TM6SF1基因在肺腺癌細胞中的作用*

劉婷雋

徐州醫科大學實驗動物中心，江蘇 徐州 221004

肺癌的發生和發展是一個多步驟的過程。它們是由異?；蜃兓偷鞍踪|表達引起的腫瘤，導致細胞表型轉化和進展［1-3］。非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌總發生率的80%以上，而肺腺癌（LUAD）是原發性肺癌的主要亞類（約85%）［4］。LUAD 潛伏期長，早期癥狀輕，惡性程度高。通常情況下，LUAD 患者在診斷時已進入晚期，失去治療機會［5-6］。隨著各種靶向藥物的發展及其在LUAD 中的應用，LUAD 患者的5 年生存率有所提高，尤其是程序性細胞死亡蛋白1/程序性細胞死亡蛋白配體1（PD-1/PD-L1）等免疫治療藥物的應用［7］。因此，識別新的生物標志物來預測免疫治療的療效是非常必要的。

溶酶體是一種高度酸性的膜結合細胞器，參與細胞內和細胞外大分子的轉換［8-9］。溶酶體中含有50 多種酸性水解酶，用于細胞成分消化。為了防止這些水解酶和質子的泄漏，從而破壞周圍的細胞溶質環境（細胞溶質酸化和蛋白水解），導致細胞死亡［10-11］。因此，細胞需要具有各種高度糖基化的整體蛋白的溶酶體膜來承受管腔酸性微環境。此外，溶酶體膜是與靶細胞器（如內體和自噬體）相互作用的重要橋梁，有效的促進細胞內蛋白質運輸［11］。

TM6SF1 位于人類15q24-q26 染色體和小鼠7 號染色體，轉錄本大小為1.4 kb，編碼370個氨基酸的蛋白質，具有6個功能未知的跨膜結構域，是一種廣泛表達的溶酶體跨膜蛋白［12］。有研究［12-13］利用熒光細胞成像技術，觀察到TM6SF1囊泡與溶酶體膜的一體化融合過程。已被證明在人腦、肺、肝、腎臟、脾臟、睪丸和外周血白細胞中表達。目前研究結果提示，TM6SF1異常高甲基化可能與某些惡性腫瘤的發生發展密切相關。但其在肺腺癌中的作用仍不清楚。

本研究通過GEPIA 數據庫分析TM6SF1 蛋白在肺腺癌中的表達情況，同時通過細胞實驗觀察過表達TM6SF1 后對A549細胞增殖、遷移的影響，進而來探討TM6SF1基因在判斷肺腺癌預后和靶向治療中應用的可行性。

1 實驗與方法

1.1 細胞培養

A549、H1299、H1975、PC9、HCC78 和HBE 細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM 培養液中，并加入1%的青鏈霉素，在37 ℃，5%CO2的飽和濕度下培養。分為空白對照組和實驗組，當細胞處于對數生長期時，即可以用于實驗。

1.2 GEPIA數據庫分析

登錄GEPIA 數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/），利用General 和Survival Analysis 模塊，在線分析TM6SF1 基因在肺癌及正常組織中的表達情況及生存曲線。

1.3 細胞增殖活性檢測

將對數生長期的A549 細胞以1× 105個/孔，接種于96孔板。細胞孵箱中培養過夜，每組設置3 個復孔。每孔加入20 μL CCK8，繼續培養1～2 h。酶標儀測定各孔OD 值（450 nm），計算分析各組細胞增殖情況。

1.4 過表達TM6SF1細胞株的構建

NCBI網站檢索并設計TM6SF1 引物序列，用南京生工公司合成過表達載體513B，BamHI/XbaI 酶切，構建513B-LV-TM6SF1過表達質粒。

1.5 慢病毒包裝

使用促轉染試劑將構建好的重組質粒、輔助質粒與293T 細胞共轉染6 h，更換新鮮培養基繼續培養48 h，收集細胞上清液。

1.6 慢病毒感染

將處于對數生長期的A549 細胞以105個/mL 接種于6孔板，按照慢病毒感染復數=20 加入病毒并添加1∶1 500的聚凝胺進行感染，以獲取穩定過表達TM6SF1的A549細胞株。12 h 后換新鮮培養基。48 h 后提取蛋白，Western blot檢測TM6SF1的過表達效果。

1.7 RNA提取和RT-PCR分析

A549 細胞胰酶消化細胞，PBS 清洗一遍。使用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA，并反向轉錄為cDNA。對于RT-PCR，使用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。使用SYBR Green I Master 在LightCycler 480 中進行實時定量PCR。TM6SF1 引物序列：正義：5'-CGGCCCAGCATGATTCCT-3'，反義：5'-TCCCGGGGTGGTTTTCTTTT-3'，擴增產物為103 bp。GAPDH 引物序列:正義5'-TGCACCACCAACTGCT-TAGC-3'， 反義5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'，擴增產物為87 bp。

1.8 細胞劃痕實驗

將對數生長期的A549細胞以5× 105個/孔，接種于6孔板，細胞孵箱中培養過夜。第二天用10 μL 槍頭在培養皿中以“十”字形劃線。用PBS 洗去劃下的細胞，加入無血清培養基，同時拍照0 h 照片。繼續放入細胞培養孵箱中用不含血清的培養基培養24 h，拍照并分析。

1.9 Transwell實驗

取處于對數生長期的細胞，實驗前1 d 使用無血清培養基在培養箱中饑餓培養24 h。取出Transwell小室，放入24 孔板中，小室及孔中加入500 μL 37 ℃預熱的無血清培養基，置于CO2培養箱2 h，小心吸去小室中的培養液。胰酶消化細胞，然后加入完全培養基吹打為單細胞懸液，1 000 rpm 離心5 min 離心沉淀細胞，吸取上清，PBS 溶液洗滌2 次去除完全培養基，離心沉淀細胞，將細胞沉淀重懸于無血清的培養基中，調整好細胞濃度為1～5× 105/mL，取100 μL 細胞懸液加入Transwell 小室的上部，下室加入600 μL 完全培養基，細胞孵箱中培養24 h。取出小室，PBS 清洗2 次，上下室分別加入600 μL 75%乙醇固定30 min；吸除乙醇， PBS 清洗2 次，0.1%結晶紫染色30 min，雙蒸水清洗3 次后，自然晾干，于顯微鏡鏡下隨機選取10 個視野拍照并計數細胞。

1.10 Western blot

A549 細胞經胰酶消化，PBS 清洗一遍，并用RIPA 裂解緩沖液（在冰上裂解30 min。使用BCA方法檢測蛋白質濃度。將等量的蛋白質裝載到凝膠上進行分離，轉移到Hybond NC 膜上。在室溫下用5%脫脂乳封閉膜1 h，并在4 °C 下與一級抗體孵育過夜。一級抗體如下：第二天，清洗膜，并在室溫下與適當的辣根過氧化物酶（HRP）結合二級抗體孵育1 h。使用化學發光檢測系統檢測印跡。

1.11 統計學方法

數據采用SPSS 22.0 軟件通過One-way ANOVA 多及t檢驗進行統計分析。以P＜0.05 為差義有統計學意義（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。

2 結果

2.1 GEPIA數據庫分析結果

通過GEPIA 數據庫分析得知，與正常組織相比，TM6SF1 在肺腺癌中的表達降低（*P＜0.05）（圖1A）；且TM6SF1 高表達肺腺癌患者生存時間明顯長于TM6SF1 低表達患者（**P＜0.001）（圖1B）。另外，TM6SF1 與細胞增殖相關的核抗原Ki-67 具有負相關性（***P＜0.001）（圖1C）。這提示TM6SF1 在肺腺癌中可能具有抑制腫瘤的作用。

圖1 GEPIA數據庫分析結果

2.2 TM6SF1 基因在肺腺癌細胞系中的表達及過表達TM6SF1細胞系的構建

用WB 及qRT-RCR 分析5 株人肺腺癌細胞系中TM6SF1基因的表達情況。從WB結果可以看出，與正常支氣管上皮細胞HBE 相比，TM6SF1 蛋白在人肺腺癌A549、H1299、H1975、PC9 細胞中表達下調，而在HCC78 中不明顯（圖2A）。qRT-RCR 結果顯示，除H1975 細胞以外，TM6SF1 基因在其他4 株肺腺癌細胞中的表達均下調（圖2A）。我們取TM6SF1 表達較低的A549 細胞系進行后續實驗。

圖2 TM6SF1在肺腺癌細胞系中的表達及過表達細胞株的鑒定

為了研究TM6SF1 在肺腺癌發生、發展中的生物學作用，研究在A549 細胞中轉染目的基因TM6SF1。將轉染成功的細胞裂解，提取細胞總蛋白，WB 結果顯示，與轉染LV-NC 相比， 轉染LV-TM6SF1-1 和LV-TM6SF1-2 后的A549 細胞中TM6SF1 表達明顯增加（圖2B），因此該細胞株即為穩定表達TM6SF1的A549細胞株。

2.3 TM6SF1基因對A549細胞增殖的影響

為了進一步研究TM6SF1對A549細胞增殖的影響，研究者進行了細胞增殖實驗。CCK8實驗結果見圖3。在培養48 h 后，過表達TM6SF1 的A549 細胞與對照組相比，細胞數量明顯受到抑制，說明TM6SF1 抑制A549 細胞的增殖。

圖3 TM6SF1對A549細胞增殖的影響

2.4 細胞劃痕及Transwell實驗結果

為了闡述TM6SF1 在肺癌細胞侵襲和轉移過程中的作用，研究采用劃痕實驗和Transwell 小室來檢測TM6SF1 對侵襲和轉移的影響。實驗結果顯示，A549 細胞中TM6SF1的表達上調后，肺癌細胞的侵襲和轉移能力減弱（圖4A）。在劃痕實驗中，過表達TM6SF1 后，A549 細胞的傷口愈合能力減弱。（圖4B）。這表明TM6SF1 在肺癌中起到抑制細胞轉移的作用。

圖4 TM6SF1對A549細胞的侵襲和遷移的影響

2.5 Westren blot檢測PI3K/Akt通路相關蛋白

PI3K/Akt 通路參與調控體內細胞增殖、凋亡和分化等多種生物學功能，是目前NSCLC 最常見的調控途徑之一［14］。為了進一步研究TM6SF1 是否參與調控PI3K/Akt 通路，采用WB 檢測PI3K/Akt 通路相關蛋白的表達。實驗結果，見圖5，過表達TM6SF1 后， p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt明顯降低。

圖5 TM6SF1對PI3K/Akt通路中Akt、pAkt、PI3K、p-PI3K表達量的影響

3 討論

近年來肺癌發病率和死亡率均呈上升趨勢，位于我國惡性腫瘤死亡率之首，備受臨床及流行病學研究者的關注。而LUAD 是肺癌中常見的病理類型，它起源于小氣道上皮中分泌粘液的II 型肺泡細胞。轉移和侵襲率高是LUAD 最顯著的特征之一，盡管在手術切除、化學療法和放射療法方面已取得一定進展，但其5 年生存率仍較低［15］，抗腫瘤藥物耐藥是導致腫瘤治療失敗的重要原因之一。如何有效的預防和抑制肺腺癌轉移是肺癌有效治療的關鍵因素。

TM6SF1 是六跨膜蛋白超家族的重要成員之一，其表達調控在很大程度上是未知的，但已證實該基因是miR-155 和miR-K12-11 的靶點［16］。此外，TM6SF1 在肝癌和腎癌中發生過甲基化［13，17］，這意味著TM6SF1 的表達以表觀遺傳方式受到高度調節。研究［18］發現，其異常高甲基化可能與癌癥的發生發展有一定的相關性。但其在肺腺癌中的作用還沒有報道。

在本實驗中，通過GSPIA 數據庫分析得知TM6SF1 在肺腺癌中的表達低于正常組織，且TM6SF1 與細胞增殖相關抗原Ki-67 具有負相關性。高表達TM6SF1 的肺腺癌患者具有更長的生存期。同時，在4 株肺腺癌細胞中證實，TM6SF1 低表達。在此基礎上，本研究構建過表達TM6SF1的A549細胞系，并發現過表達TM6SF1能明顯促進肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，但具體是通過何種作用機制還需要進一步研究。另外，本研究只是通過GSPIA 數據庫分析得知TM6SF1 在肺腺癌中的表達低于正常組織，但在臨床樣本中的實際表達情況還不清楚，接下來研究者將分析臨床樣本中TM6SF1 的表達與癌癥分化程度、患者生存情況的相關性。在多數腫瘤中，PI3K/Akt 通路處于持續激活狀態，抑制PI3K/Akt通路可抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移［19］。TM6SF1 是否調節PI3K/Akt 通路影響細胞增殖尚不明確。本研究發現，過表達TM6SF1 可下調PI3K/Akt 通路相關激酶的表達，下游信號通路受到抑制。溶酶體跨膜蛋白和自噬有著密切的關系。小鼠或細胞中一些溶酶體蛋白LAMP1、LAMP2 的缺失可引起自噬的發生，而LAPTM4B則可以抑制自噬。那么，TM6SF1 是否參與調節自噬，若參與自噬，其具體的機制是什么有待于進一步的研究。

綜上所述，本研究結果為明確TM6SF1 在肺腺癌中的作用機制提供了實驗基礎，TM6SF1 可能作為一種新的抑癌基因，為肺癌的診斷治療提供新的證據。