抗凍蛋白的制備及其在食品工業(yè)的應(yīng)用研究進(jìn)展

王靜靜，廖愛(ài)美，劉瑩瑩，陳新陽(yáng)，薛迎春，潘龍，黃繼紅，3，4*，侯銀臣

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院小麥生物加工與營(yíng)養(yǎng)功能河南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001；2.中原食品實(shí)驗(yàn)室，河南 漯河 462000；3.河南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 作物逆境適應(yīng)與改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004；4.許昌學(xué)院 食品與藥學(xué)院，河南 許昌 461000）

由于食品在儲(chǔ)存過(guò)程中含水量高，利于微生物生長(zhǎng)和發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，容易導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)[1]，而冷凍保存技術(shù)是將食品長(zhǎng)期保存的最有效方法。受溫度波動(dòng)的影響，食品中的冰晶生長(zhǎng)或再結(jié)晶，會(huì)破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，使食品失去原有品質(zhì)[2]，并造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在食品冷凍儲(chǔ)存過(guò)程中，找到控制冰晶生長(zhǎng)和再結(jié)晶的方法對(duì)提高冷凍食品的品質(zhì)至關(guān)重要[3]。在冷凍食品中添加冷凍保護(hù)劑是緩解冷凍貯藏過(guò)程中發(fā)生品質(zhì)惡化的最有效方法之一[4]。抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）最初是在南極海洋魚(yú)類血清中發(fā)現(xiàn)的，是一種可以防止魚(yú)類在冰冷的海水中結(jié)冰的蛋白質(zhì)[5]。與其他蛋白質(zhì)不同，AFPs 對(duì)冰有獨(dú)特的作用，它可以通過(guò)吸附到冰層表面保留水合分子，保留后的水合分子與冰晶有不同的生長(zhǎng)方向和氫鍵結(jié)構(gòu)，AFPs 可以吸附到冰晶表面來(lái)抑制冰晶的形成和冰晶的生長(zhǎng)[6-7]。此外，它可以通過(guò)降低體液的凍結(jié)溫度來(lái)保障各種冷適應(yīng)生物的存活，也可以通過(guò)抑制凍融過(guò)程中產(chǎn)生冰晶從而保護(hù)細(xì)胞不受傷害[8]。因此，AFPs 可以作為一種新型、無(wú)毒害的低溫保護(hù)劑應(yīng)用于冷凍食品中。AFPs 可以從生物體中提取，也可以通過(guò)人工制備。然而，提取或制備得到的AFPs 粗液包含多種蛋白質(zhì)，因此，需要進(jìn)一步的分離純化從而獲得高濃度的AFPs溶液。本文總結(jié)了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外AFPs 的來(lái)源、特性、制備與純化的最新研究，重點(diǎn)論述了AFPs 在冷凍食品中的應(yīng)用進(jìn)展，并展望了AFPs 的制備與應(yīng)用前景，以期為抗凍蛋白的制備、純化和應(yīng)用提供參考。

1 AFPs 的來(lái)源

AFPs 主要存在于海洋深處、常年積雪和沙漠地區(qū)的細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲(chóng)、脊椎動(dòng)物體內(nèi)，是一種能夠抑制冰晶再結(jié)晶的結(jié)構(gòu)多樣化的大分子蛋白質(zhì)，它可以幫助許多生物體（如魚(yú)、昆蟲(chóng)、植物和細(xì)菌等），能夠在0 ℃以下的溫度中生存[9]。AFPs 有熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）、冰重結(jié)晶抑制（ice recrystalization inhibition，IRI）和修飾冰晶形態(tài)等特性，自然界中不同生物來(lái)源的AFPs 的特征有差異[10]。例如，在IRI方面，AFPs 可以通過(guò)降低體液中的冰點(diǎn)來(lái)阻止魚(yú)類和昆蟲(chóng)冰晶的形成；在修飾冰晶形態(tài)方面，植物和線蟲(chóng)的抗凍性是通過(guò)將磷酸腺苷結(jié)合在冰的表面并防止其變成更大的冰晶來(lái)實(shí)現(xiàn)的；不同微生物的AFPs 可以附著在冰面上，并抑制冰晶的形成。AFPs 可以抑制冰晶的生長(zhǎng)，這對(duì)于生活在冰冷海水中的極地魚(yú)類有重要意義[11]。Takeshita 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，冬牙鲆AFPs 溶液經(jīng)過(guò)預(yù)熱和超濾后提高了蛋白的純度，增強(qiáng)了對(duì)冰晶生長(zhǎng)的重結(jié)晶抑制作用。昆蟲(chóng)中AFPs 的抗凍活性顯著高于魚(yú)類；植物中的AFPs 具有顯著抑制冰晶形態(tài)的作用。有研究表明，將AFPs 轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)能夠減緩植物凍害[13]，但關(guān)于植物中AFPs 的研究起步較晚，文獻(xiàn)相對(duì)較少。表1 概括了不同生物來(lái)源的AFPs，以及它們的代表物種和同源蛋白質(zhì)。

表1 不同生物來(lái)源的AFPsTable 1 Different biological sources of antifreeze proteins

2 AFPs 的特性

AFPs 與冰晶結(jié)合，能夠通過(guò)非依數(shù)的形式降低溶液的冰點(diǎn)，并保持其熔點(diǎn)不發(fā)生變化；同時(shí)，表現(xiàn)出IRI 活性，可以阻止微小冰晶在冷凍、低溫保存過(guò)程中生長(zhǎng)為大晶體，并具有改變冰晶形態(tài)的能力[18]。

2.1 THA

AFPs 能夠非依數(shù)性地降低溶液的冰點(diǎn)而保持其熔點(diǎn)不變，這樣冰點(diǎn)與熔點(diǎn)間產(chǎn)生的差值就稱為THA，其根據(jù)AFPs 和晶體表面之間的相互作用而變化[19]。根據(jù)THA，AFPs 可分為中度活性抗凍蛋白和過(guò)度活性抗凍蛋白。在魚(yú)類和植物中發(fā)現(xiàn)了中度活性的AFPs，在高濃度蛋白質(zhì)下，其THA 值約為2 ℃，而在高濃度蛋白下，來(lái)自細(xì)菌和昆蟲(chóng)的THA 值高達(dá)5 ℃[20]。在含有AFPs 的溶液中，冰晶不可逆地結(jié)合到AFPs上，阻止冰晶生長(zhǎng)，直到溫度降低到非平衡冰點(diǎn)，從而形成溫度差，使冰晶破裂[21]，這種特殊的性質(zhì)在食品工業(yè)及低溫保存技術(shù)方面存在巨大的應(yīng)用潛力。

2.2 IRI

AFPs 可以防止水在冰晶和溶液之間的再分配，即IRI。根據(jù)這一特性，AFPs 在食品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，例如在制冷系統(tǒng)的冰漿和食品儲(chǔ)存中的應(yīng)用。植物的IRI 活性高于魚(yú)類和昆蟲(chóng)。對(duì)于一些耐寒生物體，當(dāng)空氣溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí)，它們的細(xì)胞外會(huì)形成許多冰晶，AFPs 可以減緩胞內(nèi)致命冰的形成[22]。冰的重結(jié)晶過(guò)程分為冰晶邊界遷移、大冰晶增大、小冰晶消失。AFPs 可以增加冰晶的數(shù)量，減小冰晶的尺寸。一般來(lái)說(shuō)，AFP 的IRI 率越大，形成的冰晶就越小[23]。AFPs 通過(guò)阻止冰晶在邊界處生長(zhǎng)和融化來(lái)抑制冰晶邊界遷移的過(guò)程。即使是在亞微摩爾的濃度中，IRI 也很顯著，這遠(yuǎn)低于THA 所需的濃度。冰晶在冷凍溶液中較小，降低了細(xì)胞的損傷，防止冷凍食品在儲(chǔ)存過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)的流失，因此對(duì)于冷凍食品和其他冷凍水合材料的保存有至關(guān)重要的作用[24]。Shi 等[25]采用3 種浸漬方法，研究了AFPs 對(duì)凍融循環(huán)下扇貝內(nèi)收肌持水能力和質(zhì)地特性的影響。結(jié)果表明，在超聲輔助浸漬中AFPs 通過(guò)氫鍵吸附在冰晶表面，可以顯著改變冰晶的形態(tài)，顯著提高扇貝收肌的持水能力和質(zhì)地特性，為研究超聲輔助浸漬及其在冷凍水產(chǎn)品中的作用機(jī)制提供一定的參考。

2.3 修飾冰晶形態(tài)的能力

AFPs 可以結(jié)合到特定冰晶的基面上，從而形成獨(dú)特的冰晶形態(tài)。例如，冬比目魚(yú)和黃顙魚(yú)中的I 型AFPs分別結(jié)合在冰錐和副棱柱基面上，來(lái)自南極的黃桿菌中超活性AFPs 結(jié)合在基面上，形成檸檬的形狀，而超活性AFPs 可以同時(shí)結(jié)合在冰晶的基面和棱柱上[26]。

3 AFPs 的制備

AFPs 可以從天然來(lái)源（植物、昆蟲(chóng)、動(dòng)物和魚(yú)類）中提取，也可以通過(guò)常見(jiàn)的基因重組技術(shù)制備。對(duì)化學(xué)法、分子生物學(xué)表達(dá)、基因工程表達(dá)的制備方法進(jìn)行總結(jié)。

3.1 化學(xué)法

化學(xué)法一般采用的是堿溶酸沉法，依據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH 值，使得目的蛋白質(zhì)沉淀。陳振家[27]采用堿溶酸沉的方法從大豆中制備分離蛋白，通過(guò)改性后制成凝膠，在凍藏條件下對(duì)蛋白的抗凍特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，凝膠特性下降，蛋白降解。丁香麗[28]則以Na2HPO4-NaH2PO4溶液為緩沖液，采用真空滲透法提取大麥籽粒中AFPs，經(jīng)過(guò)超濾、一系列柱層析純化，得到的大麥籽粒AFPs 相對(duì)分子質(zhì)量為13 370 Da，THA為1.04 ℃，與禾本科小麥族12 個(gè)屬中的蛋白具有較高同源性。

3.2 分子生物學(xué)表達(dá)

分子生物學(xué)表達(dá)技術(shù)是指以模式生物（細(xì)菌、真菌、動(dòng)物細(xì)胞或者植物細(xì)胞）為宿主，對(duì)外源基因進(jìn)行表達(dá)的一種方法。張莉等[29]通過(guò)構(gòu)建重組乳酸乳球菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)抗凍肽，比較冷凍脅迫前后乳酸乳球菌的生長(zhǎng)曲線、發(fā)酵活力和細(xì)胞內(nèi)鈉、鉀離子含量的變化，研究重組菌在冷凍脅迫作用下的生理功能特性。結(jié)果表明，抗凍肽具有顯著的抗冷凍脅迫保護(hù)作用。Zhao 等[30]將4 種云杉品種的基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主中表達(dá)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)、提取、純化后的可溶性基因蛋白進(jìn)行差示掃描量熱儀測(cè)試，其特征THA 分別為0.77 ℃（PicW1）、0.78 ℃（PicW2）、0.72 ℃（PicM）和0.86 ℃（PicK），顯著高于對(duì)照組（牛血清蛋白）的0.05 ℃。

3.3 基因工程表達(dá)

基因工程表達(dá)蛋白，是先設(shè)計(jì)目的基因并在體外構(gòu)建DNA 分子，然后將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品的遺傳技術(shù)。董小云[31]從白菜型冬油菜中分離鑒定出白菜型冬油菜抗凍蛋白（BrAFP1），其分子量為38.130 kDa。讓冬油菜幼苗在低溫脅迫下生長(zhǎng)，結(jié)果顯示BrAFP1 基因表達(dá)上調(diào)，表明該基因在白菜型冬油菜低溫響應(yīng)中起著重要作用。Yu 等[32]從沙冬青中克隆出AnAFP 基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量，發(fā)現(xiàn)高溫對(duì)AnAFP、AnICE1 和AnCBF 基因的表達(dá)有顯著的誘導(dǎo)作用，表明AnAFP 可能受冷脅迫信號(hào)調(diào)節(jié)通路調(diào)控。表2 歸納了3 種方法制備AFPs 的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。

表2 AFPs 的制備方法比較Table 2 Comparison on the preparation methods of antifreeze proteins

4 AFPs 的分離純化

通過(guò)化學(xué)法、分子生物學(xué)表達(dá)、基因工程表達(dá)制備得到的AFPs 粗液是一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)體系，包含多種蛋白質(zhì)，因此，需要進(jìn)一步的分離純化從而獲得高濃度的AFPs 溶液。冰親和層析、色譜層析、Ni 柱親和層析為常見(jiàn)的純化方法。

4.1 冰親和層析

冰親和層析是純化AFPs 的傳統(tǒng)方法。純化的原理是如果冰晶生長(zhǎng)得足夠慢，過(guò)冷就會(huì)被最小化，雜質(zhì)很難進(jìn)入晶體，可以通過(guò)混合溶液來(lái)排除冰中的溶質(zhì)。冰親和層析有兩種方法可以實(shí)現(xiàn)，第一種方法是冰親和純化技術(shù)，即用黃銅冷指浸入蛋白質(zhì)溶液中，純化后的蛋白質(zhì)在黃銅冷指上緩慢生長(zhǎng)，不斷攪拌溶液防止雜蛋白結(jié)冰；第二種方法是冰殼純化，即圓底燒瓶浸泡在冷水浴里，低溫使燒瓶表面形成薄冰，抗凍蛋白通過(guò)吸附到冰的表面以達(dá)到純化的效果[33]。這兩種方法都是在容器中混合AFPs 溶液，同時(shí)通過(guò)程序，利用水浴降低溫度，通過(guò)融化冰提取純化的蛋白質(zhì)。Tomalty 等[34]從實(shí)驗(yàn)室冷馴化后的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)勻漿中制備出AFPs，經(jīng)過(guò)5 次旋轉(zhuǎn)冰親和純化蛋白，測(cè)得其熱值活性最高為3.5 ℃，幼蟲(chóng)勻漿的上清部分具有大量不同的蛋白質(zhì)，最高相對(duì)分子質(zhì)量可達(dá)175 kDa。與傳統(tǒng)的分離純化AFPs 方法相比，冰親和層析法更適用于AFPs 較大規(guī)模的粗分離純化，而且電泳條帶切割法適用于高精度和高純度樣品地分離[35]。

馬慶保[36]以特異性親和吸附法制備南極磷蝦AFPs，優(yōu)化的提取南極磷蝦AFPs 最佳條件為樣品濃度1.0 mg/mL、吸附溫度-1.70 ℃、吸附時(shí)間11 h、吸附次數(shù)為2，在此條件下，南極磷蝦AFPs 的預(yù)測(cè)得率為30.12%，THA 為0.079 ℃。

4.2 色譜層析

色譜層析作為一種物理化學(xué)分離純化方法，是從混合物中分離組分的最重要的方法之一。凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)流體分子的體積或分子量不同來(lái)達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)分離的目的，離子交換色譜層析的固定相為陰離子或者陽(yáng)離子交換劑，流動(dòng)相為粗蛋白溶液，根據(jù)組分離子與交換劑上的平衡離子的結(jié)合力大小而進(jìn)行分離的一種色譜層析方法。目前，分離純化AFPs 最常用的方法是凝膠過(guò)濾色譜法和離子交換色譜層析法。通常，AFPs 的分離純化需要這些色譜方法的組合應(yīng)用。

Ding 等[37]從冷馴化的大麥中提取AFPs，通過(guò)超濾濃縮樣品至五分之一，硫酸銨梯度沉淀，然后再通過(guò)高配基密度-羥色藻糖快速流動(dòng)層析和凝膠過(guò)濾色譜層析兩種色譜層析的方法純化大麥籽粒AFPs，然后采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行蛋白鑒定。結(jié)果表明，滲透離心提取的蛋白比傳統(tǒng)方法更有針對(duì)性。Wu等[38]用細(xì)胞外蛋白酶對(duì)三文魚(yú)皮中的膠原蛋白進(jìn)行水解，通過(guò)超濾和尺寸排阻層析后，得出其水解產(chǎn)物具有良好的抗凍性（>3 kDa）和抗氧化活性（< 3 kDa）。

4.3 Ni 柱親和層析

Ni 柱親和層析依據(jù)金屬Ni 通過(guò)與電子供體配基上能與Ni2+相互作用的羧基或氨基的電負(fù)性元素（O，N）形成較穩(wěn)定的金屬螯合物，使得AFPs 可以選擇性地結(jié)合在填料上，而其他的雜質(zhì)蛋白則不能結(jié)合或僅能微弱結(jié)合。用不同濃度的咪唑緩沖液將結(jié)合在介質(zhì)上的His 標(biāo)簽蛋白洗脫下來(lái)，由于純化的重組蛋白粗提取液中含有His-Tag 標(biāo)簽，Ni2+與His-Tag 標(biāo)簽結(jié)合，通過(guò)Ni 柱親和層析純化出需要的蛋白質(zhì)，可以得到較高純度的His 標(biāo)簽蛋白。Mao 等[39]在大腸桿菌中異源表達(dá)GmAFPIV 蛋白，將蛋白上清粗提取液負(fù)載在Ni-NTA 柱上，用不同濃度咪唑緩沖液把目的蛋白洗脫下來(lái)，經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，其分子量約為30 kDa，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡驗(yàn)證其活性。金泉等[40]通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)絲膠抗凍肽并用鎳瓊脂糖親和層析對(duì)其蛋白粗提取液進(jìn)行純化，測(cè)得其蛋白分子量為25～35 kDa，并證明了提取到的融合蛋白具有抗冷凍脅迫保護(hù)作用。表3 總結(jié)了3 種AFPs 分離純化方法的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。

表3 AFPs 的分離純化方法對(duì)比Table 3 Comparison on the separation and purification methods of antifreeze proteins

5 AFPs 在食品中的應(yīng)用

近年來(lái)，隨著對(duì)AFPs 性質(zhì)和機(jī)理的深入研究，其應(yīng)用領(lǐng)域也越來(lái)越廣泛。在食品工業(yè)中，AFPs 被認(rèn)為是天然的冰晶生長(zhǎng)抑制劑，即使在較低的濃度下，它依然能夠在食品的冷凍、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和解凍過(guò)程中抑制冰晶再結(jié)晶和降低化合物的冰點(diǎn)，從而通過(guò)減少細(xì)胞損傷來(lái)保留食物原有風(fēng)味，減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架壽命。

5.1 AFPs 在冷凍肉制品中的應(yīng)用

AFPs 通過(guò)不可逆地附著在冰晶表面，抑制冰晶的生長(zhǎng)，進(jìn)而改變冰晶的形態(tài)，抑制再結(jié)晶，提高冷凍食品的生物抗凍能力。Zeng 等[41]采用響應(yīng)面法對(duì)羅非魚(yú)加工副產(chǎn)物進(jìn)行酶解，制備了抗凍肽，通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，抗凍肽保護(hù)下的細(xì)胞表面更規(guī)則、光滑、完整，表明其可作為一種新型菌體的冷凍保護(hù)劑，用于益生菌的保存。Chen 等[42]將不同濃度的AFPs 添加到冷凍雞肉中，觀察雞肉的持水能力、水分分布、顏色、蛋白質(zhì)特性、微觀結(jié)構(gòu)和組織學(xué)的變化，結(jié)果表明，AFPs 可以顯著提高冷凍雞肉的品質(zhì)，減少冷凍期間雞肉的營(yíng)養(yǎng)損失，是一種潛在的、安全的、高效的冷凍保護(hù)劑。Li 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，添加0.2%AFPs 的速凍豬肉餅經(jīng)過(guò)5 次凍融循環(huán)后，肉餅硬度和彈性均高于對(duì)照組。

5.2 AFPs 在冷凍面團(tuán)中的應(yīng)用

AFPs 可以改變冰晶的大小和形狀，從而抑制冰晶的再結(jié)晶，這對(duì)提高冷凍食品的品質(zhì)和延長(zhǎng)保質(zhì)期有重要作用。目前，AFPs 已被應(yīng)用于許多冷凍食品的加工中。例如，向預(yù)烤冷凍面包中添加小麥AFPs 和海藻糖，發(fā)現(xiàn)AFPs 能夠改善復(fù)烤面包的品質(zhì)，與未添加相比，0.6% AFPs 與0.6%海藻糖能夠緩解凍融對(duì)復(fù)烤面包的影響[44]。Zhang 等[45]研究了添加或不添加AFPs 的情況下對(duì)冷凍面團(tuán)的影響。結(jié)構(gòu)特性結(jié)果顯示，添加燕麥AFPs 可以降低冷凍面團(tuán)中的可凍水含量。流變學(xué)特性結(jié)果表明，與未添加燕麥AFPs 組相比，添加燕麥AFPs 組的發(fā)酵能力更強(qiáng)；掃描電鏡結(jié)果表明，燕麥AFPs 的加入可以保護(hù)面筋基質(zhì)免受溫度波動(dòng)和冷凍造成的破壞，從而使饅頭質(zhì)地特性更好。AFPs 的添加可以改善饅頭的質(zhì)地，但隨著存放時(shí)間的延長(zhǎng)，這種改善作用逐漸減弱。

5.3 AFPs 在冰淇淋中的應(yīng)用

在冰淇淋產(chǎn)品中，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度是評(píng)價(jià)冰淇淋在儲(chǔ)存過(guò)程中熱力學(xué)穩(wěn)定性的一個(gè)指標(biāo)。AFPs 可以提高冰淇淋的重結(jié)晶、耐融性和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度[46]。為了開(kāi)發(fā)一款質(zhì)地細(xì)膩、抑制重結(jié)晶能力強(qiáng)的冰淇淋，Kaleda 等[47]將冬黑麥AFPs 添加到冰淇淋中，研究AFPs對(duì)冰淇淋結(jié)構(gòu)和質(zhì)地的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)AFPs 存在時(shí)，冰淇淋中的冰晶明顯變小，再結(jié)晶受到抑制，冰淇淋質(zhì)地更順滑，提高冰淇淋對(duì)溫度波動(dòng)的耐受性。Zhang 等[48]從燕麥中提取燕麥抗凍蛋白（Avena sativa L.AFPs，AsAFP），在濃度15.0 mg/mL時(shí)，其THA 為1.24 ℃，經(jīng)過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS） 和串聯(lián)質(zhì)譜（tandem massspectrometry，MS/MS）質(zhì)譜分析結(jié)果表明，AsAFP與幾丁質(zhì)內(nèi)質(zhì)酶同源。隨后，將0.1%的AsAFP 添加到冰淇淋中，使得玻璃化轉(zhuǎn)變溫度從-29.14 ℃增加到-27.74 ℃，有效提高了冰淇淋的抑制重結(jié)晶和耐融化性。

5.4 AFPs 在低溫果蔬中的應(yīng)用

無(wú)論是植物細(xì)胞還是動(dòng)物細(xì)胞，在冷凍時(shí)的細(xì)胞損傷都是由再結(jié)晶時(shí)晶體尺寸的增加導(dǎo)致。此外，AFPs 通過(guò)抑制冰晶的生長(zhǎng)來(lái)防止再結(jié)晶，進(jìn)而阻礙冰的融化[49]。在低溫保存過(guò)程中，融化或解凍是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的主要過(guò)程。Kashyap 等[16]用沙棘抗凍蛋白（hippophae rhamnoides chitinase class IV，HrCHI4）預(yù)處理青豆，然后將其冷凍保存，并對(duì)HrCHI4 作為冷凍保護(hù)劑的作用進(jìn)行了分析。通過(guò)掃描電鏡、氣相色譜-質(zhì)譜等檢測(cè)青豆的結(jié)構(gòu)和組成成分，結(jié)果表明，用HrCHI4 預(yù)處理后能夠降低冷凍青豆的滴水損失和電解質(zhì)泄漏，保持了青豆細(xì)胞膜的完整性，保護(hù)外層細(xì)胞并促進(jìn)凍融后揮發(fā)成分的保留。此研究通過(guò)自然方法來(lái)保持低溫蔬菜的質(zhì)地和新鮮度，開(kāi)辟了AFPs 在果蔬產(chǎn)品保存中的應(yīng)用途徑。Kashyap 等[50]對(duì)豌豆冷凍前進(jìn)行預(yù)處理，測(cè)定了冷凍豌豆解凍后的滴水損失，采用高效液相色譜法檢測(cè)豌豆在冷凍前后維生素的流失情況。結(jié)果表明，使用大麥AFPs 處理后的豌豆水分和維生素（硫胺素、吡哆醇、核黃素和抗壞血酸含量）損失減少。

6 展望

目前，由于AFPs 制備成本高昂，因此在食品領(lǐng)域還未得到廣泛的應(yīng)用。

6.1 制備前景展望

除了通過(guò)化學(xué)法、分子生物學(xué)表達(dá)、基因工程表達(dá)方法制備AFPs，還可以用體外無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（cell-free translation system，CFPS）來(lái)制備AFPs。CFPS是以外源DNA 或者mRNA 為模板，在無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系內(nèi)補(bǔ)充底物和能源物質(zhì)[腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine triphosphate，GTP）等]，利用細(xì)胞抽提物提供的細(xì)胞器在T7/SP6 RNA聚合酶的組合下體外表達(dá)目的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)。

在CFPS 中，細(xì)胞膜的缺失有助于蛋白質(zhì)折疊，進(jìn)而更好地合成AFPs 以達(dá)到高通量生產(chǎn)，并且CFPS 制備出的雜蛋白少，利于純化蛋白，從而避免了純化過(guò)程中靶蛋白的減少，可以獲得更高的蛋白產(chǎn)量[51]。由于不含有活細(xì)胞，因此，CFPS 自然地克服了維持細(xì)胞活性的通用限制，在人工和預(yù)定義的環(huán)境中工程化和控制基本和必要的細(xì)胞過(guò)程方面具有巨大潛力[52]。

6.2 應(yīng)用前景展望

生物體的抗寒能力是生物體適應(yīng)惡劣自然環(huán)境的一種能力，AFPs 的出現(xiàn)揭示了這種自我保護(hù)能力的本質(zhì)。隨著AFPs 的研究逐年增多，不僅發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的耐寒生物體中含有AFPs，而且AFPs 的防凍作用機(jī)制也越來(lái)越清晰。低溫醫(yī)學(xué)是開(kāi)發(fā)安全、高效、適用于重大疾病治療的醫(yī)用防凍劑的新興領(lǐng)域。血液、胚胎、器官，甚至身體等各種相關(guān)生物材料都需要冷凍保存，保存后的生物材料可用來(lái)幫助患者治療和恢復(fù)身體健康。雖然昆蟲(chóng)AFPs 的抗凍活性高于其他種類的活性，但是無(wú)法從昆蟲(chóng)中大量提取AFPs。因此，大多數(shù)應(yīng)用的AFPs 都來(lái)自魚(yú)類AFPs，其中III 型AFPs 更容易通過(guò)基因重組產(chǎn)生，最常用于低溫保存。

7 小結(jié)

從AFPs 的特性和應(yīng)用來(lái)看，它不僅與人們的生活息息相關(guān)，而且也滲透到各個(gè)領(lǐng)域。本文介紹了AFPs 的來(lái)源，諸多研究表明，自然界中不同生物來(lái)源AFPs 的特征有差異；總結(jié)了AFPs 的特性，其具有降低溶液的冰點(diǎn)，保持溶液熔點(diǎn)不發(fā)生變化，阻止微小冰晶在冷凍、低溫保存過(guò)程中生長(zhǎng)為大晶體的特性，并具有改變冰晶形態(tài)的能力；此外詳細(xì)描述了目前常用的AFPs 制備與純化方法，并對(duì)這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析；最后介紹了AFPs 在食品中的應(yīng)用現(xiàn)狀并展望其制備和應(yīng)用前景。盡管AFPs 作為未來(lái)生物技術(shù)的重要性在不同領(lǐng)域得到了認(rèn)可，但對(duì)其在低溫下的作用和調(diào)節(jié)抗凍活性機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。