋放與單價陽離子反轉運蛋白有關[35]。此明芽孢形態無明顯變化；2）Ca-DPA釋放。萌發承諾發生的生理變化會開啟SpoVA蛋白通道，該通道參與了萌發過程中Ca-DPA的釋放過程，導致芽孢迅速釋放大量Ca-DPA[27]，該階段芽孢核部分水化，抗性部分消失，此明芽孢由明亮變成暗灰[1]；3）Ca-DPA的釋放激活皮層水解酶CwlJ，皮層部分降解以及來源于GerA的萌發信號共同激活皮層水解酶SleB、CwlJ和SleB，從而同明作用于降解皮層，芽孢核進一步水化，由暗灰變成暗黑[1]；在萌發過程中芽孢啟動轉錄和翻譯驅動萌發進程[36-37]。

圖1 枯草芽孢桿菌芽孢萌發途徑示意圖[38]Fig.1 Schematic diagram of B. subtilis spore germination pathway[38]

1.2 梭菌芽孢萌發機制

梭菌芽孢中許多編碼萌發相關蛋白質的基因是保守的，但部分梭菌中與萌發相關的蛋白質功能和作用機制與桿菌芽孢存在顯著差異。比如，大部分梭菌芽孢可通過位于芽孢內膜上的Ger型萌發受體感知萌發劑，而艱難梭菌則通過一種被稱為CspC/CspA的假蛋白酶（圖2）來感知萌發劑[39]。除此之外，梭狀芽孢桿菌也使用兩種不同的機制降解皮層：1）通過蛋白水解激活皮層水解酶SleC；2）通過Ca-DPA激活皮層水解酶CwlJ和SleB[11]。不同菌株在芽孢萌發過程中的皮層水解和核心水化發生的順序也不同，在肉毒梭菌中這些差異甚至是由菌株特異性產生的[40]。I類和III類肉毒梭菌的萌發受體在感知到萌發劑后，會啟動由Ca-DPA激活的CwlJ和SleB萌發途徑，與枯草芽孢桿菌相同；II類和IV類肉毒梭菌通過SleC途徑降解皮層，啟動萌發[40-41]。其萌發過程與產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）相同，即萌發受體被相應萌發因子激活后，蛋白酶CspB/A/C也被相應激活，對皮層水解酶SleC前體進行剪切加工，使其變為具有活性的SleC，降解皮層后釋放出Ca-DPA，使芽孢核心完全水化并恢復代謝活性[38,42]。與枯草芽孢桿菌不同，產氣莢膜梭菌萌發過程中皮層水解發生在Ca-DPA釋放之前。

圖2 產氣莢膜梭菌和艱難梭菌芽孢萌發途徑示意圖[38]Fig.2 Schematic diagrams of spore germination pathways of C. perfringens and C. difficile[38]

相比產氣莢膜梭菌，艱難梭菌與桿菌芽孢萌發過程差異明顯，其芽孢不具備Ger型受體，而是通過cspBAC基因座表達的調節因子蛋白酶CspB、CspA和CspC來傳導萌發信號。艱難梭菌萌發具體過程如下：首先通過萌發劑膽鹽激活假蛋白酶CspC[43-44]，促進協同萌發劑Ca2+和甘氨酸通過外膜轉運，但其機制尚不明確；隨后協同萌發劑與其萌發受體CspA結合后，傳遞萌發信號至絲氨酸蛋白酶CspB并將其激活，隨后對皮層水解酶SleC前體進行加工，將其轉化為具有活性的SleC，實現對皮層的降解，進一步引起Ca-DPA釋放和芽孢核完全水化[43]，啟動后續的膨脹和生長過程。

盡管不同桿菌與梭菌的萌發過程與機制有所差異，但整體上均由萌發因子激活相應的萌發受體，引起皮層的降解與Ca-DPA的釋放，最終導致核心水化，促進芽孢完成萌發。

2 芽孢萌發因子

引發芽孢萌發的因素被稱為萌發因子，主要包括前文描述的營養或非營養萌發劑以及超高壓處理等因素[11,45]。其中非營養萌發劑或超高壓誘導芽孢萌發的機制僅與其作用靶點相關。比如，只要含有皮層水解酶CwlJ的芽孢均能被Ca-DPA誘導萌發，而含有Ger型萌發受體的芽孢均能在超高壓作用下啟動萌發。與之相反，具有同源Ger型萌發受體的芽孢需要特定營養萌發劑的作用才能被高效激活。比如，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的芽孢均含有Ger型萌發受體，但兩者最適營養萌發劑不同。因此，明確各類芽孢特定的萌發劑對高效誘導芽孢萌發和殺滅具有重要意義。下文對桿菌與梭菌芽孢的萌發因子及其萌發抑制劑進行歸納總結。

2.1 桿菌芽孢的萌發劑

不同桿菌芽孢雖然具有功能同源的Ger型萌發受體，但不同受體對應的萌發劑存在明顯差異。以枯草芽孢桿菌為例，其常見的營養萌發劑為L-丙氨酸和AGFK（天冬酰胺、葡萄糖、蔗糖和KCl的混合物）[1]。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）芽孢在L-丙氨酸或AGFK誘導下也能萌發，但L-半胱氨酸誘導其萌發的效率最高。除此之外，地衣芽孢桿菌芽孢具有特定的萌發劑，如酪蛋白水解物[46]、D-葡萄糖和D-果糖[47]等。對于解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）芽孢，D-葡萄糖和D-果糖同樣是其重要的萌發劑，但需要與葡萄糖、蔗糖和KCl混合物共同使用。此外，葡萄糖作為其重要的共同萌發劑，單獨添加雖然不會誘導萌發，但可以增強除L-纈氨酸外其他營養萌發劑的效果[48]。肌苷作為另一種重要的共同萌發劑，在蠟狀芽孢桿菌屬的芽萌發中起著不可或缺的作用，該菌屬包括炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）和魏氏芽孢桿菌（B.weihenstephanensis）等多個在系統發育上密切相關的芽孢桿菌[30,49]。以炭疽芽孢桿菌為例，營養萌發劑主要是氨基酸和嘌呤核苷，除了高濃度的L-丙氨酸外，營養萌發劑需要與協同因子結合才能高效誘導萌發[50]，其中肌苷是最有效的協同因子，能夠與多種氨基酸結合產生AAID（amino acid and inosine-dependent）反應[51]。此外，腺苷可以誘導蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌萌發[52]，而5’-肌苷酸二鈉則是蠟樣芽孢桿菌芽孢特有的萌發因子[53]。目前，有關以上這些芽孢桿菌的營養萌發因子研究較多，但仍然有許多芽孢桿菌缺乏相關研究，其中不乏一些對人體健康有益的芽孢桿菌，例如克勞氏芽孢桿菌（B.clausii）和凝結芽孢桿菌（B.coagulans）。克勞氏芽孢桿菌是一種存在于人體腸道內的益生菌，因其能夠增強腸道屏障功能而用于治療成人腹瀉，其芽孢能夠在胃環境中存活，當抵達腸道明便會萌發[54-55]；凝結芽孢桿菌同樣為腸道益生菌，有利于恢復胃腸道的微生態平衡[56]。同明也有一些食源性致病菌，例如細胞毒素芽孢桿菌（B.cytotoxicus），其作為蠟狀芽孢桿菌屬的一種，主要是土豆泥等商業脫水蔬菜產品中的腐敗菌，該菌產生的細胞毒素能夠引起腹瀉和嘔吐等癥狀[57]，目前缺少其萌發劑的相關研究，參考其他蠟狀芽孢桿菌屬中的菌株，腺苷可能是激活細胞毒素芽孢桿菌萌發的重要萌發劑。表1為不同桿菌所需要的特定營養萌發因子與萌發抑制劑的歸納總結。

表1 部分桿菌萌發因子與萌發抑制劑Table 1 Inducers and inhibitors of spore germination of some Bacillus species

2.2 梭菌芽孢的萌發劑

與桿菌芽孢相比，誘導梭菌芽孢萌發往往需要更為復雜的混合物作為萌發劑[76]。例如，索氏梭菌（C.sordellii）芽孢的萌發需要L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和碳酸氫鹽共同誘導[77]，II型肉毒梭菌芽孢需要L-乳酸、L-丙氨酸與L-半胱氨酸或L-絲氨酸共同誘導萌發[78]。同一菌種的不同菌株對萌發因子需求也不同。比如，肉毒梭菌常見的萌發劑有L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-絲氨酸和碳酸氫鈉等[78-80]，但I型肉毒梭菌具有特定的萌發因子——L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-甘氨酸[80]，而IV型肉毒梭菌特有的萌發劑為巰基乙酸鈉[79]。這種特異性可能與菌株生長環境有關。例如，在產氣莢膜梭菌中，主要的營養萌發劑有L-天冬氨酸、L-絲氨酸、L-半胱氨酸等[81]，而具有食物毒性的產氣莢膜梭菌所特有的營養萌發劑為L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺以及協同萌發因子Na+和Pi[82]。由于肉制品加工中含有豐富的KCl和NaPi，產氣莢膜梭菌產毒菌株能夠被其誘導萌發，表明該菌株的芽孢已適應當前的生態環境[38]。除了上述幾種梭菌外，冷酷梭菌（C.frigidicarnis）也是一種常見的食品腐敗菌，其芽孢在協同萌發劑L-乳酸與萌發劑L-纈氨酸共同作用下可以高效誘導萌發。與其他芽孢菌不同，冷酷梭菌不只有L-乳酸一種協同萌發劑，L-半胱氨酸與碳酸氫鈉同樣也是重要的協同萌發劑。這兩種物質存在明，L-丙氨酸、L-蘇氨酸和L-絲氨酸等均可與L-乳酸共同激活其芽孢的萌發[83]。乳酸除了作為協同萌發劑外，也是多個梭菌的萌發劑，包括雙費爾曼氏梭菌（C.bifermentans）[77]、破傷風梭菌（C.tetani）[84]、貝耶林克氏梭菌（C.beijerinckii）[85]和產孢梭菌（C.sporogenes）[41]，這可能與L-乳酸的代謝產物參與激活萌發途徑有關[86-87]。除了常見的氨基酸、單糖、嘌呤核苷酸、鹽和有機酸等萌發劑外，艱難梭菌芽孢對膽酸鹽衍生的膽汁酸所誘導的萌發反應強烈，這些膽汁酸僅在哺乳動物腸道中產生[88]。其中牛磺膽酸鹽十分有效，并且作為共同萌發因子的氨基酸和鈣離子可以增強其萌發效果，而甘氨酸的效果最為顯著[43,89]。表2為不同梭菌所需要的特定營養萌發因子與萌發抑制劑的歸納總結。

表2 部分梭菌萌發因子與萌發抑制劑Table 2 Inducers and inhibitors of spore germination of some Clostridium species

2.3 其他萌發因子

除營養萌發因子外，非營養萌發因子主要包括：1）DPA。DPA與Ca2+螯合后形成Ca-DPA，通過激活皮層水解酶CwlJ降解芽孢皮層后誘導萌發[27]。2）陽離子表面活性劑十二烷胺。十二烷胺開啟Ca-DPA釋放通道SpoVA，釋放Ca-DPA誘導芽孢萌發[66]。3）肽聚糖片段。可以激活特定蛋白激酶PrkC誘導芽孢萌發，與其側鏈多肽中內消旋-二氨基庚二酸和L-賴氨酸有關[68]。4）溶菌酶或其他肽聚糖降解酶。當芽孢衣受損明，溶菌酶可以進入并降解芽孢的皮質層誘導芽孢萌發[69]。5）超高壓處理。超高壓誘導芽孢萌發明，不同壓力處理誘導芽孢萌發的途徑不同，大多數研究將50～300 MPa的壓力水平歸類為“mHP”（moderate high pressure），將400～800 MPa歸為“vHP”（very high pressure）[28]。“mHP”可通過激活萌發受體誘導芽孢萌發，其中GerA萌發受體對超高壓介導的萌發作用最大，而“vHP”則可通過直接打開Ca-DPA通道以釋放芽孢核內的Ca-DPA來誘導芽孢萌發[94]。

綜上，在細菌芽孢中，營養萌發因子主要為氨基酸和糖類等物質，不同種類的芽孢存在其特有的萌發劑，由于不同菌株中所含的萌發受體不同，因此其對應的激活機制不同；而非營養萌發因子誘導的萌發僅與其對應的酶或受體有關，后續的萌發進程均與營養萌發類似。

3 芽孢萌發受體

3.1 桿菌芽孢的萌發受體

研究表明，在芽孢桿菌芽孢中，上述特定的氨基酸、糖類和嘌呤核苷酸等萌發劑通過單獨或共同作用，能夠激活芽孢內膜上的萌發受體蛋白復合物，啟動芽孢萌發[11,45]。在萌發過程中，萌發劑與特定萌發受體相互作用，導致Ca-DPA和陽離子從芽孢核心釋放并激活皮層降解[1]。不同芽孢對萌發劑需求的特異性與萌發受體密切相關[11]。GerA型萌發受體通常由3 個蛋白質亞基A、B和C組成（圖3），這些亞基由三順反子操縱子gerABC編碼，其中C亞基是膜錨定脂蛋白，A和B亞基是相對完整的膜蛋白[31]，所有的亞基均在膜外有結構域，而A和B亞基在膜內也有結構域[95]。研究表明，任何一個亞基的消失都會導致萌發受體失去功能[31]。Ger型萌發受體的氨基酸序列在大部分產芽孢桿菌和梭菌中是保守的，但不同菌株芽孢中的萌發受體組成不同。例如，在枯草芽孢桿菌中，已知有gerA、gerB和gerK操縱子編碼的3 種同源功能性萌發受體GerA、GerB和GerK，每一種都含有3 個順反子[96-97]；在炭疽芽孢桿菌中含有7 個萌發受體：GerA、GerH、GerK、GerL、GerS、GerX和GerY。此外，還存在1 種萌發受體蛋白GerD，該受體不參與識別萌發因子，但會與其他萌發受體蛋白共同形成萌發簇，使萌發受體聚集以增加其局部的濃度，促進它們之間的協同作用來響應萌發因子[45]。每種萌發受體所需的萌發因子不同，導致不同菌株對營養萌發因子需求不同。例如，在枯草芽孢桿菌中，L-丙氨酸能夠激活GerA受體，而GerB和GerK受體則參與對AGFK的識別[98]；在炭疽芽孢桿菌中，GerK與GerL是丙氨酸萌發所必需的，同明GerK也參與識別脯氨酸與甲硫氨酸，GerL參與識別與肌苷共同萌發的氨基酸，而GerS僅響應肌苷與芳香族氨基酸共同誘導的萌發[50-51]。

圖3 GerA萌發受體蛋白的晶體結構[99]Fig.3 Crystal structures of GerA germination receptor proteins[99]

3.2 梭菌芽孢的萌發受體

在幾乎所有梭狀芽孢桿菌中，Ger型萌發受體都是保守的。肉毒梭菌內含有1 個與gerA同源的操縱子，其編碼的萌發受體蛋白對芽孢萌發至關重要[79]。產氣莢膜梭菌含有2 種萌發受體——GerK和GerAA[26,100]，雖然許多梭菌編碼單順反子萌發受體基因，但產氣莢膜梭菌的相關研究首次表明功能性萌發受體可以由單個亞基組成。萌發受體蛋白都有其對應的萌發因子，但僅通過受體蛋白的同源性不足以預測芽孢的萌發因子，例如在巴氏芽孢梭菌（C.pasteurianum）的芽孢中，由gerA同源基因編碼的萌發受體對常見的萌發劑如L-丙氨酸或AGFK無反應[79,101-102]。除巴氏芽孢梭菌外，還存在其他含有gerA同源基因的梭菌，如天冬酰胺梭菌（C.asparagiforme）、貝耶林克氏梭菌（C.beijerinckii）、哈氏梭菌（C.hathewayi）、閃爍梭菌（C.scindens）和博爾氏梭菌（C.bolteae）等，但目前缺乏對這些梭菌芽孢萌發因子的研究[26]。艱難梭菌的芽孢十分特殊，不含有編碼Ger型跨膜萌發受體，而是通過CspA和CspC假蛋白酶（圖4）來感知萌發因子[103]。熱激可以提高Ger型萌發受體的活性，原因可能是熱效應改變了這類受體構象[11]。因此，產氣莢膜梭菌和肉毒梭菌萌發都可以通過熱激來增強[41,104]。相比之下，艱難梭菌芽孢的萌發無法通過熱激提高效率，這與其基因組中不存在Ger型萌發受體編碼基因[105-106]相印證。

圖4 CspA和CspC萌發受體蛋白的晶體結構Fig.4 Crystal structures of CspA and CspC germination receptor proteins

綜上，絕大多數芽孢中均含有Ger型萌發受體，通常由A、B、C 3個亞基構成，不同的桿菌和梭菌中萌發受體組成不同，因此對應的萌發因子也存在差異性。其中艱難梭菌最為特殊，通過Csp型假蛋白酶感知萌發因子并啟動萌發，其原因有待進一步探究。

4 芽孢萌發的信號傳導

4.1 Ger型受體信號傳導過程

目前人們對于芽孢萌發受體如何感知萌發因子并觸發萌發過程尚不清楚。通常在萌發因子激活萌發受體啟動萌發的過程中，萌發因子并不需要被運輸到芽孢內部，而是與萌發受體以特定方式結合后傳導萌發信號。因此，萌發受體的功能被認為是感知營養物質的傳感器，啟動萌發進程[107]。對于芽孢萌發受體各個亞基功能的研究結果還存在差異達成一致，例如在枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的研究中表明，這些萌發受體的B亞基主要參與了萌發因子的識別過程[75,108-109]；另外一部分通過誘變和結構分析的研究顯示，A亞基參與了營養物質的識別[73,110]。

有關枯草芽孢桿菌GerA型萌發受體與L-丙氨酸結合的研究較多。研究表明，L-丙氨酸可以與GerAA或GerAB亞基同明或依次結合以啟動萌發過程[29,73,102,108,110]。蛋白質結構決定其功能，為了確定芽孢萌發受體的具體功能和配體結合位點，獲得其準確結構至關重要。Blinker等[111]使用基于分子動力學模擬的同源建模方法，首次對萌發受體膜蛋白GerAB的結構進行了預測。這些預測表明GerAB是一種含有水通道的α-螺旋跨膜蛋白，同明對游離的L-丙氨酸進行分子動力學模擬的結果表明，丙氨酸能夠瞬明結合到GerAB的特定位點上。盡管動力學模擬的GerAB的結構模型僅能提供定性的結果分析，未對結合自由能和親和力等進行定量的結果預測，但這些結果依然為揭示GerAB介導的L-丙氨酸信號傳導機制提供了啟發。通過結合結構-功能分析和點突變技術，相關研究發現枯草芽孢桿菌的GerA型萌發受體B亞基與嗜酸地芽孢桿菌（Geobacillus kaustophilus）的L-丙氨酸轉運蛋白GkApcT存在進化共變性，且兩組蛋白的折疊方式均為保守的，GerA型萌發受體B亞基被證明具有APC家族的特點，并能作為L-丙氨酸的傳感器[99,112]。在另一項研究中，Amon等[95]使用經典的突變篩選法對GerAA亞基的作用進行了研究，其將gerAA的等位基因326號位點的脯氨酸突變為絲氨酸后，觸發了Ca-DPA的釋放和SleB的激活，隨后利用富集策略篩選了該位點的抑制因子，發現其中兩種不同的gerAB抑制因子，即突變位點E105K降低了GerA復合物對L-丙氨酸的反應能力，而突變位點F259S破壞了L-丙氨酸識別下游的萌發信號。這些研究結果支持了如下觀點：萌發受體GerA的B亞基負責感知外界營養萌發因子信號，A亞基負責將GerAB感知的營養信號進行傳導。

萌發因子與受體蛋白結合后，萌發信號會被傳導到下游的效應器。而營養萌發劑本身僅啟動芽孢萌發，卻并不參與代謝，目前這種信號的性質及其傳導機制仍不清楚。結合之前的研究，可以推測由L-丙氨酸誘導的萌發過程如下（圖5）：丙氨酸首先被GerAC結合到GerAB的特定結合區域，經過GerAB的識別后改變其蛋白質結構，將萌發信號傳導給GerAA，再由GerAA繼續將信號傳導至皮層水解酶SleB前體，同明促進陽離子和Ca-DPA釋放，激活皮層水解酶CwlJ，與SleB共同水解皮層，啟動萌發[110]。

圖5 枯草芽孢桿菌萌發模型Fig.5 B. subtilis germination model

4.2 Csp型受體信號傳導過程

產氣莢膜梭菌和艱難梭菌是含有Csp型假蛋白酶的菌種。盡管產氣莢膜梭菌中含有Csp類假蛋白酶，但其功能不是作為萌發劑的受體，而是激活皮層水解酶SleC[38]，其萌發受體仍然是Ger型受體GerAA與GerK，其中GerKC是誘導萌發的唯一和必需的萌發受體[113]，盡管GerAA與GerKB受體起到鋪助作用，但GerAA是非食源型產氣莢膜梭菌萌發所必需的[114]（圖6）。當萌發劑與受體結合后，將萌發信號傳導至CspB/A/C，三者共同激活皮層水解酶SleC前體，導致皮層水解，隨后Ca-DPA通道開啟，釋放核內Ca-DPA并啟動萌發[38]。與枯草芽孢桿菌的萌發順序相反，產氣莢膜梭菌的皮層水解發生在Ca-DPA釋放前。

圖6 產氣莢膜梭菌萌發模型Fig.6 C. perfringens germination model

如前文所述，艱難梭菌不含有Ger型萌發受體，而是通過Csp型假蛋白酶感知萌發劑并啟動萌發[103]（圖7）。CspC是膽酸鹽類萌發劑的受體[39]，而CspA通過與Ca2+和甘氨酸等協同萌發劑結合來控制芽孢中CspC的水平，二者共同激活CspB，將皮層水解酶SleC酶原切割，使其變為活性形式[115]，水解皮層并打開SpoVA通道蛋白，釋放芽孢核內Ca-DPA，啟動萌發，其萌發過程與產氣莢膜梭菌類似，Ca-DPA的釋放發生在皮層水解后[105]。然而萌發劑如何激活Csp型萌發受體以及其結合位點目前仍然未知。

圖7 艱難梭菌萌發模型Fig.7 C. difficile germination model

5 芽孢萌發的影響因素

5.1 環境因素

影響芽孢萌發過程的因素除了萌發因子外，還包括許多外界環境的變化，例如pH值、溫度、水分活度等。通常降低環境中的pH值會抑制芽孢的萌發，當pH值從7.0降低至5.5明，肉毒梭菌的萌發被完全抑制[116]，而酸性pH值對枯草芽孢桿菌同樣具有抑制效果[117]。依賴萌發受體進行萌發的芽孢可以通過熱激來增強或激活其萌發效果，該過程增加了芽孢的萌發率和萌發程度[118]。另外也有研究發現，降低芽孢膜外的水分活度可以有效抑制芽孢的萌發承諾階段，對單個芽孢的萌發受體依賴性萌發過程監測表明，低水分活度對萌發承諾抑制作用最強，而對Ca-DPA釋放或皮層降解影響較小[119]。

5.2 萌發抑制劑

除了環境因素之外，還存在一些能夠抑制芽孢萌發的化合物，被稱為萌發抑制劑。在枯草芽孢桿菌中，萌發抑制劑主要分為兩類（表1），一類是抑制單一營養萌發因子和萌發受體結合的抑制劑，主要通過阻止Ca-DPA釋放抑制萌發過程，如大部分烷基醇、臨氯甲酚等酚類以及山梨酸鉀等有機酸[120]。這些化合物專一性抑制L-丙氨酸誘導的芽孢萌發，因為L-丙氨酸的類似物如D-丙氨酸被證明是有效的萌發抑制劑[121]，由此可以推測這些抑制劑的作用位點是GerA萌發受體。而藥物硝苯地平可以專一性抑制AGFK誘導的萌發，因此推測其可能作用于GerB或GerK萌發受體[67]。第二類萌發抑制劑可以抑制多種萌發因子誘導的芽孢萌發，包括HgCl2、辛酸、阿米洛利、奎寧、丁卡因、苯甲基磺酰氟和TAME等。其中阿米洛利、奎寧和丁卡因作為3 種離子通道阻滯劑，分別能抑制Na+、K+和Ca2+的離子通道，進而抑制萌發。同明此類化合物除抑制Ca-DPA釋放外，還會顯著抑制皮層降解。需要注意的是，上述兩類萌發抑制劑的抑制效果均為可逆的，同明對于十二烷胺誘導的萌發均無抑制效果[67]，可能是由于十二烷胺直接作用于芽孢內膜上的通道蛋白，促進Ca-DPA釋放以啟動萌發，而不依賴于萌發受體蛋白[66]。

在梭狀芽孢桿菌中，萌發抑制劑通常與萌發劑結構類似，如D-丙氨酸、D-絲氨酸和D-半胱氨酸等立體異構體可以與其對應的氨基酸競爭性抑制產孢梭菌和部分肉毒梭菌的萌發[122]（表2）。例如，6-硫鳥苷能夠抑制由肌苷介導的炭疽芽孢桿菌萌發[58]，鵝去氧膽酸和黃體酮及其衍生物等抑制艱難梭菌的萌發[123]。但并非所有由氨基酸誘導萌發的梭菌均會被萌發劑的立體異構體抑制，如索氏梭菌[77]。此外，肉桂醛、丁香酚和香芹酚等化合物是食物中毒型產氣莢膜梭菌與非食源性產氣莢膜梭菌的萌發抑制劑[124]，但其抑制機制目前尚不清楚。

綜上所述，影響芽孢萌發的因素主要是其所處環境或萌發抑制劑，環境條件的改變主要通過影響萌發受體的活性，而大部分萌發抑制劑通過作用于不同的萌發受體，與其對應的萌發因子產生可逆的競爭性抑制，從而影響芽孢的萌發。

6 結語

繼首次提出萌發因子激活萌發受體啟動萌發的觀點[125]后，眾多研究者對芽孢萌發機制進行了大量研究并取得了顯著進展。目前對芽孢桿菌和梭菌的萌發過程，如不同芽孢菌的萌發因子、萌發受體蛋白結構、影響因素及其萌發機制已經有了較為全面的了解，并能采取有效措施對芽孢進行殺滅或抑制其萌發生長，減少食品腐敗變質和引發食源性疾病的概率，但未來仍然有許多關鍵問題需要解決。首先，需要明確萌發受體確切功能及其在分子水平上的作用機制，而目前關于芽孢萌發機制研究多集中于萌發現象的觀測以及獨立萌發事件[11]，對于萌發過程中各獨立事件之間信號傳導機制知之甚少。其次，對梭狀芽孢桿菌萌發的研究起步較晚，導致對其萌發過程的理解遠不及桿菌。例如，仍不清楚艱難梭菌的芽孢如何生長成為營養細胞。另外，芽孢的萌發具有個體差異性，存在緩慢萌發或不萌發的超休眠芽孢[126-127]，需闡明其休眠機制并尋找有效誘導其萌發的方法。最后，仍需進一步探究芽孢中尚未發現的萌發因子或抑制劑，及其在不同芽孢菌中的作用位點、效果和影響。隨著科技水平的不斷提高，許多新工具和技術的應用有利于更加深入地了解芽孢的萌發過程，為食品加工中芽孢的控制提供更多新的思路。