巖藻多糖納米硒的制備及其抑制腫瘤細胞增殖的研究

陳博文,陳建平,2*,黃文浩,鐘賽意,2,李 瑞,2,宋兵兵,2,劉曉菲,2,汪 卓,2

1廣東海洋大學食品科技學院 廣東省水產品加工與安全重點實驗室,湛江 524088;2大連工業大學海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,大連 116034

目前,除心血管疾病外,癌癥已成為第二大人類死亡的誘因,由于其治療難度大、周期長和治療費用高,為人民的生活帶來沉重的負擔[1]。化療是現代西方醫學治療癌癥的主要方法之一,但由于化療藥物往往存在嚴重的副作用和耐藥性等原因,導致治療效果不理想。因此,研發一種廣譜的具有高效無毒副作用的抗腫瘤藥物仍是目前亟待解決的問題。

硒(selenium,Se)是一種人體必需的微量元素,在合成谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶等過程中扮演著重要角色,參與人體的多種生命活動,對人體健康具有重要意義[2]。同時,硒還具有抗氧化、抗腫瘤等多種功能活性[3]。研究發現,腫瘤患者體內硒含量缺乏,攝入足夠的Se 能夠保護正常細胞,減少癌癥的發生[4]。然而,Se在生物體內能夠使用的安全劑量范圍很窄,很容易因使用過量而造成中毒,因此,探究與研發安全的Se形態,降低Se的毒性至關重要[5]。研究發現,與傳統的Se形式相比,納米硒(selenium nanoparticles,SeNPs)由于其獨特的尺寸效應和表面效應具有更低的毒性和較好的生物利用度[6]。然而,SeNPs因其表面缺少鄰近配位的原子導致活性較高,在常溫下極不穩定,易聚集形成毒性更大的單質Se[7,8]。因此,在制備SeNPs的過程中一般會使用分散劑來增加SeNPs的分散性。多糖類分子結構中具有羥基,能通過分子間氫鍵與Se結合,防止SeNPs聚集,因此多糖常被用于分散SeNPs[9]。目前,已經報道的用于納米硒修飾劑的多糖包括黃芪多糖、魔芋葡聚糖等[10,11]。

巖藻多糖(fucoidan,FD)是來源于褐藻的天然水溶性多糖,由硫酸化的巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等單糖組成[12]。研究人員發現,巖藻多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種功能活性[13]。然而,目前還未見巖藻多糖修飾納米硒的相關報道。因此,本文以FD作為穩定劑,通過氧化還原反應制備巖藻多糖納米硒(fucoidan-selenium nanoparticles,FD-SeNPs),利用單因素和響應面實驗優化其制備工藝參數,并進一步對其進行結構鑒定和抑制腫瘤細胞增殖的研究,為FD-SeNPs作為腫瘤細胞抑制劑的開發應用提供理論數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巖藻多糖(來源于墨角藻,批號:F8190,純度為95%)和亞硒酸鈉(批號:S5261,純度≥98%)購于Sigma公司;抗壞血酸(批號:S13001,純度為99%)購于上海源葉生物技術有限公司;胎牛血清(批號:10270-106)、Dulbecco′s modified eagle medium(DMEM)高糖培養基(批號:8123270)、0.25%胰蛋白酶溶液(批號:25200072)和雙抗溶液(批號:15140122)購于美國Gibco公司;二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),(批號:R012316,純度99.17%,上海易恩化學技術有限公司);HepG2人肝癌細胞、A549人肺癌細胞(美國ATCC細胞庫);LO2人正常肝細胞(中國科學院(上海)細胞庫)。

1.2 儀器與設備

Zetasizer Nano ZSE馬爾文納米粒度電位儀(上海馬爾文帕納科公司);Varioskan Flash 全自動酶標儀、Talos F200X G2透射電子顯微鏡(美國Thermo Scientific公司);Bruker Tensor-2傅里葉變換紅外光譜儀(德國 Bruker公司);FD8508真空冷凍干燥機(韓國ILSHIN公司);N-4000旋轉蒸發儀(日本Tokyo Rikakikai公司);Agilent 7500CX電感耦合等離子體質譜儀(美國Agilent公司);蔡司Sigma 300掃描電子顯微鏡、Smartedx能量色散X射線能譜儀(德國Zeiss公司);Rigaku SmartLab 9 kW X射線衍射儀(日本Rigaku理學公司)。

1.3 方法

1.3.1 FD-SeNPs的制備

參考Zhang等[5]的方法制備FD-SeNPs。具體制備過程如下:將一定量的FD溶于蒸餾水中得到不同濃度的FD溶液。將Vc溶液與Na2SeO3溶液加入FD溶液中,Na2SeO3溶液、Vc溶液和FD溶液的體積比為4∶4∶1,在不同溫度下攪拌不同時間后,將反應液經透析袋(截留分子量為8 000～14 000)透析48 h。通過粒徑分析,確定了FD-SeNPs的最佳制備工藝,最終的溶液經旋蒸后凍干,得到FD-SeNPs。

1.3.2 單因素實驗

在FD濃度為0.6 mg/mL、反應溫度為45 ℃和Vc與Na2SeO3摩爾比為8∶1的條件下,采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同時間(1、2、3、4和5 h)對FD-SeNPs粒徑的影響;在FD濃度為0.6 mg/mL、反應時間為2 h和Vc與Na2SeO3摩爾比為8∶1的條件下,采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同溫度(25、35、45、55和65 ℃)對FD-SeNPs粒徑的影響;在FD濃度為0.6 mg/mL、反應溫度為45 ℃和反應時間為2 h的條件下,采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同Vc與Na2SeO3摩爾比(Vc∶Na2SeO3=2∶1、4∶1、8∶1、16∶1、32∶1)對FD-SeNPs粒徑的影響;在反應溫度為45 ℃、反應時間為2 h和Vc與Na2SeO3摩爾比為16∶1的條件下,采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL)的FD對FD-SeNPs粒徑的影響。

1.3.3 響應面實驗

在單因素的基礎上,以巖藻多糖濃度、摩爾比、反應時間和反應溫度為因素,FD-SeNPs的粒徑為評價指標,設計四因素三水平的響應面實驗,響應面實驗因素水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.4 FD-SeNPs的結構鑒定

1.3.4.1 硒含量的測定

參照Chen等[14]的方法進行測定。具體過程如下:凍干的樣品在雙氧水和硝酸的作用下進行微波消解,然后采用電感耦合等離子體質譜儀測定樣品中的硒含量,具體參數如下:入射功率為1 550 W,等離子氣體流量為15 L/min,氦流量為4.0 mL/min,霧化室溫度為2 ℃。

1.3.4.2 粒徑及電位的測定

采用馬爾文納米粒度電位儀對樣品的粒徑及電位進行檢測。具體過程如下:取適量透析后的反應液置于樣品池中,在檢測溫度為25 ℃,平衡時間為120 s的條件下進行檢測。

1.3.4.3 掃描電子顯微鏡及能量色散X射線譜儀測定

取少量樣品置于導電膠上固定,經噴金處理后,在掃描電子顯微鏡中進行不同放大倍數觀察,并使用Smartedx能量色散X射線譜儀對樣品的表面元素進行分析。

1.3.4.4 透射電子顯微鏡測定

采用透射電子顯微鏡觀察樣品的形態大小。將樣品溶液滴入銅膜網格上,用去離子水洗滌,待干燥后,觀察其形態。

1.3.4.5 傅里葉變換紅外光譜儀測定

將溴化鉀置于紅外燈下干燥4 h,然后將溴化鉀與樣品以100∶1的比例進行研磨,混合均勻后,在油壓機上進行壓片,在4 000～400 cm-1的波數下對樣品進行掃描。

1.3.4.6 X射線衍射儀測定

取適量樣品裝進樣品池,采用銅靶作為測試靶材,設定X射線衍射儀的波長為0.154 nm,電壓40 kV,電流40 mA,掃描范圍為5°～90°,掃描速度為5°/min對樣品進行測量。

1.3.5 FD-SeNPs抑制腫瘤細胞增殖的活性測定

1.3.5.1 細胞培養

將復蘇后的A549細胞、HepG2細胞和LO2細胞置于含10%胎牛血清和1%雙抗溶液的DMEM高糖完全培養基中,然后放置在5% CO2、37 ℃的培養箱中培養,經換液、傳代穩定后,取對數生長期細胞用于MTT實驗。

1.3.5.2 FD-SeNPs對HepG2細胞和A549細胞存活率的影響

將細胞密度為4 × 104個/mL的細胞懸液接種于96孔板,每孔100 μL,并將其放入37 ℃、濃度5%的CO2培養箱中培養24 h。實驗組中往96孔板加入不同濃度(250、500 μg/mL)的SeNPs、FD和FD-SeNPs溶液,每孔100 μL。而空白組和對照組中每孔分別加入100 μL高糖DMEM培養基和100 μL的細胞懸液。經不同方式處理的細胞繼續放入培養箱中培養48 h后,加入20 μL MTT(5 mg/mL) 避光孵育4 h,去除上清液,加入150 μL DMSO,震蕩10 min后,在570 nm處用酶標儀測樣品的OD值。設陰性對照組的OD值為100 %,計算公式如下:

細胞存活率=

(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%

1.3.6 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 制備FD-SeNPs的單因素實驗

固定FD濃度為0.6 mg/mL,反應溫度為45 ℃,Vc與Na2SeO3摩爾比為8∶1,考察反應時間對FD-SeNPs粒徑的影響,實驗結果如圖1A所示。由圖1A可知,當反應時間為2 h時,FD-SeNPs的粒徑最小。進一步延長反應時間,FD-SeNPs粒徑反而增大,這可能是由于SeNPs的聚集導致粒徑增大,故選擇2 h作為最佳的反應時間。固定FD濃度為0.6 mg/mL,反應時間為2 h,Vc與Na2SeO3摩爾比為8∶1,考察反應溫度對FD-SeNPs粒徑的影響,實驗結果如圖1B所示。由圖1B可知,當反應溫度從25 ℃升高到45 ℃時,FD-SeNPs粒徑呈逐漸下降的趨勢,隨后,進一步提高溫度到55 ℃和65 ℃時,其粒徑呈上升趨勢,這可能是溫度過高導致體系中粒子運動加快,使產物更易聚集和沉淀,從而使粒徑變大,該結果與Song等[15]的研究結果一致。因此,選擇45 ℃作為最佳反應溫度。固定FD濃度為0.6 mg/mL,反應溫度為45 ℃,反應時間為2 h,考察Vc與Na2SeO3的摩爾比對FD-SeNPs粒徑的影響,實驗結果如圖1C所示。由圖1C可知,當摩爾比從2∶1增加到16∶1時,FD-SeNPs的粒徑呈逐漸下降趨勢,這可能是一定范圍內過量Vc可以增加反應的接觸面積,加快反應速度,從而形成較小尺寸的納米顆粒[16]。然而,當進一步增加摩爾比,其粒徑顯著增大,這可能是過量的Vc附著在SeNPs表面,導致SeNPs互相集聚,從而使粒徑增大,故選擇16∶1作為最佳反應摩爾比。固定反應溫度為45 ℃,反應時間為2 h,摩爾比為16∶1,考察FD濃度對FD-SeNPs粒徑的影響,實驗結果如圖1D所示,當FD濃度從0.2 mg/mL 增加至0.6 mg/mL時,FD-SeNPs的粒徑呈逐漸下降趨勢,但當FD濃度大于0.6 mg/mL時,體系中的納米硒的粒徑會顯著增大,這可能是過量的FD集聚在納米硒表面,導致其顆粒尺寸變大[17]。因此,選擇0.6 mg/mL的FD作為最佳制備濃度。根據上述單因素實驗得到最佳的制備工藝參數為反應時間為2 h、反應溫度為45 ℃、反應摩爾比為16∶1和FD濃度為0.6 mg/mL。

圖1 不同反應條件對FD-SeNPs粒徑的影響Fig.1 Effect of different reaction conditions on particle size of FD-SeNPs注:不同字母代表差異顯著(P<0.05)。Note:Different letters represent significant differences (P<0.05).

2.2 制備FD-SeNPs的響應面實驗

2.2.1 響應面實驗方差分析

根據表1開展實驗,得到響應面結果如表2所示。利用Design Expert 13軟件對表2結果進行回歸分析,建立了FD-SeNPs粒徑(Y)與巖藻多糖濃度(A)、反應溫度(B)、反應時間(C)、摩爾比(D)與的二次回歸方程:Y=93.65+0.085A+6.50B+6.86C+3.94D-1.75AB+6.73AC-3.50AD-4.92BC+0.095BD-4.71CD-0.4452A2+0.7048B2+7.59C2+8.54D2。方差分析結果顯示,實驗模型顯著,失擬項不顯著,因素B、C、D的P<0.01,表明反應溫度、反應時間、摩爾比對粒徑的影響較顯著,各因素對粒徑的影響順序為反應溫度、反應時間>摩爾比>FD濃度。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

2.2.2 各因素響應面圖分析

各因素交互作用結果如圖2所示,反應時間與FD濃度對粒徑交互影響中,在濃度一定時,響應面圖中的粒徑隨著時間的增大而先減小后增大,當反應時間一定時,粒徑隨著FD濃度的增大而減小;在反應溫度或時間一定的條件下,粒徑隨著另一個因素的增大而增大;在反應時間與摩爾比對粒徑的交互影響中,在反應時間一定的條件下,粒徑隨著摩爾比的增大先減小后增大,當摩爾比一定時,粒徑隨著時間的增大而增大。各因素間的等高線圖趨向橢圓,表明因素間的交互影響較大。分析響應面實驗結果可知,FD-SeNPs的最佳工藝參數如下:反應溫度為35 ℃、反應時間為1 h、抗壞血酸與亞硒酸鈉的摩爾比為13.64∶1、FD濃度為0.8 mg/mL,此時的粒徑的理論值為77.58 nm。

圖2 不同因素間交互作用對FD-SeNPs粒徑影響的響應面圖與等高線圖Fig.2 Response surface and contour diagrams of the effects of interactions between different factors on the particle size of FD-SeNPs

2.2.3 驗證實驗

為了實際實驗的可操作性,設置反應溫度為35 ℃、反應時間為1 h、抗壞血酸與亞硒酸鈉的摩爾比為14∶1、FD濃度為0.8 mg/mL,在此條件下進行三次平行實驗,結果顯示FD-SeNPs粒徑為(83.40 ±0.55)nm,該值與理論預測值(77.58 nm)接近,表明建立的該響應面模型能較好地優化各因素對其粒徑的影響。在此條件下,制備得到的FD-SeNPs電位為(-31.89 ± 0.47)mV,經ICP-MS檢測硒含量為29.93%,該結果相比Jiao等[10]得到的黃芪多糖納米硒復合物中的硒含量更高。

2.3 FD-SeNPs的結構表征

2.3.1 FD-SeNPs的粒徑與電位分布

FD-SeNPs和SeNPs的粒徑與電位分布如圖3所示。由圖3A可知,SeNPs的粒徑分布出現在68～142 nm和255～712 nm范圍內,說明其粒徑大小分布較寬且不均一。而FD-SeNPs的粒徑分布只在44～190 nm出現,說明其粒徑分布比較集中且大小比較均一。同時,SeNPs的平均粒徑為848.90 nm,經過FD修飾之后,SeNPs的平均粒徑從848.90 nm降低到83.45 nm,表明FD能夠阻止SeNPs的聚集從而降低其粒徑。而且,FD-SeNPs的電位(-32.80 mV)絕對值大于SeNPs的電位(-24.40 mV)絕對值(見圖3B),表明FD修飾SeNPs后能顯著提高SeNPs的穩定性。

圖3 FD-SeNPs和SeNPs的粒徑(A)與電位(B)分布圖Fig.3 Particle size(A) and Zeta potential(B) distributions of FD-SeNPs and SeNPs

2.3.2 SEM分析FD-SeNPs的表面形貌

采用SEM對FD-SeNPs的表面形貌進行分析,實驗結果如圖4所示。由圖4A可知,SeNPs呈現不規則的棒狀聚集體,表明SeNPs易聚集,分散性差,與Mu[8]報道的結果相符。而FD呈現出表面疏松的片狀結構(見圖4B),經FD修飾SeNPs之后呈現出單個完整分散的球形納米粒(見圖4C),表明FD能夠有效阻止SeNPs聚集。

圖4 SeNPs(A)、FD(B) 和FD-SeNPs(C)的掃描電鏡圖Fig.4 SEM photographs of SeNPs(A),FD(B) and FD-SeNPs(C)

2.3.3 TEM分析FD-SeNPs的微觀形態

采用TEM對FD-SeNPs的微觀形態進行分析,實驗結果如圖5所示。由圖5A可知,SeNPs呈現不規則的棒條狀結構,且粒子之間相互黏連,這與SEM的實驗結果(見圖4A)相一致。而FD呈現出不規則的片狀結構(見圖5B)。SeNPs經FD修飾后呈現出分散性較好的均一球形顆粒(見圖5C),表明FD的加入能阻止SeNPs聚集并提高其分散性。

圖5 SeNPs(A)、FD(B)和FD-SeNPs(C)的透射電鏡圖Fig.5 TEM photographs of SeNPs(A),FD(B) and FD-SeNPs(C)

2.3.4 FD-SeNPs的表面元素分析

對FD-SeNPs的表面元素進行分析,實驗結果如圖6所示。由圖6A可知,SeNPs中C、O和Se百分比分別為8.52%、0.43%和90.99%。FD-SeNPs中C、O和Se元素百分比分別為17.70%、3.41%和77.59%(見圖6B),表明添加FD修飾SeNPs之后升高了C和O元素的百分比,進一步證實了FD成功地結合在SeNPs的表面上[18]。

圖6 SeNPs(A)和FD-SeNPs(B)的元素分析Fig.6 EDX spectra of SeNPs(A) and FD-SeNPs(B)

2.3.5 FT-IR分析FD與SeNPs的結合形式

由圖7可知,FD在3450 cm-1處出現了羥基O-H的伸縮振動峰,在1 637和1 394 cm-1附近出現了羰基C=O和羧基COO-的伸縮振動峰,表明FD存在糖醛酸[14,19]。在1 254、842和581 cm-1附近分別出現了S=O的伸縮振動峰、C-4軸向位置硫酸鹽引起的特征吸收峰和O=S=O的彎曲振動峰,表明FD含有硫酸基團[20-22]。FD-SeNPs在3 418、1 614、1 393、1 225、824和587 cm-1出現了與FD相似的吸收峰,表明FD與SeNPs之間沒有形成新的共價鍵。然而,FD-SeNPs中有部分峰出現了紅移,O-H的伸縮振動峰從3 450 cm-1移至3 418 cm-1,推測FD的O-H通過共軛效應與硒結合,穩定分散納米硒。

圖7 SeNPs、FD和FD-SeNPs的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.7 FT-IR diagrams of SeNPs,FD and FD-SeNPs

2.3.6 XRD分析FD-SeNPs的晶型

X射線衍射峰的強度和銳度可在一定程度上反映樣品的結晶性質,因此在紅外光譜的基礎上,進一步采用XRD表征FD-SeNPs的形成,實驗結果由圖8所示。由圖8可知,SeNPs的X射線衍射圖在20～40°和40～60°的范圍內出現兩個峰形較寬的衍射峰,表明SeNPs以無定形的形式存在,這結果與Chen等[14]的研究結果一致。同時,FD在15～30°范圍內出現一個寬的衍射峰,表明FD也是無定形結構,這與其他植物多糖的研究結果一致[23]。而FD-SeNPs的峰形與FD類似,說明FD-SeNPs也主要以無定形的形式存在,但是相比FD和SeNPs,其衍射峰的位置和強度都發生了變化,這表明FD與SeNPs結合后形成了FD-SeNPs。

圖8 FD-SeNPs、SeNPs、FD的X射線衍射圖Fig.8 X-ray diffraction patterns of FD-SeNPs,SeNPs and FD

2.4 FD-SeNPs的體外抗腫瘤活性測定

采用MTT法考察不同濃度的FD、SeNPs和FD-SeNPs對HepG2細胞和A549細胞存活率的影響,以LO2正常肝細胞做對照,實驗結果如圖9所示。由圖9A和9B可知,在250～500 μg/mL范圍內,SeNPs抑制A549細胞和HepG2細胞增殖的效果不佳。然而,FD-SeNPs能夠顯著抑制A549細胞和HepG2細胞的增殖。當FD-SeNPs濃度為500 μg/mL時,A549細胞和HepG2細胞的存活率分別從對照組的100%降低為(46.91 ± 1.41)%和(27.53 ± 2.77)%。上述結果表明,FD修飾SeNPs之后能夠顯著提高SeNPs的抗腫瘤活性。同時,FD-SeNPs對LO2正常肝細胞的存活率為(71.00 ± 3.16)%,顯著高于腫瘤細胞的存活率(見圖9C),說明FD-SeNPs具有較好的細胞選擇性。

圖9 不同濃度FD、SeNPs和FD-SeNPs對不同細胞存活率的影響Fig.9 Effects of different concentrations of FD,SeNPs and FD-SeNPs on the cell viability of different cells注:不同字母代表差異顯著(P<0.05)Note:Different letters represent significant differences (P<0.05)

3 討論與結論

本文通過單因素和響應面優化實驗得到了FD-SeNPs的最佳制備工藝參數為反應溫度為35 ℃、反應時間為1 h、抗壞血酸與亞硒酸鈉的摩爾比為14∶1、FD濃度為0.8 mg/mL,在此條件下,測得其粒徑最小為(83.40±0.55)nm,電位為(-31.89±0.47)mV,硒含量達29.93%。進一步對其結構進行鑒定發現,FD通過羥基吸附在SeNPs表面形成均一球形的納米粒子,說明多糖的極性基團可以有效的抑制SeNPs的聚集[17,24]。

目前研究發現的抗腫瘤機理主要包括抑制腫瘤細胞生長、抑制腫瘤細胞轉移或侵襲、增強機體的免疫調節能力等途徑實現抗腫瘤作用[25,26]。研究表明,以多糖為模板的SeNPs能夠促進相關凋亡蛋白和自噬標志性蛋白的表達,從而誘導腫瘤細胞凋亡和自噬[27]。本研究的體外抗腫瘤實驗發現,FD修飾SeNPs能顯著提高SeNPs抑制腫瘤細胞增殖的能力,且具有較好的細胞選擇性,但其具體作用機理有待深入研究。