基于網絡藥理學與分子對接探討苓桂術甘湯治療新冠肺炎合并支氣管哮喘潛在作用機制研究

王昱丹，李正祎，楊凱麗，初夢瑤，韓路生，陳長寶，李 光，王恩鵬*（.長春中醫藥大學，吉林省人參科學研究院，長春 307；.吉林醫藥學院檢驗學院，吉林 吉林 303；3.長春中醫藥大學藥學院，長春 307）

支氣管哮喘是一種以氣道慢性高反應性炎癥為主要特征的呼吸系統疾病，以咳嗽、胸悶、氣促為主要臨床癥狀，其發病機制復雜，至今沒有得到合理的解釋[1]。全球范圍內支氣管哮喘發病率逐年上升，給社會以及家庭帶來嚴重醫療經濟負擔，很難完全被治愈。西醫治療長期服用激素以控制哮喘，其不良反應明顯，癥狀反復。中醫基礎理論中，支氣管哮喘被稱為“哮癥”[2]，認為因痰氣交阻、閉塞氣道、肺的升降失職所致。2022 版全球哮喘管理和預防策略指出，哮喘患者對新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的感染風險并未增加[3]，但研究發現患有嚴重哮喘在新冠疫情期間住院風險增加[4]。患者新冠疫情大流行期間，支氣管哮喘患者高感知壓力患病率為10.6%，創傷后壓力風險11.3%，抑郁風險31.5%，失眠風險57.7%[5]，已嚴重造成患者心理壓力。

苓桂術甘湯是我國歷史悠久的經典名方，出自漢代張仲景撰《金匱要略》[6]，為國家中醫藥管理局發布的《古代經典名方目錄（第一批）》[7]。此方可治療痰飲疾病，上溫心陽、下利水濕、中健脾土。苓桂術甘湯作為中藥復方在治療疾病中具有多靶點、多途徑、多方向等特點，在臨床診療中取得顯著成效[8]。

但目前仍少有文獻報道苓桂術甘湯對于新冠肺炎合并支氣管哮喘防治的作用機制，故本研究應用網絡藥理學方法，通過構建苓桂術甘湯有效活性成分-關鍵靶點-新冠肺炎合并支氣管哮喘疾病的多層次生物網絡，結合GO 富集分析和代謝途徑分析數據庫（KEGG）進行通路富集分析[9]，并用分子對接更好地補充驗證，為今后開創和研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數據庫

數據庫應用平臺：TCMSP 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（https：∥old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）；UnipProt 數據庫（https：∥www.uniprot.org/）；OMIM 人類孟德爾遺傳數據庫https：∥www.omim.org/）；Genecards 人類基因綜合數據庫（https：∥www.genecards.org/）；TTD 藥物靶點數據庫（https：∥db.idrblab.net/ttd/）；DisGeNET（https：∥www.disgenet.org/）；String 數據庫（https：∥cn.string-db.org/）；Metascape 數據庫（https：∥metascape.org/）；微生信（https：∥www.bioinformatics.com.cn/）；PDB 數據庫（https：∥www.rcsb.org/）；Cytoscape軟件（3.7.1）；Autodock1.5.7。

1.2 苓桂術甘湯活性成分的收集

利用TCMSP中藥系統藥理學數據庫與分析平臺收集苓桂術甘湯化合物，以茯苓、桂枝、白術、甘草為關鍵詞收集相關有效成分及相關靶點，篩選條件為生物口服利用度OB≥30%同時滿足類藥性DL 值≥0.18[10]。

1.3 苓桂術甘湯靶點收集

將收集的有效成分相關靶點應用Uniprot數據庫進行匹配篩選標準化基因命名。

1.4 疾病基因收集

以“bronchial asthma”和“COVID-19”為關鍵詞分別在OMIM 人類孟德爾遺傳數據庫、Genecards 人類基因綜合數據庫、TTD藥物靶點數據庫、DisGeNET數據庫獲得新冠肺炎和支氣管哮喘相關靶點及基因。

1.5 苓桂術甘湯與支氣管哮喘疾病共同靶點收集

將苓桂術甘湯和新冠肺炎合并支氣管哮喘疾病相關基因利用韋恩圖篩選共同基因靶點。

1.6 苓桂術甘湯與支氣管哮喘相互作用網絡分析

將化合物—疾病交集靶點提交到String 數據庫，限定物種為“人”（Homo sapiens），獲得靶點網絡互作分析。

1.7 富集分析

將苓桂術甘湯-新冠肺炎合并支氣管哮喘靶點提交到Metascape 數據庫進行細胞組成（cellular component，CC）、生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）的GO 富集分析和KEGG 通路分析。利用微生信平臺下載分析包，選取排名前10的進行GO富集分析和KEGG通路分析。

1.8 分子對接

利用分子對接技術，將網絡藥理篩選的活性成分和重要靶點的相互作用進行預測與驗證。從Pub-Chem 數據庫下載有效活性成分的分子結構型，從PDB數據庫下載核心蛋白結構域。運用PyMOL 軟件對蛋白質分子進行去水、加氫等操作。運用AutoDockTools 1.5.7 軟件將苓桂術甘湯活性成分及核心蛋白基因文件pdb 格式轉換為pdbqt 格式，使用軟件內盒子對接，將分子結構與蛋白質結構包裹進行對接，選擇合適的最佳對接位點。

2 結果

2.1 苓桂術甘湯治療支氣管哮喘靶點預測

通過TCMSP中藥系統藥理學數據庫與分析平臺收集苓桂術甘湯中同時滿足口服利用度OB≥30%和類藥性DL 值≥0.18的藥物有效活性成分共121個，其中茯苓15 個、桂枝7 個、白術7 個、甘草92 個，結果見表1。通過Genecards、OMIM、TTD、DisgeNET 數據庫獲取支氣管哮喘靶點共2115 個，新冠肺炎靶點1972個。將上述靶點互相匹配，共獲得58 個苓桂術甘湯治療支氣管哮喘潛在交集靶點，具體為：AR、DPP4、ADIPOQ、GSTM1、IKBKB、NFKBIA、NOS2、IL1B、RXRB、RAF1、SERPINE1、BAX、XDH、TNF、CHUK、IRF1、TGFB1、F10、MMP1、MMP3、F3、IL1A、AHR、CD40LG、CRP、ALOX5、MAPK1、ICAM1、IL10、CXCL2、IL6、HMOX1、CYP3A4、AKT1、RELA、NFE2L2、CCL2、EGFR、PLAU、VEGFA、SIRT1、CAT、MPO、THBD、BCL2、NOS3、SPP1、CXCL10、PON1、IL4、STAT1、STAT3、HIF1A、IFNG、HMGCR、PLAT、IL2、CXCL8，結果用圖1表示。

表1 苓桂術甘湯有效活性成分成分Tab.1 Active ingredients of Linggui Zhugan Decoction

圖1 苓桂術甘湯與支氣管哮喘疾病交集靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the intersection target of Linggui Zhuga Decoction and bronchial asthma disease

2.2 苓桂術甘湯成分靶點-支氣管哮喘疾病靶點網絡

首先將篩選的58 個交集靶點導入STRING 數據庫中，物種限定為“Homo sapiens”，得到潛在作用靶點的PPI網絡保存其TSV 格式文件。將信息導入Cytoscape 軟件作圖。每個靶點與其他靶點相連線段數量越多degree 值越大則說明該點越重要。通過degree 值比較篩選出10 個degree 值最高的靶點作為核心靶點。分別是TNF、IL6、AKT1、VEGFA、IL1B、CXCL8、STAT3、CCL2、ICAM1、IL10。排名前10 的靶點Degree值見表2。PPI網絡圖見圖2。

表2 苓桂術甘湯治療支氣管哮喘關鍵靶點拓撲學參數表Tab.2 Topological parameters of the key targets of Linggui Zhugan Decoction in the treatment of bronchial asthma

圖2 苓桂術甘湯蛋白網絡互作圖（PPI圖）Fig.2 Protein network interaction diagram of Linggui Zhugan Decoction（PPI diagram）

2.3 GO富集分析

在Metascape 基因富集分析網站中整理藥物靶點，在智人數據庫中分別進行GO 分子功能（GO MF）、GO生物過程（GO BP）、GO細胞組分（GO CC）以及KEGG 通路富集分析。通過微生信進行富集分析得到圖3。

圖3 GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis

2.4 KEGG通路富集分析

KEGG 通路富集分析共收集152 條通路，篩選出10 條關鍵通路。分別是AMPK 通路、NF-kappa B 通路、PI3K-Akt 通路、JAK-STAT 通路、mTOR 通路、Th17 細胞分化、MAPK 通路、TGF-β 通路、PD-L1/PD-1通路、COVID-19通路。如圖4、圖5所示。

<1)，且各件產品是否為不合格品相互獨立．

圖4 KEGG通路-靶點圖Fig.4 KEGG pathway-target map

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 藥物-活性成分-靶點-關鍵通路

基于以上結果，獲得藥物的活性成分、重要靶點和關鍵通路，導入Cytoscape 3.7.1 軟件，構建“藥物-活性成分-靶點-關鍵通路”網絡模型，進行Network Ananlyze分析。見圖6。

圖6 藥物-有效成分-靶點-關鍵通路圖Fig.6 Drug-active ingredient-target-key pathway diagram

2.6 分子對接

從PDB 數據庫中下載核心蛋白腫瘤因子（TNF）和白介素-6（IL-6）的3D信息結構，輸出pdb格式，并利用Autodock 1.5.7 軟件輸出pdbqt 格式。將網絡中度值最大的活性成分槲皮素（Quercetin）、山奈酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）分別與PPI網絡中確定的關鍵靶蛋白TNF 和IL6 進行分子對接分析，這些小分子化合物通過氫鍵結合到目標蛋白上，這是一種靜電相互作用。在分子對接評分中，對接分數越低、構象越穩定，則結合活性越好，分子對接結合能均小于-5 kcal/mol。結果見圖7和表3。

表3 苓桂術甘湯核心蛋白與核心有效成分結合能對接表Tab.3 Connection table of binding energy between core protein and core active ingredients of Linggui Zhugan decoction

圖7 槲皮素、山奈酚、β-甾醇與關鍵靶蛋白TNF、IL6相互作用示意圖Fig.7 Quercetin，kaempferol β-Schematic diagram of interaction between sterols and key target proteins TNF and IL6

3 討論

苓桂術甘湯由四種不同的草藥制成，即茯苓的干菌核、桂枝（肉桂的干枝）、白術（白術的干根莖）和甘草（甘草的干根和根莖）。此方以茯苓為君藥，茯苓性甘淡，祛邪又扶正，實為利水之要藥；桂枝甘溫，溫脾以助水，溫腎又祛邪；白術為補氣健脾之要藥，性苦溫燥濕，甘溫補脾，祛邪兼扶正；甘草性甘補脾；茯苓、桂枝相配利水以平沖，白術伍甘草健脾以降逆，桂枝、甘草相配加強通陽之效[11]。苓桂術甘湯具有治療多種疾病的作用，如非酒精性肝炎、心力衰竭、心梗后心室重構、糖尿病、阿爾茲海默癥[12-13]等。

為了進一步研究與探討苓桂術甘湯治療新冠合并支氣管哮喘的藥效基礎和潛在的生物學機制，本研究利用網絡藥理學技術篩選出有效成分及藥效靶點與疾病靶點，構建PPI 網絡，運用基因靶點富集分析及通路預測等手段，得到槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等核心活性成分。苓桂術甘湯治療新冠肺炎合并支氣管哮喘的靶基因作用網絡以TNF 與IL6為核心，TNF 與IL6 作為炎癥因子對氣道損傷危害較大，持續性刺激呼吸道黏膜呈現高敏反應，使患者出現呼吸困難。槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇具有抗炎、提高免疫力、抗腫瘤的作用。槲皮素通過下調IL-4、IL-5、miR-155 的水平來改善卵清蛋白致使小鼠哮喘模型，對氣道炎癥水平有抑制作用，促使氣道重塑[14]。槲皮素與山奈酚具有抗氧化、細胞保護、抗炎等作用，山奈酚在一定條件下抗氧化能力是槲皮素的100倍，抗炎特性明顯增強[18]。在COVID-19 期間，SARS-CoV-2 感染可刺激PI3K-Akt 通路、JAK-STAT通路、mTOR 通路、MAPK 通路等多條信號通路，山奈酚被作為植物中提取的植物化學物質可能是對抗新冠肺炎的潛在候選藥物[15]。在KEGG 富集分析中存在PI3K-Akt 通路、JAK-STAT 通路、mTOR 通路、MAPK 通路以及COVID-19 通路，因此苓桂術甘湯可為改善新冠肺炎合并支氣管哮喘的潛在中藥復方。

分子對接通過小分子配體和大分子受體，通過一系列對接選擇合適的藥物對接位點，并預測其親和力，尋找受體小分子化合物與靶標大分子作用的最佳構象。在本文的所有配體化合物中，與TNF 和IL6 受體蛋白結合最穩定的為槲皮素，結合能為-7 kcal/mol。文獻報道其IL6 可通過一定的信號通路對CVA大鼠具有較好的抗炎作用[16]。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學結合分子對接技術對苓桂術甘湯治療新冠肺炎合并支氣管哮喘的潛在藥效成分、關鍵靶點及作用機制進行了初步預測，發現苓桂術甘湯治療支氣管哮喘具有調節多條信號通路的協同效應。所以，苓桂術甘湯可能通過影響機體細胞增殖分化、腫瘤因子及炎癥、癌癥的產生等多維度協同發揮平喘作用，為進一步實驗驗證苓桂術甘湯改善支氣管哮喘的作用機制提供理論依據。