八味固本化濕降脂方標(biāo)準(zhǔn)湯劑的工藝研究

易玉柳 陳浩, 劉翔 周麗 易菲 李蕊 劉玉紅 溫金華 （.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 0004；. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌0006；.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南昌 0006）

八味固本化濕降脂方由黨參、炒白術(shù)、鹽澤瀉、綠蘿花各12 g，金錢草、炒決明子、荷葉各15 g，紅曲9 g 組成，為臨床經(jīng)驗(yàn)方，擬制成中藥制劑。方中黨參有補(bǔ)中益氣、補(bǔ)脾益肺等功效，加上炒白術(shù)有健脾利水、益氣燥濕的作用［1］。《金匱要略方義》有記載澤瀉與白術(shù)兩藥并用，既重祛濕，又重健脾，鹽澤瀉有利水滲濕、化濁降脂的功效，可助白術(shù)健脾加滲濕緩瀉［2-4］，金錢草利濕消腫，與白術(shù)共為臣藥。藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，決明子、紅曲均能降低動(dòng)物血清血脂水平，荷葉、綠蘿花能升清化濕［5-6］。全方從整體上對(duì)脾虛濕阻型單純性肥胖患者情志、氣機(jī)、中焦進(jìn)行調(diào)理，諸藥同用有化濕降脂之功效?，F(xiàn)對(duì)八味固本化濕降脂方君藥中的黨參炔苷，臣藥中的槲皮素以及在降脂減肥中起到主要作用的荷葉堿、銀椴苷、橙黃決明素進(jìn)行含量測(cè)定，并采用正交試驗(yàn)確定最佳煎煮條件，為制劑的質(zhì)量控制、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)以及臨床用藥安全性提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀美國Waters 公司（型號(hào)：Waters 2695）；電子分析天平、十萬分之一天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司（型號(hào)：AE240）；超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司（型號(hào)：RKQ-500E）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠（型號(hào)：E-52A/52AA）。

1.2 試藥

1.2.1 藥物 藥材飲片均由江西古漢精制中藥飲片有限公司提供。黨參產(chǎn)自甘肅，其來源于桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的干燥根；炒白術(shù)產(chǎn)自安徽，其來源于菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.干燥根莖的加工品；金錢草產(chǎn)自四川，其來源于報(bào)春花科植物過路黃Lysimachia christinaeHance.的干燥全草；荷葉產(chǎn)自湖南，其來源于睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉；紅曲產(chǎn)自福建，其來源于曲酶科真菌紫色紅曲霉Monascus purpureusWent.的菌絲體及孢子經(jīng)人工培養(yǎng)，使菌絲在粳米部生長(zhǎng)，使整個(gè)米粒變成紅色而形成的紅曲米；鹽澤瀉產(chǎn)自四川，其來源于澤瀉科植物澤瀉Alisma planta goaquaticaLinn.的干燥塊莖的加工品；炒決明子產(chǎn)自河北，其來源于豆科植物鈍葉決明Cassia obtusifoliaL.的干燥成熟種子的加工品；綠蘿花產(chǎn)自西藏，其來源于瑞香科結(jié)香屬植物滇結(jié)香Edgeworthia gardneri（Wall.）Meisn.的干燥花蕾。上述藥材經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院付小梅教授鑒定均為正品，符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

1.2.2 對(duì)照品 銀椴苷（批號(hào)：IY302951，純度≥98%）、橙黃決明素（批號(hào)：KY240621，純度≥98%）、黨參炔苷（批號(hào)：DL120031，純度≥98%）、荷葉堿（批號(hào)：AL40311，純度≥98%）、槲皮素（批號(hào)：QL103929，純度≥98%），均購自合肥博美生物有限公司。

1.2.3 試劑 甲醇（批號(hào)：40Y2209FP，美國默克）、乙腈（批號(hào)：12Y2208FH，美國默克）、磷酸（批號(hào)：H2212477，上海阿拉?。?、純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 湯劑制備

參考《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》以及《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》中煎煮湯劑的制備方法［7-8］，取八味固本化濕降脂方一個(gè)處方量102 g，由黨參、炒白術(shù)、鹽澤瀉、綠蘿花各12 g，金錢草、炒決明子、荷葉各15 g，紅曲9 g 組成。前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)荷葉需要久煎效果更佳，在此基礎(chǔ)上荷葉選擇先煎煮30 min。炒制過的決明子以及由紅曲霉與粳米發(fā)酵而成的中藥紅曲，在多次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)煎煮15 min 為最佳煎煮條件。煎煮濃縮至藥液約100 mL，倒出藥液趁熱濾過，純凈水定容至100 mL。

2.2 色譜條件

色譜柱為WAT054275 Symmetry C18（4.6 mm×250 mm），5 μm；流動(dòng)相為乙腈（B）-0.1%磷酸（A）；梯度洗脫設(shè)置為0～20 min，5%～10%乙腈；20～30 min，10%～15%乙腈；30～50 min，15%～18%乙腈；50～65 min，18%～20%乙腈；65～76 min， 20%～22%乙腈；76～80 min，22%～30%乙腈；80～95 min，30%～ 50%乙腈；95～105 min，50%～70% 乙腈；105～115 min，70%～80% 乙腈。進(jìn)樣量為10 μL；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為300 nm。在上述條件下，目標(biāo)峰可以完全分離，混合對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品及供試品溶液色譜圖

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品制備 取“2.1”項(xiàng)下得到的湯劑5 mL，離心10 min（4 500 r/min），1.5 mL 一次性針管吸取離心管中的上清液，過微孔濾膜，供試品溶液備用。

2.3.2 混合對(duì)照品制備 精密稱定對(duì)照品荷葉堿0.000 82 g、黨參炔苷0.002 10g、槲皮素0.000 77 g、銀椴苷0.004 96 g、橙黃決明素0.001 43 g，10 mL甲醇溶解，配制濃度為82、210、77、496、143 μg/mL的混合對(duì)照品溶液制備。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”中對(duì)照品溶液，稀釋至1、2、4、8、16、32 倍，即可以得到一系列的混合對(duì)照品溶液，其中荷葉堿質(zhì)量濃度梯度為82、41、20.5、10.25、5.125、2.562 5 μg/mL，黨參炔苷質(zhì)量濃度梯度為210、105、52.5、26.25、13.125、6.562 5 μg/mL，槲皮素質(zhì)量濃度梯度為：78、39、19.5、9.75、4.875、2.437 5 μg/mL，銀椴苷質(zhì)量濃度梯度為496、248、124、62、31、15.5 μg/mL，橙黃決明素質(zhì)量濃度梯度為：144、72、36、18、9、4.5 μg/mL。分別按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，記錄色譜峰峰面積。以5 個(gè)對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明5 個(gè)對(duì)照品在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表2。

表2 各成分線性回歸方程

2.4.2 儀器精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3.2”中對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)測(cè)定6 次，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算RSD值。測(cè)得荷葉堿、黨參炔苷、槲皮素、橙黃決明素、銀椴苷譜峰峰面積的RSD分別為1.08%，0.80%，1.05%，0.58%，1.10%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.3 方法重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.3.1”項(xiàng)下供試品制備方法平行制備6 份，采用“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰峰面積。測(cè)得荷葉堿、黨參炔苷、槲皮素、銀椴苷、橙黃決明素色譜峰相對(duì)峰面積RSD分別為1.00%，1.29%，1.35%，1.22%，1.01%，結(jié)果顯示方法重復(fù)性良好。

2.4.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.3.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，采用“2.2”項(xiàng)下色譜條件，將制得的供試品溶液室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣，記錄色譜峰峰面積。測(cè)得荷葉堿、黨參炔苷、槲皮素、銀椴苷、橙黃決明素面積的RSD分別為1.04%，1.93%，1.94%，1.82%，1.76%，結(jié)果顯示八味固本化濕降脂方放置室溫24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 取已知指標(biāo)成分含量湯劑供試品樣品2.5 mL，精密量取6 份，分別置10 mL 容量瓶中，容量瓶1～6 號(hào)瓶中依次加入制備好的相同濃度的混合對(duì)照2.5 mL，混合均勻后，過微孔濾膜，即得到回收率實(shí)驗(yàn)的供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖并分析，分別計(jì)算荷葉堿、黨參炔苷、槲皮素、銀椴苷、橙黃決明素平均加樣回收率分別為99.76%，99.76%，99.44%，101.95%，100.97%；RSD分別為2.41%，2.98%，3.21%，2.81%，2.78%，結(jié)果表明該方法具有良好的回收率。

2.5 工藝研究

2.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為確定八味固本化濕降脂方最佳煎煮方法，在查閱中藥煎煮相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)其煎煮條件進(jìn)行3 水平3 因素的考察。除去荷葉考察，其余7 個(gè)藥材的加水倍數(shù)，分別以6、7、8 倍水；各個(gè)藥材浸泡時(shí)間為30、40、60 min；除去先下后下的藥材，考察剩余5 個(gè)藥材的煎煮時(shí)間，分別為20、30、40 min。見表3。

表3 因素水平表

2.5.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析，得到本方最佳煎煮條件為A2B3C2，即八味固本化濕降脂方飲片加水量為7 倍，浸泡時(shí)間為60 min，煎煮時(shí)間為30 min。最終確定本品的制備工藝為：取荷葉12 倍純凈水浸泡60 min，煮沸后文火先單獨(dú)煎煮30 min，再取黨參、炒白術(shù)、金錢草、鹽澤瀉、綠蘿花7 倍純凈水浸泡60 min，煎煮時(shí)間為30 min，后取紅曲、炒決明子7 倍純凈水浸泡60 min，煎煮15 min，趁熱過濾后收集藥液。二煎加7 倍純凈水，再次煮沸后文火煎煮30 min，藥液倒出趁熱過濾，將2 次煎煮液均過濾后收集在同一個(gè)容器中，采用抽濾機(jī)進(jìn)行負(fù)壓濃縮，用純凈水定容至100 mL。見表4。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明煎煮時(shí)間P＜0.05，為顯著性因素，而加水倍數(shù)與浸泡時(shí)間無顯著性。見表5。

表5 方差分析結(jié)果

2.5.3 最佳工藝驗(yàn)證 為確定最佳工藝的可行性，稱取八味固本化濕降脂方3 份，按照上述工藝下提取供試品溶液3 份，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，記錄色峰面積譜圖，計(jì)算八味固本化濕降脂方中荷葉堿、黨參炔苷、槲皮素、銀椴苷、橙黃決明素的含量，3 組試驗(yàn)各指標(biāo)的RSD均小于3%，表明工藝合理可行。見表6。

表6 試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果 μg/mL

3 討論

中藥復(fù)方湯劑的煎煮方法對(duì)臨床療效有很大的影響［9］，因此對(duì)中藥復(fù)方湯劑提取工藝的控制非常重要。但目前中藥湯劑質(zhì)量檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)制定還不夠完善，固在藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究之前進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑工藝研究是非常必要。本試驗(yàn)結(jié)果符合《中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略》［10］中提到的2～8 倍的水為根莖類藥材的加水量，而蓬松的葉類藥材加水量更多，因此本試驗(yàn)研究選擇了荷葉浸泡時(shí)加12 倍水，而其余藥材根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)一為7 倍水，浸泡時(shí)間為60 min，煎煮時(shí)間為30 min，即可提取藥材的大部分有效成分。本試驗(yàn)通過以指標(biāo)性成分含測(cè)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)等評(píng)價(jià)方法為臨床湯劑的質(zhì)控提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，該方法對(duì)于臨床煎煮湯劑起到質(zhì)控作用。

對(duì)八味固本化濕降脂方含量進(jìn)行了測(cè)定，在190～400 nm 范圍內(nèi)對(duì)待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，綜合考慮各方面因素，最終確定300 nm為此次實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

在流動(dòng)相方面，考察了甲醇-水、乙腈-0.5%磷酸水2 種流動(dòng)性梯度的洗脫結(jié)果，在乙腈-0.5%磷酸水基礎(chǔ)上又調(diào)整成了乙腈-0.1%磷酸水，結(jié)果顯示乙腈-0.1%磷酸水的分離效果最好，因此本次實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-0.1%磷酸水為檢測(cè)的流動(dòng)相系統(tǒng)。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為臨床制劑的標(biāo)準(zhǔn)參照物，是為了保障用藥準(zhǔn)確性和一致性的重要部分［13］，也是為開發(fā)中藥制劑做的前期準(zhǔn)備。本實(shí)驗(yàn)規(guī)范了八味固本化濕降脂方的煎煮工藝過程，確保了用藥的準(zhǔn)確性和療效的一致性，為進(jìn)一步開發(fā)成中藥制劑打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。