基于腸道菌群探討氣陰兩虛證糖尿病腎臟疾病動物模型

陳鵬德,姚 藍*,郭 鳳,韓 雪,張文祥,韓 榮

1新疆醫科大學中醫學院;2新疆醫科大學教務科,烏魯木齊 830054

目前多數學者認為糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)氣陰兩虛為DKD的基本病因病機,其病變是由消渴的陰虛燥熱為基礎演變而成,其中氣陰兩虛為最根本的條件,貫穿于DKD病程始終[1]。本論文以氣陰兩虛證作為DKD基本病機,應用高脂飼料喂養及小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射建立糖尿病腎臟疾病模型組大鼠模型基礎上,采用青皮、枳實、附子灌胃的方法(青皮、枳實有疏肝破氣之功,過用該藥可使正氣耗散;附子入腎經,大熱,過用可耗傷腎陰)探討DN氣陰兩虛證病證結合動物模型建立及考察指標[2]。

臨床研究表明,氣陰兩虛會導致DN患者機體免疫力衰退[3],免疫球蛋白G(human immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(human immunoglobulin M,IgM)濃度的變化可以反映大鼠機體免疫力的情況。cAMP、cGMP與機體神經內分泌系統的功能有關[4],有學者研究當患者出現陰陽失衡、陰液流失處于陰虛內熱的虛熱狀態時,環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)、環磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)、cAMP/cGMP比值會出現異常[5]。氣虛同樣和患者的能量代謝有關,鈉鉀泵酶(Sodium potassium pump enzyme,Na+/K+-ATP)、鈣鎂泵酶(calcium magnesium pump enzyme,Ca2+/Mg2+-ATP)是和能量代謝有關的酶,它可將三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)分解為二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)并釋放能量[6]。糖尿病腎病檢驗中尿蛋白是判斷患者身體健康狀況的重要檢驗指標,借助尿蛋白區分糖尿病腎病的差異性,為其診治提供科學參考依據[7]。

研究表明,腸道菌群紊亂與DKD的發生有關,腸道微生物可以調節DKD小鼠模型腎功能[8]。DKD患者腎小球濾過率下降,尿酸、草酸鹽等大量代謝廢物聚集于結腸,腸道環境變化,導致腸道菌群失調,研究表明DKD患者腸道中有益菌減少,致病菌增加,導致炎性因子在機體循環中大量增加,加劇腎的炎性損傷[9]。目前對于DKD中醫藥研究多采用西醫DKD模型,缺乏與糖尿病腎臟疾病該領域的研究受到了一定程度的限制。因此,如何建立病證結合動物模型已經成為中醫科研動物模型研究中的熱點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

實驗采用30只健康6周齡雄性SPF級Wistar大鼠,體重200～220 g,購自新疆醫科大學動物實驗中心(SCXK(新)2018-0002),飼養于新疆醫科大學SPF級動物實驗中心(SYXK(新)2018-0003),室溫20～23 ℃,相對濕度50%～60%,所有實驗方案取得新疆醫科大學實驗動物倫理委員會批準(IACUC-20210303-19),遵從3R原則。

1.1.2 飼料和藥材

高糖高脂飼料購自北京博愛港生物技術有限公司(飼料配比為基礎飼料52.6%,豬油10%,蔗糖13%,蛋黃粉15%,酪蛋白5%,膽固醇1.2%,膽酸鹽0.2%,維生素混合物0.5%,麥芽糊精1.5%,礦物混合物1%)、青皮(新疆和濟中藥飲片有限公司,產地湖北,批號:163301-01)、附子(黃岡金貴中藥產業發展有限公司,產地:四川,批號:D5120601)、枳實(新疆和濟中藥飲片有限公司,產地江西,批號:174301-02)。青皮、附子、枳實湯劑采用水煮傳統工藝,加入5倍量的水,煎煮1 h,過濾后,濃縮至0.5 g/mL,放置于4 ℃冰箱中以備用。

1.1.3 主要的試劑及儀器

鏈脲佐菌素(Meilunbio,貨號:MB-1227-1);糞便DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:Cat#D2700);毒蕈堿型膽堿受體M3(muscarinic type choline receptor M3,M3R)(北京博奧森生物有限公司,批號:bs-1289R);5-羥色胺受體3A(5-hydroxytryptamine receptor 3A,5-HT3A)(北京博奧森生物有限公司,批號:bs-12051R);腫瘤壞死因子-α(tunor necrosis factor-α,TNF-α)(Affinity Bioscience,批號:AF8410);白介素-6(Interleukin-6,IL-6)(Affinity Bioscience,批號:AF6087);熒光定量PCR儀(美國ABI applied biosystems 7500 fast System)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及造模

選擇30只200 g左右的雄性Wistar大鼠,將這30只Wistar大鼠隨機分為正常組(normal,Nor)(10只)、模型組(20只)。正常組喂養普通飼料,模型組繼續喂養高糖高脂飼料,4周后,對模型組大鼠腹腔注射STZ(25 mg/kg),一周后進行血糖檢測,篩選血糖大于16.7 mmol/mL的大鼠,得到符合條件糖尿病模型大鼠。待糖尿病大鼠24 h尿蛋白值顯著高于非糖尿病的大鼠,提示具備腎功能損傷,具備DN的基本特征。在第5周后,把糖尿病大鼠按照24 h尿蛋白值>20 mg,分配到糖尿病腎病疾病模型組(DKD)(10只)、氣陰兩虛病證結合模型組(model,Mod)(10只),并且兩組在血糖、24 h尿蛋白值等指標無顯著性差異,隨后對氣陰兩虛病證結合模型組大鼠按6∶5∶6用青皮、附子、枳實湯劑再灌服8周時間[10],按照13 g/kg的體質量給藥(正常組、糖尿病腎臟疾病模型組以等體積的生理鹽水灌胃)。實驗期間對兩組模型組大鼠均高糖高脂飼料喂養,8周后,禁食不禁水12 h,2.5﹪的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉處理動物。

1.2.2 對血清中IgG、IgM、cAMP、cGMP含量的測定及cAMP/cGMP的計算

實驗結束后,對大鼠采用腹主動脈取血,離心后得到血清,采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清中IgG、IgM、cAMP、cGMP,并計算cAMP/cGMP值。

1.2.3 對腎臟組織中Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量測定

實驗結束后,取腎臟組織加入玻璃勻漿器中勻漿,5 000 r/min離心15 min,取上清液,具體方法參考ELISA說明書。

1.2.4 對24 h尿蛋白(24 h-Pro)的測定

實驗結束前最后一天,選取每組大鼠,放入代謝籠收集24 h尿液,統計各組大鼠尿量,放入-80 ℃冰箱保存。ELISA試劑盒測定各組大鼠尿液的尿蛋白濃度,計算24 h-Pro的值。

1.2.5 腎臟組織、結腸組織病理觀察

實驗結束后,取左腎、結腸將其固定在4%的多聚甲醛溶液中,HE染色。

1.2.6 Western blot

實驗結束后,分別取凍存的腎臟組織、結腸組織50 mg在研磨儀進行研磨,隨后加入RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白。采用10%分離膠對各組蛋白進行電泳分離和轉膜,5%牛奶封閉2 h,4 ℃一抗孵育過夜,二抗室溫孵育2 h。采用化學發光法在Azure Biosystems多功能分子成像系統統下曝光成像,ImageJ軟件進行目標蛋白灰度值分析。

1.2.7 腸道菌的分析

在處理動物之前,采用無菌的5 mL凍存管收集糞便,保存于-80 ℃冰箱。用試劑盒所述的方法提取DNA,用普通PCR擴增回收,隨后在熒光定量PCR儀上進行擴增,擴增條件是:預變性95 ℃,10 min;循環(40次)95 ℃;解曲線60 ℃ →95 ℃。對腸道菌群進行qPCR檢測(見表1),進行標準曲線構建。PCR數據分析參考文獻[11]進行。

表1 檢測腸道菌的相關PCR序列Table 1 Related PCR sequences for detecting intestinal bacteria

1.2.8 統計分析

2 實驗結果

2.1 對血清中IgG、IgM、cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP的測定結果

結果顯示(見表2),與Nor比較,DKD和Mod的IgG、IgM含量顯著下降(P<0.05),cAMP的含量顯著升高(P<0.05),cAMP/cGMP的比值顯著升高。與DKD比較,Mod的IgM含量顯著下降(P<0.05),cAMP的含量,cAMP/cGMP的比值顯著升高(P<0.05)。

表2 血清中的IgG、IgM、cAMP、cGMP的含量Table 2 Content of IgG,IgM,cAMP and cGMP in

2.2 對腎臟組織中Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量測定結果

結果顯示(見表3),與Nor相比,DKD和Mod的Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量顯著降低(P<0.05),與DKD比較,Mod的Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量也顯著降低(P<0.05)。

表3 腎臟組織中的Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的含量Table 3 Content of Na+/K+ -ATPase and Ca+-Mg2+-ATPase in kidney

2.3 對24 h尿蛋白(24 h-Pro)的測定

結果顯示(見表4),與Nor相比,DKD和Mod的尿蛋白含量、尿量、24 h-Pro量顯著升高(P<0.01),DKD和Mod沒有顯著性差異。24 h-Pro量顯著增加,提示腎功能可能出現了損傷。

表4 尿蛋白含量、體積、24 h尿蛋白測定結果Table 4 Urine protein content,volume and 24 h-Pro were

2.4 腎臟組織、結腸組織病理觀察

通過對大鼠腎臟HE結果觀察,與nor相比,DKD和Mod的大鼠腎小球系膜基質增生,少量腎小管擴張,上皮細胞水腫,出現大量的炎性浸潤,Mod的腎小球系膜基質增生,炎性浸潤更加顯著(見圖1)。

圖1 大鼠腎臟組織的HE結果Fig.1 HE results of rat kidneys tissue 注:與Nor比較,*P<0.05,**P<0.01;與DKD比較,#P<0.05,下同。Note:Compared with Nor, *P <0.05,**P <0.01;Compared with DKD, #P <0.05,the same below.

通過對大鼠結腸HE結果觀察,與Nor相比,DKD和Mod的大鼠杯狀細胞數量、黏液厚度、腸壁厚度明顯減少,絨毛高度也明顯降低,且有炎性細胞侵入,Mod的大鼠杯狀細胞數量、腸壁厚度明顯、絨毛高度減少更加顯著(見圖2)。

2.5 大鼠腎臟IL-6、TNF-α的表達

結果顯示,大鼠腎臟,與Nor相比,DKD和Mod的IL-6,TNF-α的表達量都升高(P<0.05),Mod的IL-6蛋白表達比DKD增加顯著(P<0.05)(見圖3)。

圖3 鼠腎臟IL-6、TNF-α蛋白的表達Fig.3 Expression of IL-6 and TNF-α proteins in rat

2.6 大鼠結腸腸道屏障蛋白及IL-6、TNF-α的表達

WB檢測結腸組織的蛋白顯示(見圖4),與Nor相比,DKD和Mod的M3R、5-HT3A、Occludin、ZO-1蛋白的表達量都顯著降低(P<0.05),IL-6、TNF-α的表達量都顯著增加(P<0.05);與DKD相比,Mod的5-HT3A、Occludin、ZO-1的表達量降低顯著(P<0.05),TNF-α表達量顯著增加(P<0.05)。

圖4 大鼠結腸腸道屏障蛋白及IL-6、TNF-α蛋白的表達Fig.4 Expression of intestinal barrier protein,IL-6,TNF-α protein in rat

2.7 腸道菌的分析結果

主成分分析(PCA)結果顯示,以可視化三組之間糞便微生物群的差異(見圖5;PC1和PC2分別為63.3%和16.3%)。在不同組中腸道菌的相對變化的也有不同的變化,Mod的含量變化明顯高于其他兩組的含量變化,與Nor相比,DKD和Mod的乳酸桿菌屬、擬桿菌門、梭菌屬、雙歧桿菌屬有益菌的含量都顯著減少(P<0.05),而厚壁菌門的量顯著增加,其中擬桿菌/厚壁菌門的比例也顯著降低(P<0.05)(見圖6A),梭桿菌屬、毛螺菌科、腸桿菌,糞腸球菌致病菌的含量都顯著升高(P<0.05)(見圖6B),其中與DKD相比,Mod的乳酸桿菌屬,梭菌屬,雙歧桿菌屬的含量明顯下降(P<0.05),梭桿菌屬、毛螺菌科、糞腸球菌的含量明顯上升(P<0.05)

圖5 腸道菌群PCA圖Fig.5 PCA of intestinal flora

圖6 腸道菌實時熒光定量PCR分析結果Fig.6 Real-time fluorescence quantitative PCR analysis results of intestinal

3 討論與結論

糖尿病在不斷發展進程中,會出現各種不同的并發癥,其中最為常見的就是發展成為DKD。實驗結果顯示,DKD大鼠尿蛋白水平顯著高于Nor,并且DKD的腎臟和結腸的病理損傷明顯區別于Nor大鼠,因此基本成功建立了DKD模型[12]。

腸道菌群與DKD氣陰兩虛的關系成為近年關注熱點之一,認為腸道與腎臟在免疫及炎性反應、腸道黏膜屏障等方面起著至關重要的作用[13]。如果腸道菌群組成、功能改變,會導致腸黏膜損傷,體內毒素轉移至血液,誘發或加重免疫炎癥反應,加快了DKD的進程[14]。對160例氣陰兩虛型糖尿病腎病患者進行研究,臨床試驗表明DKD患者中擬桿菌門、雙歧桿菌、乳酸菌等明顯低于對照組,而腸桿菌、腸球菌、酵母菌、梭桿菌等高于對照組[15]。實驗結果顯示DKD和Mod中擬桿菌門、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭菌屬等有益菌含量降低,梭桿菌屬、毛螺菌科、腸桿菌、糞腸球菌等致病菌含量增加,結果與以前的研究基本一致[16]。同時發現區別于DKD,在Mod中厚壁菌門、梭桿菌、毛螺菌、糞腸球菌的量明顯升高,乳酸桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬的量明顯下降,提示這些菌屬可能與氣陰兩虛病證密切相關。

腸道菌紊亂會導致腸道的內毒素合成增加、炎癥反應加劇,腸道屏障破壞,有害物質發生轉移,進而導致腎臟炎癥的不斷加劇,加快DKD的進程[17]。實驗結果顯示,腎臟和結腸的Mod的IL-6、TNF-α蛋白表達明顯升高,也證明了這一結論。Occludin、ZO-1蛋白與腸道組織緊密連接狀態相關[18]。M3R也可以通過誘導腸道細胞因子起到保護腸道黏膜穩態的作用[19],5-HT3A可以通過免疫系統細胞的表達,保護腸道免疫系統[20]。結腸組織中相比Nor,Mod的M3R、5-HT3A、Occludin、ZO-1蛋白表達顯著降低,說明腸道屏障的穩態可能發生了紊亂,這可能是有益菌和致病菌的含量變化所引起,最終導致DKD氣陰兩虛病證的產生。

氣虛的產生是機體元氣不足引起,氣有的推動、固攝、運化、溫煦等功能,氣不足則可能導致臟腑機能減退,臨床研究表明,糖尿病腎病患者的尿微量白蛋白、免疫球蛋白G的含量均顯著低于健康患者組[21],實驗結果中Mod的IgG、IgM蛋白濃度顯著降低,說明Mod大鼠機體免疫力下降;對172例DN患者的研究中,發現cAMP水平與糖尿病腎病患者腎損傷程度呈正相關性[22]。實驗中得到相比Nor,Mod的cAMP的含量顯著升高,cAMP/cGMP的比值顯著升高,cAMP/cGMP比值出現異常偏高或偏低,cAMP 含量升高時,大量酪氨酸羥化酶會被激活,產生大量多巴胺作用于神經系統,對人的情緒產生影響,導致人的興奮程度增強,所以虛熱證多會亢奮[23];研究還發現糖尿病腎病患者的Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯的損害,這就導致細胞結構和功能受損、微循環阻滯、加重腎缺氧缺血,使血管通透性增加,尿蛋白漏出增多引起腎病的進一步發展[24],實驗結果也同樣表明,Mod的腎臟Na+/K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯低于Nor和DKD,慢性的腎臟疾病,由于病程日久導致元氣耗傷,陰液損傷形成了氣陰兩虛證,故氣陰兩虛證糖尿病腎臟疾病會導致機體能量代謝發生紊亂。

綜上所述,通過高糖高脂喂養4周聯合腹腔注射鏈脲佐菌素、附子,青皮,枳實灌胃誘導大鼠8周,可部分形成氣陰兩虛證糖尿病腎臟疾病基本證候特征,大鼠中標志性腸道菌群以及測定指標的差異性,可一定程度反映病證結合模型的基本特征,用于評價氣陰兩虛證糖尿病腎臟疾病模型的特征。