渝產不同品系藥用菊花品質的研究

丁 剛,努爾·艾力,李隆云*,崔廣林

1重慶市中藥研究院;2重慶市中藥良種選育與評價工程技術研究中心;3重慶市中藥資源學重點實驗室;4中國中醫科學院中藥資源中心重慶分中心,重慶400065;5重慶醫科大學中醫藥學院,重慶 400016

菊花為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序,其味甘、苦,微寒,歸肺、肝經,具有疏散風熱、清肝明目、清熱解毒、平抑肝陽的作用[1]。菊花中的黃酮類和苯丙素類成分是菊花的主要藥效成分[2],其具有抗過敏、抑制腫瘤、抗心腦脂質過氧化、抗菌、抗病毒以及清除自由基等廣泛藥理活性[3],目前臨床多用于風熱感冒、眩暈、目赤昏花等病癥的治療[4,5]。

菊花作為一大宗藥材其品種眾多,《中華人民共和國藥典》(2020年版)收載了“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”“懷菊”五大品種[1],此外市場上還有祁菊、川菊、濟菊等品種[6]。現代研究表明不同品種菊花的生物學形態有所不同,其多種有機酸類、黃酮類等成分含量亦存在明顯差異[7]。一般傳統選育工作重點考慮菊花的花序大小、花盤直徑、花瓣數目、香味、花色、分支、葉形和株高等植物學性狀,同時注重培育和固定其顯著的性狀特點[8],但有效成分考察較少。菊花品質不僅其生態特征有關,而且與微量元素、黃酮類、酚類、揮發油等指標息息相關[9]。

一測多評法(quantitative analysis of multi-components by single-marker,QAMS)是指以質量穩定、對照品易獲得、臨床藥效確切的組分作為內標物,計算其含量和其他組分與此組分之間的相對校正因子,利用藥物各組分之間的內在函數關系,從而實現快速測定多種化學成分含量的一種定量測定方法。有研究表明一測多評法用于菊花中化學成分的含量測定,高效、便捷、準確可行,其結果與外標法無顯著差異,可以同時測定菊花中多種化學成分的含量[10]。

本文以杭白菊、小洋菊、懷菊、小黃菊及陽菊品系和云陽當地品系多種不同形態特征的藥用菊花為研究對象,測定不同形態特征菊花的黃酮和有機酸類成分的含量,同時測定水分、總灰分,較全面研究單株菊花不同形態特征和多種藥效成分的內在聯系。本研究采用聚類分析和主成分分析法,制定菊花品質綜合評定方法,在重慶地區能夠正常生產的品種基礎上,比較菊花質量的優劣,最終選出品質優良的單株,為下一步擴繁及區域試驗提供基礎,旨在為渝產藥用菊花品種選育及評價菊花品質提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀、DAD檢測器(美國Agilent公司);Milli-Q Integral 5型純水儀(美國Millipoer公司);SGM.M8/13人工智能箱式電阻爐(中國洛陽西格馬爐業股份有限公司);BSA 124(S型電子天平(美國Millipoer公司);XMTB數顯式電熱恒溫水浴鍋(中國上海躍進醫療器械有限公司);KQ(250 DB型數控超聲波清洗儀(德國Sartorius);G2X(9240 MBE電熱鼓風干燥箱(中國上海博訊實業有限公司醫療設備廠)。

1.2 試藥與樣品

試劑:色譜純甲醇、磷酸、乙腈(美國TEDIA公司);分析純甲醇(重慶川東化工有限公司);超純水用Milli-Q Integral 5型純水儀制備。

對照品:木犀草素(批號LOT-C29N10Q104574,純度≥98.92%,源葉生物科技有限公司);異綠原酸C(批號LOT-J23GB152513純度≥98.92%,源葉生物科技有限公司);木犀草苷(批號LOT-O20GB164741,純度≥99.8%,源葉生物科技有限公司);金合歡素(批號MUST-19081008,純度≥99.07%,成都曼思特生物科技有限公司);綠原酸(批號MUST-19030620,純度≥99.39%,成都曼思特生物科技有限公司);大波斯菊苷(批號MUST-19081101,純度≥9987%,成都曼思特生物科技有限公司);新綠原酸(批號MUST-19031001,純度≥99.67%,成都曼思特生物科技有限公司);異綠原酸B(批號MUST-19031602,純度≥99.05%,成都曼思特生物科技有限公司);隱綠原酸(批號MUST-19032403,純度≥99.07%,成都曼思特生物科技有限公司);異綠原酸A(MUST-21102611,純度≥98.46%,成都曼思特生物科技有限公司)。

樣品:根據植株形態、花色、成熟度,采集重慶產杭白菊、小洋菊、陽菊、云陽品系,小黃菊和懷菊品系6大類品系,61個具有明顯特征的單株樣品(見圖1)。其中,陽菊和云陽品系是從浙江桐鄉引種培育的品種,亦屬于杭菊;懷菊是從河南焦作引種的品種,其余品系是適合重慶當地種植的品種。以上菊花經李隆云研究員鑒定為菊科植物杭菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘Hangju’ cv.nov.和懷菊Chrysanthemummorifolium(Ramat).Tzvel.‘Huaiju’ cv.nov.的干燥頭狀花序(見表1)。表1中的單株編號中的第一個數字是品系的二級特征分類(見表2),第二個數字是本品系單株的順序標記號。

表1 不同類型菊花樣品來源Table 1 Sources of different Chrysanthemum samples

表2 品系的二級特征Table 2 Secondary feature of strain

圖1 不同品系菊花植物圖Fig.1 C.morifoliu plants of different strains注:A.杭白菊品系;B.懷菊品系;C.小黃菊品系;D.小洋菊品系;E.陽菊品系;F.云陽品系。Note:A.Hangzhou white chrysanthemum strain;B.Huai chrysanthemum strain;C.Xiaohuang chrysanthemum strain;D.Xiaoyang chrysanthemum strain;E.Yang chrysanthemum strain;F.Yunyang chrysanthemumstrain.

1.3 方法

1.3.1 水分、總灰分的檢測

按照2020年版的《中國藥典》第四部通則0832第二法檢測菊花樣品水分含量,不宜超過15%;按照通則2302對菊花樣品總灰分進行檢測。

1.3.2 含量測定

混合對照品的制備:精確稱取木犀草苷、新綠原酸、異綠原酸B、隱綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、木犀草素等對照品,質量分別為3.04、5.00、2.90、5.82、4.42、8.29、4.61、5.39、5.01 mg,置于已編號10 mL的9個容量瓶,金合歡素精確稱取2.24 mg置于25 mL容量瓶,加入70%甲醇水溶液,震搖,溶解,再定容至刻度線,既得單個對照品的儲備母液。分別量取適量母液置10 mL容量配制成木犀草苷60.80 μg/mL、綠原酸19.89 μg/mL、異綠原酸B 8.56 μg/mL、隱綠原酸5.01 μg/mL、新綠原酸1 μg/mL、異綠原A 65.08 μg/mL、大波斯菊苷20.05 μg/mL、金合歡素2.69 μg/mL、木犀草素5.01 μg/mL、異綠原酸C 86.24 μg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備:精密稱取已干燥粉碎的菊花樣品粉末(過30目篩)0.125 g,置于50 mL具塞錐形瓶,加70%甲醇水溶液25 mL,密塞,稱定質量,于60 ℃超聲處理45 min,冷卻至室溫,用溶劑補足失重并搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過既得供試品溶液。

色譜條件:色譜柱:Symmetry?C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm),檢測波長:有機酸類成分檢測波長327 nm,黃酮類成分檢測波長348 nm,柱溫40 ℃,進樣量10 μL,流速1.0 mL·min-1,流動相為乙腈(A)-0.4%磷酸水溶液(B),進行梯度洗脫(0～15 min,10%A→15%A;15～17 min,15%A→20%A;17～35 min,20%A;35～40 min,20%A→30%A;40～45 min,30%A→80%A;45～52 min,80%A),色譜圖見圖2。

圖2 混合對照品(A、C)及樣品(B、D)HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substance (A,C) and sample (B,D) 注:1.新綠原酸;2.綠原酸;3.隱綠原酸;4.木犀草苷;5.異綠原酸B;6.異綠原酸A;7.大波斯菊苷;8.異綠原酸C;9.木犀草素;10.金合歡蘇。Note:1.Neochlorogenic acid;2.Chlorogenic acid;3.Cryptochlorogenic acid;4.Luteolin;5.Isochlorogenic acid B;6.Isochlorogenic acid A;7.Apigenin;8.Isochlorogenic acid C;9.Luteolin;10.Acacetin.

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 線性關系考察

將按照 “1.3.2”的方法配制的對照品溶液,分別進行稀釋,精密吸取10 μL進樣,記錄色譜圖進行分析。以混合對照品的峰面積Y作為縱坐標,其對應的不同進樣濃度X(μg/mL)作為橫坐標,對檢測結果進行回歸處理,分析線性范圍。結果線性良好(見表3)。

表3 菊花10種成分的線性關系和線性范圍Table 3 Linear relationship and linear range of ten chemical component in chrysanthemum

2.1.2 精密度考察

取混合對照品溶液,按照“1.3.2”色譜條件連續進樣6次,記錄色譜圖進行分析。結果異綠原酸A、新綠原酸、異綠原酸B、綠原酸、異綠原酸C、隱綠原酸、金合歡素、大波斯菊苷、木犀草素、木犀草苷峰面積的RSD分別為0.060%、0.64%、0.10%、0.13%、0.070%、0.46%、0.33%、0.20%、1.1%和0.080%,表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩定性考察

取同一供試品溶液,按照“1.3.2”色譜條件,分別0、1、2、4、6、8、16、24 h進樣,記錄色譜圖進行分析。結果異綠原酸A、新綠原酸、異綠原酸B、綠原酸、異綠原酸C、隱綠原酸、金合歡素、大波斯菊苷、木犀草素、木犀草苷峰面積的RSD分別為0.70%、0.53%、0.63%、0.61%、0.67%、0.60%、0.90%、0.70%、0.97%和0.71%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.4 加樣回收率試驗

精密稱取已測定含量的菊花藥材粉末,共6份,適量加入混合對照品溶液,按照供試品制備方法配制,按“2.2.3”色譜條件進行測定分析,計算回收率。結果異綠原酸A、新綠原酸、異綠原酸B、綠原酸、異綠原酸C、隱綠原酸、金合歡素、大波斯菊苷、木犀草素、木犀草苷的平均回收率分別是104.2%、93.01%、111.6%、96.41%、99.40%、97.46%、115.9%、89.67%、99.40%和99.93%,其RSD分別是 1.5%、5.6%、3.5%、1.4%、2.5%、1.8%、2.6%、3.1%、3.6%和6.2%,表明該方法回收率良好。

2.1.5 外標法重復性考察

取同一來源的樣品,按照供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液,進樣測定分析。結果異綠原酸A、新綠原酸、異綠原酸B、綠原酸、異綠原酸C、隱綠原酸、金合歡素、大波斯菊苷、木犀草素、木犀草苷的平均含量依次1.318%、0.030%、0.180%、0.345%、2.092%、0.078%、0.023%、0.387%、0.058%和0.583%,RSD分別為0.52%、1.8%、1.4%、0.39%、1.4%、1.7%、2.7%、0.41%、2.3%和1.0%,表明該方法重現性良好。

2.2 含量測定

本研究運用一測多評HPLC法同時對菊花上述10種化學成分的含量進行檢測。首先,將“1.3.2”制備的一系列梯度濃度的混合對照品容易進樣進行檢測,記錄色譜圖,再保證結果在線性范圍內的前提下,按公式:

以綠原酸為內標物,計算其與其他5個有機酸成分之間的相對校正因子(式中Wk、Am、Wm、Ak分別表示內參物的濃度、組分m的峰面積、組分m的濃度、內參物峰面積);以木犀草苷為內標物,計算其與其他3個黃酮類成分之間的相對校正因子,結果見表4。菊花樣品的綠原酸,木犀草苷含量百分比用線性方程計算,其余成分含量百分比用相對校正因子計算,與外標法(external standard method,ESM)含測結果比較(見表5),一測多評和外標法含量檢測結果基本相同。

表4 成分相對校正因子Table 4 Relative correction factor of component

表5 菊花10種化學成分外標法和一測多評含量測定結果比較Table 5 Comparison of determination results of ten chemical components in chrysanthemum by QAMS and ESM(%)

2.3 一測多評fkm值重現性考察

2.3.1 不同儀器及色譜柱的影響

取“1.3.2” 項下的混合對照品溶液,分別精密吸取10 μL,分別使用三根Symmetry?C18250 mm× 4.6 mm,5 μm 的色譜柱,在Agilent 1260高效液相色譜儀和Agilent 1200高效液相色譜儀上進樣檢測,求算以綠原酸和木犀草苷作為參照成分時,有機酸類和黃酮類8個成分的fkm值1.23、0.88、0.97、0.93、1.17、1.07、2.45和1.05,RSD平均值為3.3%、2.8%、3.2%、3.1%、3.2%、2.5%、3.0%和2.5%。結果說明fkm值在使用同型號儀器和色譜柱時的耐用性良好。

2.3.2 不同流速的影響

用Agilent 1260高效液相色譜儀,分別在0.95、1.00、1.05 mL/min的體積流量下測定,求算以綠原酸和木犀草苷作為參照成分時,有機酸類和黃酮類8個成分的fkm值 1.24、0.86、0.96、0.95、1.18、1.08、2.46和1.03,RSD平均值為3.0%、2.9%、3.1%、2.0%、2.2%、2.8%、2.9%和2.4%。結果表明在同一臺高效液相色譜儀上,體積流量變化fkm值的影響不顯著。

2.3.3 不同柱溫的影響

用Agilent 1260高效液相色譜儀,分別在柱溫為30、35、40 ℃的條件下測定,求算以綠原酸和木犀草苷作為參照成分時,有機酸類和黃酮類8個成分的fkm值1.23、0.87、0.98、0.95、1.18、1.06、2.44和1.06,RSD平均值為 2.6%、2.4%、3.4%、3.7%、2.8%、2.9%、3.1%和3.3%。結果表明在同一臺高效液相色譜儀上, 柱溫的變化對fkm值的影響不顯著。

2.4 水分和總灰分

按照2020年版中國藥典的第四部通則0832第二法檢測菊花樣品水分含量。結果顯示6大品系61個單株菊花樣品的水分含量在7.860%～12.253%之間,平均含水分含量10.183%,均低于15%,符合《中國藥典》規定;按照通則2302測定菊花樣品總灰分含量,其結果在5.793%～12.780%之間,平均總灰分含量8.163%,《中國藥典》未規定標準。

2.5 聚類分析

本文以菊花的異綠原酸A、新綠原酸、異綠原酸B、綠原酸、異綠原酸C、隱綠原酸、金合歡素、大波斯菊苷、木犀草素、木犀草苷及總灰分含量數據為變量,通過SPSS26.0軟件,在組間聯接法基礎上,以平方歐式距離為依據進行系統聚類分析,獲得不同菊花樣品的樹狀聚類圖。由圖3可知,當平方歐氏距離5時,被分為五類,其中懷菊品系為一類,親緣相近其他杭菊品系根據各成分含量特點被分為四類。

圖3 菊花樣品聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of chrysanthemum samples

聚類結果與實際分類相符。

聚類分析結果可將61個單株分為5大類,懷菊(hj-1-1)被分為一類,其有機酸類含量都很低,綜合得分也最低,品質最差,這可能由于懷菊花是重慶引種品種,不適合在重慶種植生產;陽菊品系(yj-8-21)被分為一類,其總灰分含量最高。總灰分是體現金屬微量元素對品種質量的影響。微量元素與中藥藥效物質基礎和歸經有著緊密的聯系,其含量小,但功能作用大,影響菊花品質的重要因素之一。因此,可能此單株有些微量金屬元素含量或鹽類含量普遍高于其他單株;大多數云陽品系和陽菊品系種被分為一類;綜合得分排在后25%的大概分為一類,其中大多數單株的綠原酸、木犀草苷含量低于藥典規定的標準;云陽品系(yy-2-19、yy-2-20、yy-3-21～yy-3-25)被分為一類,其大多是有機酸類成分含量非常接近。

2.6 主成分分析

主成分分析(principal component analysis,PCA)是通過改變數據集的特征數量,簡化數據,同時盡可能地保留信息,快速實現數據的可視化識別的一種多元統計分析方法。首先,對原始數據用SPSS26.0進行標準化,再進行巴特利特球形度檢驗和KMO檢驗,發現P<0.01,表明該批菊花數據可進行主成分分析。以10種化學成分及總灰分含量作為變量,以特征值大于1及累計貢獻率作為判斷依據,選出三個主成分,詳細結果見表6、表7。由表可見,前三個主成分累計貢獻率達到79.066%,具有較強的代表性,既可以用于菊花內在質量的評價,又可以作為菊花選優品種的重要指標。其中,第一個主成分特征值6.117和方差貢獻率55.608%,主要反映該主成分信息的載荷較高成分有異綠原酸A、綠原酸、異綠原酸B、新綠原酸、異綠原酸C木犀草苷、隱綠原酸等;第二個主成分的特征值1.461和方差貢獻率13.281%,載荷較高的只有大波斯菊苷;第三個主成分的特征值1.119和方差貢獻率10.177%,載荷較高的主要反映該主成分信息的成分有木犀草素和總灰分。

表6 主成分分析Table 6 Principal component analysis

表7 主成分因子載荷矩陣Table 7 Loading matrix of principal component factor

根據主成分矩陣和特征值可計算獲得3個主成分PC1、PC2、PC3和被測指標間的回歸方程(公式1～3)。以所選主成分對應的貢獻率與3個主成分累計貢獻率的比值作為權重,再用該權重值與之相應的主成分數值相乘,從而得出不同菊花樣品的綜合評價得分值F(公式4),結果見表8,以此來綜合評價不同類型菊花的品質。

表8 菊花11個指標綜合得分及排名Table 8 Comprehensive score and ranking of 11 indicators of chrysanthemum

PC1=0.374X1+0.370X2+0.379X3+0.342X4+0.353X5+0.363X6+0.083X7+0.378X8-0.123X9-0.156X10-0.133X11

(1)

PC2=-0.139X1-0.097X2-0.199X3+0.280X4+0.077X5+0.031X6+0.737X7-0.110X8-0.036X9-0.363X10+0.397X11

(2)

PC3=0.207X1+0.246X2-0.047X3-0.152X4+0.086X5+0.252X6-0.173X7-0.142X8+0.699X9-0.014X10+0.512X11

(3)

F=0.703PC1+0.168PC2+0.129PC3

(4)

上式中X1、X2、X3......X11分別表示新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、大波斯菊苷、異綠原酸C、木犀草素、金合歡素、總灰分。由表8可知,綜合得分越高,排名越靠前,品質越好;綜合得分排名前三菊花單株分別是陽菊品系(yj-2-4、yj-3-7、yj-6-15),品質最好。此三個單株含有機酸量普遍高于其他單株,黃酮類含量分散較廣,總灰分含量無顯著差別,這說明此三個單株適宜重慶的生長環境;綜合得分排名后三單株分別是小洋菊(xy-1-1)、杭白菊(hb-1-1)、懷菊(hj-1-1),品質最差,此三個單株有機酸、木犀草苷、大波斯菊苷含量較低,這說明此三個單株不適宜在重慶生長。

通過主成分分析擬合出3個主成分,第一主成分主要反映有機酸類對菊花質量的影響;第二主成分反映大波斯菊苷對菊花質量的影響;第三主成分反應總灰分、黃酮類含量對菊花質量的影響。此基礎上結合綜合評價法選出了品質最佳的三個單株,分別是陽菊品系(yj-2-4、yj-3-7、yj-6-15),其特點是莖稈直立,花小,白色,有機酸類成分含量均高于其他單株,木犀草苷含量比要規定的標準高于10～13倍,總灰分和水分含量無明顯特征。

3 討論與結論

本實驗以不同濃度比例的磷酸水和乙腈作為流動相,對菊花10種化學成分色譜峰的峰形、保留時間、分離度及基線平穩等因素進行對比分析,最終選擇峰對稱性更好,基線更平穩,分離效果更佳的流動相系統即乙腈-0.4%磷酸水溶,其效果優于藥典規定的乙腈-0.1%磷酸水溶流動相系統。通過掃描200～400 nm波段,發現有機酸類在320～335 nm之間紫外吸收較強且集中,黃酮類在330～360 nm之間紫外吸收較強且集中;綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A等最強紫外吸收波長接近328 nm,木犀草苷、大波斯菊苷、木犀草素等最強紫外吸收波長都接近348 nm,且在兩個波長兩類物質峰面積差距較大。因此,為了含量結果的準確性,本實驗選擇了328 nm,348 nm波長分別檢測有機酸類和黃酮類成分,避免了兩類物質因同一個波長檢測而出現的誤差。

實驗選用加熱回流和超聲輔助提取方法對樣品進行提取,選用50%甲醇、75%甲醇及純甲醇對樣品進行不同時長的提取,最終綜合對比不同提取方法的提取效果、操作難易程度、時間效率,確定最優的前期處理方法即用70%甲醇水溶液在60℃下超聲波處理45 min,該方法既顯著改善了提取的效果及準確度,又減少了繁瑣的實驗流程。

綜上,本文研究建立以HPLC運用一測多評同時測定菊花10種化學成分含量的方法。研究以綠原酸,木犀草苷為內標參照物,依據相對校正因子對61個菊花單株10個成分含量進行測定,與外標法結果無顯著差異。結果表明:該方法高效、便捷、準確可行,其結果與傳統含量測定結果基本相同;同時采用聚類分析和主成分分析法,制定菊花品質綜合評定方法,初步篩選出了品質最佳并適宜在重慶生長的三個優良單株,分別為陽菊品系(yj-2-4、yj-3-7、yj-6-15)。為下一步新品種選育提供了實驗數據,同時為渝產藥用菊花內在質量的全面控制和綜合評價提供了新的方法。為菊花的品種選育及質量評價提供科學依據。