細菌掛膜結合魚蚌混養對養殖水體水質的原位調控模擬

薛 瓊,梁文伯,耿 冰,汪雅文,宋海亮,楊小麗,*

(1.南京市生態環境保護科學研究院,江蘇南京 210013;2.東南大學土木工程學院,江蘇南京 211189;3.上海城市水資源開發利用國家工程中心有限公司,上海 200082;4.南京師范大學環境學院,江蘇南京 210023)

除此之外,在養殖水體中,適當投入硝化細菌制劑,可將對水產品有毒害作用的氨態氮和亞硝酸鹽轉化為無毒的硝酸鹽[14],從而改善養殖水體水質,減少其對魚類的危害[15]。直接利用游離態的微生物有較多缺點,如對抗水體沖擊能力弱、對溫度等環境因子變化敏感等。如果在養殖水體中投入填料,經過一定時間的培養,投放的微生物可在填料表面形成一層穩定性較高的生物膜[16],對外界的干擾具有較強的抵抗力,可以強化對養殖水體的凈化作用[17-19]。目前碳纖維與毛氈是比較常用的水體凈化填料。

魚蚌混養與微生物膜技術對于養殖水體的調控已有一定的研究,但將兩種技術結合來調控養殖水體的研究還比較少。因此,本文從改變養殖方式及添加掛膜微生物兩方面來調控養殖水體,探究原位修復養殖水體的新方法,并探究該體系對水產品品質的影響,以期同時提高生態效益和經濟效益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗養殖系統的構建

本試驗設置室內模擬試驗,試驗容器為150 L白色塑料圓筒,每只桶內投入養魚7個月后自然形成的養殖水,水量為128 L,初始水質如表1所示。草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鯽魚(Carassiusauratus)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)與鳙魚(Aristichthysnobilis)4種魚類購于四川運龍水產養殖場,三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)購于湖南小明水產養殖場。

表1 養殖水初始水質Tab.1 Initial Water Quality of Aquaculture Water

試驗用飼料購于通威股份有限公司的通威180(浮料)和通威126(沉底料),兩種飼料各種營養成分指標如表2所示。硝化細菌購于德豐生物技術公司,有效活菌數為2×108g-1。

表2 飼料營養成分指標Tab.2 Indices of Feed Nutrient Contents

1.2 試驗設計

本試驗共設置3組試驗,3組試驗的裝置如圖1所示。

圖1 試驗系統示意圖Fig.1 Schematic Diagram of Experiments

1.2.1 魚蚌混養系統優化試驗

試驗1考察三角帆蚌密度對魚類混養體系的水質及混養魚類產品品質影響,根據水質及水產品品質變化,確定最佳魚蚌放養比例。試驗1設計如圖1(a)所示,共設3個處理,分別是:2∶1M,草魚+鯽魚+鰱魚+鳙魚混養三角帆蚌,魚蚌數量比為2∶1;3∶1M,草魚+鯽魚+鰱魚+鳙魚混養三角帆蚌,魚蚌數量比為3∶1;4∶1M,草魚+鯽魚+鰱魚+鳙魚混養三角帆蚌,魚蚌數量比為4∶1。根據Tang等[11]的研究,將混養魚“草魚-鯽魚-鰱魚-鳙魚”的數量比固定為6∶2∶1∶1。三角帆蚌用網籠吊養在塑料桶中,每個網籠中放養一個三角帆蚌,吊養于水面下30 cm。試驗開始時三角帆蚌、混養魚的放養量如表3所示。每天9:00和17:00時2次向混養魚類投喂混養魚類飼料。系統中的草魚和鯽魚投喂通威126,系統中的鰱魚和鳙魚投喂通威180,投飼量為魚體重的4%。試驗期間24 h曝氣,曝氣流量設定為50 L/h。3個處理各設置3組重復。

表3 混養體系優化試驗魚蚌放養數量Tab.3 Amount of Fishes and Mussels in Optimized Experiment of Polyculture System

1.2.2 填料篩選試驗

生物膜的形成與生物載體有關,試驗2為毛氈和碳纖維對象展開研究,通過對掛膜啟動及穩定運行兩個階段的情況進行綜合分析,選擇出一種養殖水體凈化能力最強的載體,并將其運用到實際養殖系統中。試驗2設計如圖1(b)所示,共設毛氈組和碳纖維組兩個試驗組。將尼龍繩系于塑料桶兩端,5條1 m長的碳纖維和毛氈填料等距掛在繩子上,垂直掛入水中,使填料在水中處于散開狀態,其中碳纖維組合填料片的間距為10 cm。按照1 m3投放300 g菌劑的比例添加硝化細菌。試驗期間24 h曝氣,曝氣流量設定為50 L/h。兩個處理間各設置3組重復。

1.2.3 填料密度對于魚蚌混養的水質與水產品品質的影響

根據前人研究發現,當填料密度過低時,由于掛膜細菌數量少,造成填料對水體的凈化能力差;而填料密度過高時,過量的掛膜細菌又會過量利用氮、磷,降低魚類對于氮、磷的利用率。因此,本試驗以1.2.1小節的結果構建混養系統,將1.2.2小節中挑選出的填料,設置不同密度投入魚蚌混養系統,根據后續試驗中養殖水體水質指標和水產品生長、品質指標確定最佳填料密度。

試驗3共設4個試驗組。CK:三角帆蚌與4種魚混養,不投放填料。T-5:三角帆蚌混養草魚+鯽魚+鰱魚+鳙魚,投放5組填料。T-10:三角帆蚌混養草魚+鯽魚+鰱魚+鳙魚,投放10組填料。T-15:三角帆蚌混養草魚+鯽魚+鰱魚+鳙魚,投放15組填料。4個試驗組中均不額外投加硝化細菌制劑,每個試驗組的投飼量為魚體重的4%。系統如圖1(c)所示。試驗期間24 h曝氣,曝氣流量設定為50 L/h。3個處理間各設置3組重復。

1.3 養殖水體水質測定

1.4 水產品品質測定

試驗結束后,將樣品用樣品袋分類保存于-80 ℃冰箱中,進行魚類樣品品質化學分析。對魚樣進行水分、灰分、蛋白質和粗脂肪測定,水分采用105 ℃干燥法測定,灰分采用馬弗爐550 ℃灼燒法測定,粗蛋白采用凱氏定氮法測定,粗脂肪采用索氏抽提法測定[20-23]。

1.5 數據計算

水產品存活率與生長率計算如式(1)～式(3)。

SR=100×Nt/N0

(1)

GL=100×[(Lt-L0)/L0]/T

(2)

GW=100×[(Wt-W0)/W0]/T

(3)

其中:SR——淡水魚類與三角帆蚌存活率;

Nt——試驗結束時魚類的數量;

N0——試驗開始時魚類的數量;

GL——每日殼長/體長生長率;

Wt——試驗結束時放養魚類體重,g;

W0——試驗開始時放養魚類體重,g;

GW——每日蚌重/體重生長率;

Lt——試驗結束時放養魚體長,cm;

L0——試驗開始時放養魚體長,cm;

T——運行天數,d。

模擬養殖塘氮、磷收支平衡計算如式(4)～式(7)。

MN,P=MN,P’+O

(4)

MN,P=M魚+M蚌+C餌×M餌

(5)

MN,P’=M魚’+M蚌’+M水

(6)

M水=C水×Q

(7)

其中:MN,P——輸入物中氮、磷質量,g;

MN,P’——輸出物中氮、磷質量,g;

O——輸入與輸出TN、TP質量之差,g;

M魚——養殖開始前混養魚類中氮、磷質量,g;

M蚌——養殖開始前三角帆蚌中氮、磷質量,g;

C餌——各餌料氮、磷質量分數;

M餌——養殖過程中投入的各餌料質量,g;

M魚’——養殖結束后混養魚類中氮、磷質量,g;

M蚌’——養殖結束后三角帆蚌中氮、磷質量,g;

M水——養殖結束后水體中的氮、磷質量,g;

C水——養殖結束后水體中的氮、磷質量濃度,mg/L;

Q——養殖水量,L;

模擬養殖塘內氮、磷輸出途徑主要有漁獲、養殖水體及其他因素(滲漏+蒸發+網片轉化和吸附等),其中“O”為輸入與輸出TN、TP之差[24],單位為g。

1.6 掛膜微生物群落測定

在試驗完成后,取出填料,參照蔣青青[25]的方法,選擇所要提取的生物膜部位,使用PBS溶液輕柔地漂洗除去殘余物質,使用干凈的刀片/剪刀取樣品放入試劑盒所帶的研磨小管中,交由廣州基迪奧生物科技有限公司完成高通量測序,解析微生物群落結構。

1.7 統計學分析

利用Excel、Origin 2018進行數據整理及作圖,統計結果均以平均值±標準差表示,用SPSS 22.0進行統計分析。多重比較用Duncan′s test進行,取P<0.05為差異顯著性水平。

2 結果與分析

2.1 魚蚌混養體系模式優化

根據Tang等[11]的研究,在80 d后打撈魚類,對水產品品質等數據進行檢測。在本部分試驗中,養殖水質的pH與DO均滿足《漁業水質標準》(GB 11607—1989)。除了4∶1M試驗組中草魚和鳙魚存活率為75%,其余組別混養魚的存活率均為100%。試驗中混養魚類體長與體重的生長如表4所示,試驗組2∶1M、3∶1M體長生長率顯著高于4∶1M(P<0.05),4∶1M的體長生長率最低,僅為0.117%±0.001% d-1。試驗組2∶1M體重生長率顯著高于3∶1M和4∶1M(P<0.05),為0.459%±0.004% d-1;4∶1M的體重增長率最低,為0.408%±0.006% d-1。

表4 試驗1中魚類體長和體重的生長Tab.4 Changes in Body Length and Weight of Fishes in Experiment 1

根據表5可知,在水分含量比較中,草魚、鯽魚與鳙魚在魚蚌比為2∶1時,水分含量顯著低于其他兩個試驗組(P<0.05),而鰱魚的水分含量在3組間沒有顯著差別(P>0.05)。針對草魚與鯽魚的灰分測量結果可知,3組試驗組間沒有顯著差異(P>0.05),但是2∶1M組中測得的灰分最低,鰱魚與鳙魚的灰分含量在2∶1M組顯著低于3∶1M和4∶1M兩個試驗組(P<0.05)。針對蛋白質的測量結果與灰分類似,3組試驗中草魚與鯽魚的蛋白質含量并無顯著差異,但在2∶1M試驗組中,草魚與鯽魚測得的蛋白質含量較高;鰱魚與鳙魚的蛋白質含量在2∶1M中顯著高于其余兩組試驗組。4種魚的粗脂肪含量在2∶1M組中均顯著高于其他組別(P<0.05)。

表5 試驗1中魚類品質的測定Tab.5 Fish Quality Determination in Experiment 1

2.2 填料種類篩選

一般認為裝置內掛膜材料上有一層薄膜覆蓋,且氨氮去除率在60%左右時,即為掛膜成功[26]。根據試驗數據計算,碳纖維試驗組在裝置運行5 d時,氨氮去除率為62.35%,掛膜成功;毛氈試驗組在裝置運行9 d時,氨氮去除率為62.79%,掛膜成功。

圖2 不同填料體系內各種水質指標的變化Fig.2 Changes of Water Quality Indices in Different Packing Systems

注:不同小寫字母表示不同試驗組間各水質指標的差異達顯著水平(P<0.05)。

由試驗結果可知,碳纖維填料成膜速度快,且對養殖水體的凈化效果要優于毛氈,因此,選取碳纖維作為試驗對象,優化該填料的投放密度,在調節養殖水體水質的同時,保證水產品品質。

2.3 不同填料填充率對于養殖水體水質與水產品品質的影響

2.3.1 對養殖水水質的影響

注:不同小寫字母表示不同試驗組間各水質指標的差異達顯著水平(P<0.05)。

2.3.2 對水產品品質的影響

試驗中混養魚類的存活率如表6所示。CK組的草魚和鰱魚存活率最低,分別是75%和80%;T-15試驗組草魚和鯽魚的存活率最低,為80%;而T-10試驗組中4種魚類的存活率最高,均為100%。

表6 試驗中混養魚類的存活率Tab.6 Survival Rates of Polyculture Fishes

試驗中混養魚的體長和體重生長率如表7所示。空白和T-10試驗組的體長生長率顯著高于其他處理組(P<0.05),T-10試驗組體長生長率最高,為0.416%±0.040%,T-15試驗組的體長生長率最低,為0.244%±0.083%。T-10試驗組的體重生長率顯著高于其他處理組(P<0.05),為0.462%±0.005%,T-5試驗組的體重生長率最低,為0.382%±0.005%。

表7 試驗3中混養魚的體長和體重生長率Tab.7 Changes in Body Length and Weight of Fishes in Experiment 3

由表8可知,CK組4種魚的水分含量偏高,且顯著高于其他試驗組(P<0.05),T-5、T-10和T-15試驗組間水分含量無顯著差異(P>0.05)。在灰分比較中4種魚的各試驗組間灰分含量均無顯著差異。在蛋白質含量比較中,4組試驗組的蛋白質含量均高于雞蛋蛋白[28],且T-10試驗組內4種魚的蛋白質含量均顯著高于其他試驗組(P<0.05)。針對粗脂肪這一指標而言,T-5試驗組中草魚與鯽魚的粗脂肪含量顯著高于其他試驗組內的草魚與鯽魚的粗脂肪含量(P<0.05),而T-10試驗組中鳙魚的粗脂肪含量顯著高于其他試驗組(P<0.05),根據脂肪含量進行分類,這4類魚均屬于中脂類魚[29]。因此,T-10試驗組養殖出的魚類滿足“高蛋白、中脂”的健康營養需求[30-31]。

表8 試驗3魚類品質Tab.8 Fish Quality in Experiment 3

2.4 掛膜微生物群落分析

分析T-5、T-10與T-15 3組在門和屬上的物種豐度分布,來研究不同數量的碳纖維生物膜的微生物群落結構。本試驗過程中3個試驗組在門分類水平上的菌群豐度如圖5所示。在這些細菌中,變形菌門(Proteobacteria)所含的豐度最高,在處理組T-5、T-10和T-15中的占比分別為48.65%、53.9%和39.78%。在處理組T-5的物種豐度分布中,綠灣菌門(Chloroflexi)和擬桿菌門(Bacteroidetes)僅次于變形菌門,占比分別為17.21%和10.78%。在處理組T-10的物種豐度分布中,厚壁菌門(Firmicutes)僅次于變形菌門,占比為13.86%。在處理組T-15的物種豐度分布中,厚壁菌門和擬桿菌門僅次于變形菌門,占比分別為10.98%和14.86%。除此以外,在3組處理組中均發現了少量的疣微菌門(Verrucomicrobia)、酸桿菌門(Acidobacteria)。變形菌門為3組處理組中碳纖維微生物群落中的主要菌門。

圖5 掛膜微生物在門水平物種分布Fig.5 Microbial Community Structure at the Phylum Level

本試驗過程中3組試驗組在屬分類水平上的菌群豐度如圖6所示。在3組處理組碳纖維的物種豐度分布中,T-10中梭狀芽孢桿菌-1(Clostridiumsensustricto1)占比最高,為7.16%。除此以外,Denitratisoma在3組處理組中都有一定的比例。梭狀芽孢桿菌-1為碳纖維微生物群落中的主要菌屬。

圖6 掛膜微生物在屬水平物種分布Fig.6 Microbial Community Structure at the Genus Level

2.5 氮、磷歸趨分析

T-10試驗組各養殖品種和餌料的氮、磷含量如表9所示。氮、磷物料平衡計算結果如圖7所示。

圖7 混養魚池塘氮、磷收支Fig.7 Nitrogen and Phosphorus Incoming and Outcoming in Polyculture Ponds

表9 各養殖品種和餌料的氮、磷含量Tab.9 Nitrogen and Phosphorus Content of Each Breed and Bait

整個養殖過程的氮收支平衡方程為:混養魚類與三角帆蚌苗種(26.7 g)+飼料(242.72 g)=混養魚類與三角帆蚌的漁獲物(56.83 g)+養殖水體(155.88 g)+其他(56.71 g)。磷收支方程為:混養魚類與三角帆蚌苗種(18.84 g)+飼料(75.86 g)=混養魚類與三角帆蚌的漁獲物(24.07 g)+養殖水體(62.88 g)+其他(7.75 g)。

3 討論

3.1 魚蚌混養體系模式優化

在魚蚌混養體系模式優化研究中,混養魚的養殖密度隨著魚蚌比的增加而增大。研究表明,魚類養殖中的養殖密度是影響魚類生長、餌料利用及魚產量的重要因素[30-31],過大的養殖密度會擠壓魚類的生活空間,導致存活率低,水產品品質變差。由試驗結果可知,魚蚌比為2∶1時,混養魚的生長率最高,且蛋白質、粗脂肪含量較高,混養魚品質較優。

3.2 填料填充率對于水產品與養殖水體的影響

分析試驗結果,在試驗3中,CK組氮、磷濃度維持在較高水平;而掛膜試驗組,即T-5、T-10與T-15試驗組中,能使養殖水體中氮、磷水平降低,其中T-10和T-15試驗組各水質指標改善效果明顯優于T-5試驗組。由此可知,增加填料密度可以有效增加細菌附著面積,改善養殖水體水質。對比T-10與T-15試驗組,其對于養殖水體水質的處理能力基本相同,分析原因可能是碳纖維密度過高,使微生物生長代謝所需營養相對缺乏,導致T-15試驗組微生物代謝受阻。Moussavi等[32]將聚氨酯海綿作為填料加入循環旋轉床反應器系統中,研究填充率為0～40%的模擬廢水的凈化效果,發現填充率為30%時凈化效果最佳。王帆等[33]的研究也發現,當填料填充率為30.5%、36.6%時,對于模擬城市污水的凈化效果、膜生物量以及生物活性均相差甚微。結合本研究結果可以得出,在養殖水體凈化中采用生物技術時,填料投加密度十分重要,要在有效去除氮、磷的基礎上控制成本,避免不必要的浪費。

與此同時,由于水質的改善,直接提高了水產品的存活率與品質。T-10試驗組水產品的存活率、生長率與品質均優于T-15試驗組,分析原因是碳纖維密度過高使微生物生長代謝所需營養處于匱乏狀態,與水產品形成營養競爭關系,且在空間上壓縮了魚類的生活空間,使水產品生長受到限制,從而影響魚類生存與生長。由此得出,雖然碳纖維填料密度較高時,各項水質指標均可維持在較優水平,但在實際應用時,還要根據實際養殖面積確定合適的碳纖維密度,以免影響水產品的生存與生長。這一結果與殷記強等[34]的研究一致。

3.3 養殖模式對養殖水體原位調控的效果分析

根據試驗3中的水質結果,相比生態浮島-碳纖維原位修復技術,細菌掛膜+魚蚌混養技術更好地對養殖水體進行調控[35],可能是由于試驗3體系中添加三角帆蚌,形成多營養層次綜合養殖體系[36],有利于提高投入飼料營養物質利用率,降低污染物產生。而相比有關研究報道,魚蚌共養體系的水質指標均略高于鯔蝦共養體系[37],推測是由于相比三角帆蚌,鯔對營養物質的需求量更高,可以更快速地消耗對蝦養殖產生的沉積物,減少體系中的污染物濃度。

3.4 微生物群落分析

由微生物群落結構數據可知,試驗結束后,T-15處理組中厚壁菌門相對豐度較低,這類細菌可以反映水體受污染程度,推測是因為隨著試驗的進行,氮、磷含量下降,污染得到削減之后,水質得到一定程度改善,使微生物群落結構產生影響,這與翟一帆等[38]對養豬廢水處理系統微生物群落結構的分析結果一致。變形菌門與脫氮性能有關,試驗結束后T-10和T-15試驗組變形菌門相對豐度較高,主要是因為增加碳纖維填料投放密度可以增大其豐度[39-40]。研究[41-42]證明,綠彎菌門(Chloroflexi)能在不同營養程度的環境中生存,但富營養化程度高的區域綠彎菌門更豐富,表明其更傾向生活在營養充足的環境中。根據圖4可知,在體系穩定后,T-5處理組氮、磷濃度高于T-10與T-15試驗組,使這類細菌在T-5試驗組具有明顯的生存優勢。

3.5 氮、磷歸趨方程分析

由氮、磷歸趨分析可知,飼料是池塘主要的氮、磷來源,其所含氮、磷占總輸入氮、磷的90.1%和80.1%[43]。漁獲物所含氮、磷占池塘TN、磷輸出的21.1%和25.4%。結合前人的研究,淡水魚對于氮的利用率約為18.0%～37.9%[44-46],本研究中的4種魚類與三角帆蚌的氮利用率均在此范圍之內;本試驗中水產品對于磷的利用率略高于相關研究[47-48],推測是由于本研究餌料中的磷占TP的比例略低,對于水產品的供給量不足,從而提高了水產品對于磷的利用率。

4 結論

(1)通過魚蚌混養體系優化試驗可以得出,最佳混養魚組合為三角帆蚌與“草魚-鯽魚-鰱魚-鳙魚”混養,最佳魚蚌比為2∶1,即20條魚搭配10個蚌。

(2)相比毛毯填料,添加了碳纖維填料的試驗組細菌掛膜速度較快,在試驗結束時,碳纖維填料試驗組的水質明顯好于毛氈試驗組。

(3)填料密度篩選試驗結果表明,在模擬養殖水體中添加10條1 m的碳纖維填料,可以在魚蚌比為2∶1的魚蚌混養體系中顯著降低養殖水體中的氮、磷含量,進而實現對養殖水體的原位調控,同時還可以獲得較高的水產品品質,實現生態效益與經濟效益的雙贏。