駝血蛋白中胰脂肪酶抑制肽的計算機模擬評估

伊 麗,孫茹欣,何 靜,2,明 亮,2,張秀榮,吉日木圖,2

1內蒙古農業大學食品科學與工程學院 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,呼和浩特 010018;2內蒙古中哈駱駝研究院,阿拉善 737300;3阿拉善右旗農業技術推廣中心,阿拉善 750306

近年來,隨著人們生活水平的提高和飲食習慣的改變,高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)已逐漸成為危害人類健康的“第一殺手”[1]。該病是由機體脂質代謝紊亂導致的。鑒于膽固醇吸收與脂質代謝的密切關系,膽固醇吸收通路成為了治療高脂血癥藥物的重要干預靶點,可以通過減少腸道對膽固醇的吸收來有效預防高脂血癥[2]。膳食攝入的脂質先經過胰脂肪酶水解,分解為脂肪酸和甘油單酯,與膽固醇、膽鹽等形成膠團,最后在腸道被細胞吸收。因此,有效抑制胰脂肪酶(pancreatic lipase,PL)活性可以減少機體對脂質的吸收,從源頭緩解病情,預防疾病[3]。市面上一些藥物存在一定的副作用,會引起患者產生不適。因此,亟需開發出天然源生物活性物質來輔助治療高脂血癥。

生物活性肽因其來源廣、安全系數高,成為近幾年的研究熱點。駝血蛋白含量高,總蛋白含量為6.80 g/dL,血紅蛋白含量為141.11 g/L,高于其他家畜[4],且氨基酸種類豐富,滿足WHO/FAO/UNU推薦值,是潛在的優質生物活性肽來源[5]。且已有研究證明,駝血蛋白酶解產物有抗疲勞、抗氧化、降血壓等功效[6]。因此,以駝血蛋白為原料制備胰脂肪酶抑制肽具有一定的研究價值。

本研究采用中性蛋白酶對駝血蛋白進行酶解,以胰脂肪酶抑制率為評判指標,優化酶解工藝,采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)測定駝血多肽的分子量分布,并基于液相色譜-質譜聯用儀(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)對駝血多肽進行鑒定與分析,同時利用PepSite2建模預測結合位點,通過分子動力學模擬對篩選出的多肽進行結合位點與作用方式的評價,為今后胰脂肪酶抑制活性肽的研究提供參考,為駝血的開發及利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝血采于四子王旗健康的戈壁紅駝。

中性蛋白酶(批號:Z8031-500 g)、BCA蛋白濃度試劑盒(批號:PC0020-50 T)購于北京Solarbio科技有限公司;胰脂肪酶(批號:L3126-25 g)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(批號:70990-250 mg,純度≥99%)、對硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP)(批號:241326-50 g,純度≥99%)、對硝基棕櫚酸苯酯(p-nitrophenyl phosphate,PNPP)(批號:N2752-1 g,純度≥98%)購于美國Sigma生物科技有限公司;Mass Standards Kit for the 4700 Proteomics Analyzer購于美國AB SCIEX公司;乙腈(批號:1.00029-1 L,純度≥99%)、三氟乙酸(批號:80457-10 mL,純度≥99%)購于德國Merck公司;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 駝血蛋白的制備

采集鮮駝血加入0.8%(W/V)檸檬酸鈉抗凝,用400目紗布過濾,并離心去細胞膜(4 ℃,4 000 r/min,5 min)[7]。將已去細胞膜的駝血用0.1 mol/L(pH 7.2)磷酸鹽緩沖溶液在4 ℃條件下透析24 h,在-50 ℃,1 Pa條件下真空冷凍干燥制成駝血粉。采用BCA蛋白濃度試劑盒測得駝血蛋白含量為(77.28 ± 1.34)%。

1.2.2 酶解制備駝血多肽

將駝血粉按原濃度復原后,選用中性蛋白酶對駝血蛋白酶解。酶解完成后,沸水浴10 min滅酶,離心(4 ℃,4 000 r/min,10 min),取上清液為駝血蛋白酶解產物。

1.2.3 單因素試驗

對中性蛋白酶的酶用量、酶解時間、酶解溫度、酶解pH進行單因素試驗,以胰脂肪酶抑制率為指標,確定單因素試驗的酶解條件。控制酶解溫度為55 ℃,酶解pH為7.0,酶解時間為4 h,設定酶用量的水平梯度分別為(E/S,W/W)1%、3%、5%、7%、9%,考察酶用量對駝血多肽胰脂肪酶抑制率的影響。控制酶用量為5%,酶解pH為7.0,酶解時間為4 h,設定酶解溫度的水平梯度分別為40、45、50、55、60、65 ℃,考察酶解溫度對駝血多肽胰脂肪酶抑制率的影響。控制酶用量為5%,酶解溫度為55 ℃,酶解時間為4 h,設定酶解pH的水平梯度分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,考察酶解pH對駝血多肽胰脂肪酶抑制率的影響。控制酶用量為5%,酶解溫度為55 ℃,酶解pH為7.0,設定酶解時間的水平梯度分別為1、2、3、4、5、6 h,考察酶解時間對駝血多肽胰脂肪酶抑制率的影響。

1.2.4 響應面優化試驗

根據單因素試驗選取酶解時間、酶解溫度和酶解pH三個因素,以胰脂肪酶抑制率為響應值,設計17個試驗點的響應面分析試驗(見表1)[8]。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Response surface test factor levels

1.2.5 胰脂肪酶抑制活性的檢測

使用0.1 mol/L(pH 7.2)的磷酸鉀緩沖溶液溶解1 mg PNP并定容至100 mL,得到母液,再按梯度稀釋,避光靜置10 min后,取各個濃度的PNP溶液200 μL于96孔板中,用酶標儀測定在410 nm波長下測定吸光度,以0.1 mol/L(pH 7.2)的磷酸鉀緩沖溶液為參比溶液。以PNP濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線(見圖1),得到方程為Y=0.499X-0.055 8,R2=0.992 5。

圖1 PNP標準曲線Fig.1 PNP standard curve

PNPP底物的配制:稱取30 mg PNPP溶于10 mL異丙醇。稱取阿拉伯膠(0.09 g)和脫氧膽酸鈉(0.2 g)溶于90 mL 0.1 mol/L磷酸鉀緩沖溶液中混勻,完全溶解后室溫下穩定2 h,駝血多肽與5 mg/mL的胰脂肪酶在37 ℃下共溫1 h,再加入底物PNPP于37 ℃下反應20 min,測OD410值[9,10]。

式中,I:駝血多肽對胰脂肪酶抑制率。A:對照實驗組的吸光度。Aa:對照空白組的吸光度。AB:樣品實驗組的吸光度。Ab:樣品空白組的吸光度。

1.2.6 MALDI-TOF-MS分子量測定

樣品采用校準標準品Calibration Mixture 1進行外標一級校準,一級質譜(MS)范圍為0～5 000m/z和5 000～20 000m/z[11]。

1.2.7 多肽的鑒定

1.2.8 多肽的分子特性與結合位點預測

使用PeptideRanker程序(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)對篩選得到肽列表進行肽蘭克評分,以0.8作為活性預測單閾值,當多肽預測得分大于該值時,認為其具有潛在的活性。通過Peptide Property Calculator(http://www.innovagen.com/proteomics-tools),計算所得多肽的理論相對分子量、等電點、凈電荷和水溶性[13]。使用ToxinPred程序(http://crdd.osdd.net/raghava//toxinpred/)對其潛在毒性進行預測[14]。使用PepDraw(http://www.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw/)評估多肽的疏水性[15]。利用https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html網站預測多肽二級結構[16]。使用Pepsite2(http://pepsite2.russelllab.org/)預測結合位點[17]。

1.2.9 分子動力學模擬

1.2.9.1 分子對接

從RCSB PDB蛋白質數據庫(http://www.rcsb.org/home/home.do)檢索獲得胰脂肪酶(PDB code:1ETH)晶體結構,采用Maestro 13.4軟件構建三條肽段與1ETH的結合模式。通過LigPrep模塊計算三條肽段在生理環境下的電荷狀態及能量最低構象,采用Maestro中的蛋白準備模塊(protein preparation wizard)對1ETH進行非配體和水分子的去除,加氫原子,使用OPLS4力場優化結構以去除分子間碰撞。進一步,采用Maestro中受體格點準備模塊(receptor grid generation)生成對接口袋的格文文件,以晶體結構的共晶配體的質心作為活性口袋中心,生成30 nm×30 nm×30 nm的格點文件。最后,通過Glide對接模塊的SP-Peptide算法進行分子對接。

1.2.9.2 分子動力學模擬

采用AMBER 19軟件[18]對上述對接獲得的肽段與1ETH復合物分別進行全原子分子動力學模擬。首先,通過antechamber模塊和gaussian 09軟件的Hartee-Fock(HF)SCF/6-31G*計算肽段的電荷。之后,采用GAFF2小分子力場和ff14SV蛋白力場[19,20]分別對肽段和1ETH進行描述,采用LEaP模塊添加氫原子,在體系10 nm距離處添加截斷的八面體TIP3P溶劑盒,并在體系中添加Na+/Cl-用于平衡體系電荷,輸出用于模擬的拓撲和參數文件。然后,使用2 500步的最陡下降法和2 500步的共軛梯度法進行能量優化。在體系維持溫度298.15 K的條件下,進行500 ps的NVT系綜模擬和500 ps 的NPT平衡模擬。最后,在周期邊界性條件下,進行100 ns(50 000 000步)的NPT系綜模擬,采用PME法計算長程靜電相互作用[21],非鍵的截斷距離設為1 nm,碰撞頻率γ設為2 ps-1,體系壓強為1 atm,積分步長為2 fs,每隔10 ps保存軌跡,對均方根偏差(Root-mean-square deviation,RSMD),MM/GBSA結合能進行分析。

總之，行知教育思想在教學中的優勢不言而喻，從學校的角度出發，要發展好行知教育并非是易事，必須要結合學校的實際情況，科學地落實相關的工作，這樣學校才能朝著更好的方向發展，才能真正的提升學生的能力。

1.3 數據處理

所得數據均用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2 019進行統計分析,使用Graphpad prism9繪制圖。各組實驗均重復三次,采用ANOVA進行Ducan差異分析,P<0.05表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 胰脂肪酶抑制肽制備的單因素實驗

2.1.1 酶用量

由圖2A可知,隨著酶用量的增加,胰脂肪酶抑制率呈先上升后下降的趨勢。當酶用量達到5%時,胰脂肪酶抑制率為27.46%,酶用量繼續增加,胰脂肪酶抑制率逐漸降低,可能是過飽和的蛋白酶對其中駝血多肽進一步作用導致的。為保護具有胰脂肪酶抑制能力的多肽,故確定最佳酶用量為5%。

圖2 酶解條件對胰脂肪酶抑制能力的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on PL inhibition rate注:不同字母表示在不同條件下酶解產物的胰脂肪酶抑制率的差異顯著(P<0.05)Note:Different letters indicate significant differences (P<0.05) in the PL inhibition rates of the hydrolysates under different conditions.

2.1.2 酶解溫度

由圖2B可知,隨著溫度的升高,呈先上升后下降的趨勢。當溫度逐漸升高時,酶活增強,酶促反應加快,駝血多肽的胰脂肪酶抑制能力逐漸升高。當酶解溫度達到55 ℃時,駝血多肽的胰脂肪酶抑制率為22.84%。溫度繼續增加,蛋白酶失活,駝血多肽的胰脂肪酶抑制率降低。故確定最佳酶解溫度為55 ℃。

2.1.3 酶解pH

在中性蛋白酶最適pH的范圍內設置水平梯度,隨著pH的增大,駝血多肽的胰脂肪酶抑制率呈先上升后下降的趨勢(見圖2C)。當酶解pH為7.0時,中性蛋白酶酶解產物的胰脂肪酶抑制率為20.81%,達到最大,顯著高于組間其他pH條件下酶解產物的胰脂肪酶抑制活性。故確定最佳酶解pH為7.0。

2.1.4 酶解時間

在一個酶解反應中,酶解時間也起著至關重要的作用。由圖2D可知,隨著酶解時間的增加,駝血多肽的胰脂肪酶抑制率呈先上升后下降的趨勢。駝血多肽的胰脂肪酶抑制率在酶解時間為3 h時達到最大,為39.26%。故確定最佳酶解時間為3 h。

2.2 胰脂肪酶抑制肽的響應面優化試驗

利用Design-Expert v8.0.6軟件對結果進行多元回歸擬合,得到駝血多肽的胰脂肪酶抑制率(Y)與酶解時間(A)、酶解溫度(B)、酶解pH(C)方程為:Y=40.83+1.99A-0.64B+1.23C-2.52AB+0.51AC+1.27BC-12.95A2-8.19B2-7.63C2(見表2)。最佳酶解工藝條件為:酶解時間3 h、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0,駝血多肽的胰脂肪酶抑制率預測值為42.13%。與王璐[22]提取的雞蛋清蛋白肽、周美含[23]提取的榛仁肽的胰脂肪酶抑制率相近,說明在駝血中提取的多肽胰脂肪酶抑制效果良好。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface test results

圖3 各因素交互作用對胰脂肪酶抑制率的影響的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plots and contour plots illustrating the influence of factors on PL inhibition rate

表3 回歸方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance

2.3 駝血多肽的分子量

MALDI-TOF-MS是一種新型軟電離質譜技術,用于測定混合物絕對分子量[24]。本研究在正離子的檢測模式下檢測駝血多肽分子量主要集中在200～2 000 Da,該范圍內肽段占比為98.06%,說明此次駝血蛋白酶解效果良好,產生了大量小分子肽段。如圖4所示,500～1 500 Da分子量范圍內的肽段較多,占總量的79.77%。其中,683.393、912.580、1 126.639、1 223.739、1 239.723離子相對豐度較高,說明該分子量的氨基酸固定縮合在一起的肽段較多,起到良好的胰脂肪酶抑制作用。

圖4 駝血多肽的MALDI-TOF-MS質譜圖Fig.4 MALDI-TOF-MS mass spectra of camel blood peptides

2.4 駝血多肽鑒定

駝血多肽鑒定出的肽段在UniProt Camelidae數據庫中進行比對。由表4可知,鑒定出533種多肽,共計1 633條。主要源于血紅蛋白、血清蛋白和纖維原蛋白,占比分別為57.78%、12.84%、9.26%。肽段長度分布在8～25個氨基酸之間,其中10～11個氨基酸長度的肽段數量最多為405條,12～13個氨基酸長度的數量次之為331條,少量肽段由6～9個氨基酸組成(見圖5),表明經消化后,駝血蛋白釋放出了大量的短肽,對于提供生物活性肽具有良好潛力。

圖5 鑒定的肽段長度分布Fig.5 Length distribution of identified peptides

表4 鑒定出的多肽及蛋白信息Table 4 Identified peptide and protein information

2.5 駝血多肽活性與分子特點分析

利用Peptide Ranker對多肽進行肽蘭克評分,通過在線預測軟件對多肽進行了理化性質與二級結構的分析(見表5)。結果表明,評分大于0.8的PL抑制多肽有8條,分子量集中在970～1 600 Da之間,PI主要集中在9～11之間,凈電荷主要集中在1～3之間,疏水性在8～19之間,無毒且主要以無規則卷曲形式存在。該結果與Mudgil[10]、Tian[25]等的結果相近。

表5 駝血多肽的活性評價及分子特點分析Table 5 Activity evaluation and molecular characteristics analysis of camel blood peptides

2.6 駝血多肽與胰脂肪酶的結合位點

胰脂肪酶是一種脂質消化酶,將甘油三酯底物轉化為單甘脂和游離脂肪酸,負責消化50%～70%的膳食脂肪。臨床上已將PL認定為高膽固醇血癥和肥胖癥管理策略的關鍵抑制代謝酶[26]。研究表明,PL在其催化過程中涉及6個主要氨基酸殘基,即Ser153、Asp177、His264、Phe78、His152和Phe216組成了酰基酶催化三要素和脂肪酶的潛在底物結合或抑制位點[27]。因此,預測多肽與這些位點或殘基的結合即可調節胰脂肪酶動力學。根據PepSite 2預測結果可知,ALERMFLGF、GQPAVPVRF和WDPSKVPPR三條多肽與胰脂肪酶活性位點顯著結合(見表6)。這是由于三條肽段主要由疏水氨基酸組成,PL則是一種親脂性酶,因此,它們可以很容易與胰脂肪酶的活性部位結合,從而抑制其活性。

表6 駝血多肽與胰脂肪酶(PDB code:1ETH)結合位點的預測Table 6 Prediction of the binding site of camel blood peptide to pancreatic lipase (PDB code:1ETH)

2.7 分子動力學模擬

2.7.1 RMSD值結果

本研究計算了三條肽段與1ETH分子動力學模擬100 ns時長軌跡的RMSD值,以檢驗體系穩定性,結果如圖6所示。肽段ALERMFLGF在模擬前期波動較大,模擬后期收斂到0.22 nm,波動相對穩定,達到穩定的結合模式。肽段GQPAVPVRF和WDPSKVPPR在模擬前期即達到穩定狀態,中后期持續在0.15～0.2 nm范圍內波動。該結果表明,三條肽段在模擬后均實現了穩定。

圖6 分子動力學模擬過程中肽段與1ETH復合物RMSD隨時間的變化Fig.6 Variation of RMSD of peptide/1ETH complex over time during molecular dynamics simulation

2.7.2 結合自由能的計算

基于分子動力學模擬的軌跡,采用MM/GBSA計算方法計算了肽段與1ETH的結合能,該結果可以更為準確地反映結合效果。如表7所示,ALERMFLGF/1ETH、GQPAVPVRF/1ETH和WDPSK VPPR/1ETH的結合能分別為-31.00±3.55、-36.68±2.77和-32.22±4.10 kcal/mol,表明三條肽段與1ETH均具有較好的結合力。通過能量分解,主要貢獻力為靜電勢能,其次是范德華作用能,再就是非極性溶劑化作用。

表7 MM/GBSA計算結合能Table 7 MM/GBSA calculation of binding energy

2.7.3 分子結合模式

分子動力學模擬可以精煉對接獲得的肽段和蛋白的結合方式,因此,本研究通過100 ns的分子動力學模擬優化了肽段和1ETH的結合模式(見圖7)。結果顯示,三條肽段均能占據胰脂肪酶蛋白活性袋,其中肽段ALERMFLGF與1ETH上的ASP206發生靜電作用(鹽橋作用),與Phe78、Asp80、Asn213、Asp206發生氫鍵作用,與Ala179、Pro181、Tyr115發生疏水作用。肽段GQPAVPVRF與1ETH上的Asp206發生靜電作用(鹽橋作用),與Phe78、Tyr115、Ser153、Asp80、Val260、Asn213、Asp206、Lys233、His264、Gln234發生氫鍵作用,與LEU214、Phe78、Tyr115、Phe259發生疏水作用(見圖7B)。肽段WDPSKVPPR與1ETH上的Asp80發生靜電作用(鹽橋作用),與Glu180、Phe78發生氫鍵作用。此外,還和Ala261、Phe78、Phe216、Ile210發生疏水作用(見圖7C)。

圖7 基于分子動力學模擬獲得的ALERMFLGF(A)、GQPAVPVRF(B)和WDPSKVPPR(C)與胰脂肪酶(PDB:1ETH)的結合模式Fig.7 Binding patterns of ALERMFLGF(A),GQPAVPVRF(B) and WDPSKVPPR(C) to pancreatic lipase (PDB:1ETH) based on molecular dynamics simulations注:左圖為整體視圖;中圖為3D局部視圖,黃色虛線表示氫鍵作用;右圖為2D相互作用圖。Note:The left figure shows the overall view;the middle figure shows the 3D binding patterns,with the yellow dashed line indicating the hydrogen bond;the right figure shows the 2D binding patterns.

據研究報道,PL由N-末端和C末端結構域組成,其中N-末端結構域是活性部位,包含催化三要素Ser153、Asp177和His264,以及底物結合殘基Phe78、Ile79、His152、Phe216、Trp253和Arg257。該結構域的活性位點埋在瓣膜的柔性環下面,使酶處于非活性狀態;C端結構域(殘基337～449)主要參與與其輔助因子-輔脂酶的互動,該結構域是通過瓣膜構象變化激活酶的必要條件[29]。為了使胰脂肪酶有效的發揮作用,N-端結構域翻轉可以使活性位點被底物接觸,形成一個功能性的氧陰離子孔并產生界面結合點。由此推測,本研究篩選得到的三條肽段可能通過預先阻止N端結構域(催化部位)的重新定位,限制脂肪酶的功能,推遲對甘油三酯的消化和吸收,從而防止肥胖和高脂血癥的發生[28]。此外,Ngoh等[28]報道,擁有越多結合位點的肽,該肽的抑制活性就越高,由此推測,GQPAVPVRF可能顯示出更好的胰脂肪酶抑制性,該結果有待進一步驗證。

3 結論

胰脂肪酶的抑制被認為是針對高脂血癥和肥胖的重要的治療干預措施之一。本研究基于胰脂肪酶抑制活性,通過單因素和響應面實驗對中性蛋白酶水解制備駝血胰脂肪酶抑制肽的工藝進行了優化。在最優條件下,駝血多肽的胰脂肪酶抑制率為42.13%。通過MALDI-TOF-MS、LC-MS以及生物信息技術對酶解產物進行分析,最終鑒定出ALERMFLGF、GQPAVPVRF、WDPSKVPPR三條與胰脂肪酶顯著結合的肽段。通過分子動力學模擬發現,三條肽段主要通過氫鍵、疏水相互作用與PL活性部位的氨基酸殘基結合,破壞胰脂肪酶N-端結構域瓣膜的功能,抑制其活性。其中GQPAVPVRF的結合自由能高且100 ns內的氫鍵數量多,意味著它能與1ETH的結合緊密,有望成為胰脂肪酶抑制劑成分。該研究結果表明,駝血蛋白可作為胰脂肪酶抑制肽的來源。然而,虛擬篩選結果存在一定的局限性,今后還需要對肽段進行水溶性和消化穩定性的優化,人工合成后通過體外和體內實驗加以驗證抗高脂血癥的效果。