新疆某羊場羊棘球蚴基因型的鑒定與分析

馬穎超，黃 琴，陳紅強(qiáng)，張怡淼，胡建軍，靳 玲

（1.塔里木大學(xué)，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 阿拉爾 843300）

棘球蚴病又名包蟲病，是一種人畜共患寄生蟲病，幼蟲寄生于羊、豬、牛等動(dòng)物的肝、肺等內(nèi)臟器官，成蟲寄生于狐貍、犬、狼等動(dòng)物的小腸中。該病對(duì)綿羊的危害最為嚴(yán)重。世界上流行的棘球絳蟲有5 種，我國主要蟲種是細(xì)粒棘球絳蟲和多房棘球絳蟲，前者更為多見，其幼蟲會(huì)引起囊型棘球蚴病和泡狀棘球蚴病，因極強(qiáng)的致病性被世界衛(wèi)生組織列為十大寄生蟲病。根據(jù)基因組特征、DNA 序列的差異，細(xì)粒棘球蚴被劃分為10個(gè)基因型（G1～G10）［1］。蟲種及其基因分型鑒定作為寄生蟲種群遺傳機(jī)制研究的基礎(chǔ)，在提高臨床療效，控制包蟲病流行等方面具有重要意義。

本研究基于線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶第一基因（英文簡稱ND1），鑒定分析新疆南疆地區(qū)某羊場羊感染細(xì)粒棘球蚴的基因型，為該地區(qū)細(xì)粒棘球蚴病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 新疆南疆某牧區(qū)規(guī)模羊場羊群出現(xiàn)部分羊消瘦，并有發(fā)病死亡。解剖后發(fā)現(xiàn)病死羊的肺臟存在化膿灶，肝臟上有棘球蚴，剝離肝臟與肺臟包囊，保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)寄生部位，棘球蚴分別命名為Gxjy（肝臟）和Fxjy（肺臟）。

1.2 主要試劑 TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，均為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)檢查 將肝臟與肺臟上的棘球蚴囊泡置入干凈的平皿，用無菌注射器抽取囊泡中的囊液，滴加至載玻片，鏡檢。

1.3.2 樣本總DNA 提取 取25 mL 棘球蚴囊壁于液氮中充分研磨后，采用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取，提取后的全基因組DNA 用于ND1 的序列擴(kuò)增。

1.3.3 ND1基因的PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)［2］中的特異性引物ND1 基因引物（ND1-F、ND1-R），設(shè)計(jì)ND1基因的上、下游引物（Fw、Rv），引物由上海英濰捷基公司合成（見表1）。PCR 反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 18 μL，模板DNA 5 μL，上、下游引物各1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 ND1基因的上、下游引物序列

1.3.4 PCR 產(chǎn)物純化回收 將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物切膠，按照TIANgel Midi Purification Kit 試劑盒說明書純化回收PCR產(chǎn)物，送生工生物工程（上海）股份有限公司正向測序。

1.3.5 序列分析 測序結(jié)果在NCBI中作Blast比對(duì)，用DNAstar軟件進(jìn)行核苷酸序列同源性分析、系統(tǒng)發(fā)育分析，用MEGA 5.0 軟件繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢 肉眼可見病死羊的肝臟明顯增大，表面不平整，有大小不一的白色或黃色凸起，其中最大的直徑約8 cm，內(nèi)含有淡黃色的圓狀棘球蚴卵囊，單個(gè)或多個(gè)附著于肝上，卵囊壁光滑透明，囊壁分兩層（角質(zhì)層和生發(fā)層），包囊內(nèi)含有大量淡黃色渾濁液體。肺臟表面的一些棘球蚴病灶發(fā)生化膿。由此可見，本病的靶心病灶在于肝、肺兩大器官。

2.2 ND1基因PCR擴(kuò)增 以提取的棘球蚴蟲體組織DNA為模板，利用棘球蚴特異性引物（ND1-F、ND1-R）對(duì)ND1 基因（Fw、Rv）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出510 bp 大小的片段（圖1），與預(yù)期的目的片段大小相符。

圖1 細(xì)粒棘球蚴ND1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 ND1 基因核苷酸同源性比較 測序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行Blast 比對(duì)，并應(yīng)用DNAstar 對(duì)Gxjy（肝臟）與Fxjy（肺臟）進(jìn)行ND1 基因核苷酸序列同源性比較，結(jié)果兩者之間的核苷酸同源性為100%，即肝臟上的棘球蚴Gxjy 與肺臟上的棘球蚴Fxjy為同一棘球絳蟲株。

應(yīng)用DNAstar對(duì)Gxjy的ND1基因核苷酸與棘球蚴參考株的核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果核苷酸同源性可達(dá)84.1%以上（圖2）。通過MegAlign 軟件用鄰近法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），結(jié)果得出：Gxjy與棘球蚴參考株JN604111.1、GQ358013.1、KU169241.1、KC579443.1、KF731935.1、DQ341530.1、JQ317989.1處于同一分支。

圖2 肝臟中棘球蚴ND1基因與參考株的核苷酸同源性比較

圖3 以肝臟中棘球蚴ND1基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

3.1 棘球絳蟲的分類及危害性 世界上流行的棘球絳蟲有5種，分別為細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、少節(jié)棘球絳蟲、伏氏棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲［3］。其中細(xì)粒棘球蚴是我國主要流行的蟲種，特別是西部的青海、新疆、西藏、內(nèi)蒙古等牧區(qū)，包蟲病流行較為嚴(yán)重，綿羊感染率在50%以上［4］。

3.2 細(xì)粒棘球蚴基因型及感染情況 根據(jù)遺傳學(xué)特征，細(xì)粒棘球蚴的致病原由4 個(gè)棘球絳蟲復(fù)合種構(gòu)成，分別是狹義細(xì)粒棘球絳蟲、馬棘球絳蟲、奧氏棘球絳蟲和加拿大棘球絳蟲［5-6］。其中，狹義細(xì)粒棘球絳蟲根據(jù)基因序列分析對(duì)應(yīng)為G1型、G2型和G3型，三者因DNA序列差異小、遺傳距離近、寄生宿主種類與地理分布相似，被視為一個(gè)單獨(dú)的進(jìn)化種。山羊與綿羊均可成為狹義細(xì)粒棘球絳蟲的中間宿主，并且是G1～G3 型的主要易感動(dòng)物。G1型細(xì)粒棘球絳蟲呈全球分布，是目前引起全球人和動(dòng)物患包蟲病最多的第一大常見基因型。G2、G3型主要在亞洲、非洲與南美洲流行，雖然可以感染人，但分布范圍小，僅在個(gè)別地區(qū)被報(bào)道。馬棘球絳蟲最初因主要寄生于馬而被命名為細(xì)粒棘球絳蟲馬亞種，后修訂為馬株，對(duì)應(yīng)G4 型［7］。G4 型具有高度的宿主特異性，目前只有馬、驢、騾子、斑馬、獼猴為中間宿主［8-11］。奧氏棘球絳蟲對(duì)應(yīng)G5 型，G5 型的中間宿主主要為牛，綿羊與山羊也可被寄生。加拿大棘球絳蟲種一直備受爭論，目前對(duì)應(yīng)G6、G7、G8、G10 型［12］。根據(jù)現(xiàn)階段報(bào)道，加拿大棘球絳蟲只有G6型和G7型可寄生于綿羊與山羊，G8型和G10 型主要寄生于馬鹿、駝鹿等，且流行局限于北半球。我國曾報(bào)道過有G6、G7、G8和G10型感染的情況，其中G6型更為多見［13］。

3.3 新疆地區(qū)羊細(xì)粒棘球蚴不同基因型的感染情況 新疆牧區(qū)是棘球絳蟲的流行區(qū)，存在細(xì)粒棘球絳蟲、多房棘球絳蟲、石渠棘球絳蟲三種蟲體，其中細(xì)粒棘球絳蟲最為廣泛，有G1、G3 與G6基因型的分布。丁繁萍等［14］對(duì)新疆南疆地區(qū)某羊場的患病羊只進(jìn)行研究，確定該羊場患病羊只為細(xì)粒棘球蚴G1基因型和細(xì)頸囊尾蚴的混合感染；郭璐等［15］對(duì)新疆7個(gè)縣（市）的牛、羊細(xì)粒棘球蚴包囊提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、測序，發(fā)現(xiàn)感染的細(xì)粒棘球蚴基因型為G1、G3型，且感染率存在明顯差異，G1型為99.2%，G3型為0.8%；張亞樓等［16］對(duì)新疆家犬體內(nèi)蟲體的CO1基因序列進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示其中1條家犬的體內(nèi)存在細(xì)粒棘球絳蟲G1 型和G6 型混合感染，其余所有感染犬體內(nèi)成蟲的基因型均為G1 型。綜上可知，目前新疆地區(qū)存在G1、G3 和G6 型細(xì)粒棘球蚴感染的情況，且G1型為主要感染亞型。

本研究中，肝臟上的細(xì)粒棘球蚴Gxjy與肺臟上的細(xì)粒棘球蚴Fxjy 同為細(xì)粒棘球絳蟲G1（羊）株，且Gxjy 與參考株——法國JN604111.1（狼）、阿爾及利亞DQ341530.1（綿羊）、中國JQ317989.1（羊）、阿根廷KC579443.1（羊）、突尼斯KU169241.1（狗）、伊朗KF731935.1（山羊）、德國GQ358013.1（馬）均位于同一進(jìn)化分支上，與參考株GQ358013.1 的核苷酸同源性高達(dá)100%，與其他核苷酸的同源性也較高（98.1%～99.3%），說明群體間遺傳分化很小。

3.4 疫苗對(duì)羊細(xì)粒棘球蚴防控的影響 目前，包蟲病疫苗對(duì)羊的棘球蚴感染具有很好的免疫保護(hù)效果。王進(jìn)香等［17］應(yīng)用Eg95 疫苗在寧夏部分規(guī)模養(yǎng)殖場進(jìn)行羊棘球蚴病的免疫評(píng)估試驗(yàn)，結(jié)果顯示：免疫前抗體陽性率為36.0%，二免后抗體陽性率達(dá)到82.06%；范才良等［18］用Eg95疫苗對(duì)試驗(yàn)羊進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)，結(jié)果表明羊包蟲病基因工程亞單位疫苗（Eg95）對(duì)羊源棘球蚴病具有良好的預(yù)防作用，且羊免疫接種后未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。因此，注射羊包蟲病基因工程亞單位疫苗（Eg95）對(duì)羊包蟲病的有效防控具有重要作用。