模擬增溫對(duì)木荷葉際抗生素抗性基因的影響

林小如,李子歆,孫安琪,金圣圣,徐超蝶,陳仕東,2,劉小飛,2,沈菊培*

模擬增溫對(duì)木荷葉際抗生素抗性基因的影響

林小如1,李子歆1,孫安琪1,金圣圣1,徐超蝶1,陳仕東1,2,劉小飛1,2,沈菊培1*

(1.福建師范大學(xué)濕潤(rùn)亞熱帶山地生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,福建師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院/碳中和未來技術(shù)學(xué)院,福建 福州 350007；2.福建三明森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站,福建 三明 365002)

為探究增溫對(duì)葉際抗生素抗性基因(ARGs)分布的影響及其季節(jié)變化特征,本研究在夏季、秋季和冬季3個(gè)季節(jié)采集木荷葉片樣品,設(shè)置對(duì)照(土壤不增溫)與增溫(土壤增溫4℃)兩個(gè)處理,采用高通量熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定葉際ARGs的種類及相對(duì)豐度.結(jié)果表明:在所有葉際樣品中共檢測(cè)到255種ARGs和10種MGEs,其中多重耐藥類是葉際優(yōu)勢(shì)抗生素抗性基因類型,相對(duì)豐度占總體的47.4%,而抗生素外排泵為主要抗性機(jī)制.方差分析和主坐標(biāo)分析表明季節(jié)對(duì)葉際抗性基因的分布有顯著影響,秋季和冬季葉際ARGs的相對(duì)豐度分別為(0.614±0.303)拷貝/16S rRNA和(0.589±0.218)拷貝/16S rRNA,高于夏季((0.291±0.101)拷貝/16S rRNA),且ARGs多樣性同樣表現(xiàn)為秋冬季高于夏季.研究檢測(cè)到7種抗性基因(2-03-02-01-01-02)的相對(duì)豐度在增溫處理中顯著下降(<0.05),而僅有-01基因相對(duì)豐度顯著上升(<0.05).冗余分析和結(jié)構(gòu)方程模型顯示,季節(jié)通過改變土壤理化性質(zhì)間接影響葉際ARGs的分布,而增溫對(duì)其沒有產(chǎn)生顯著影響.

抗生素抗性基因；季節(jié)變化；植物葉際；全球氣候變化

抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用對(duì)提高人類健康和壽命有非常重要的作用,但近年來由于其在醫(yī)療、畜牧養(yǎng)殖中的濫用,導(dǎo)致大量抗生素耐藥菌的出現(xiàn),引起社會(huì)對(duì)抗生素及抗生素抗性基因(ARGs)的重視和關(guān)注[1-2].由于微生物的內(nèi)在抗性,土壤環(huán)境中本身就存在大量ARGs[3].通過對(duì)我國(guó)跨域近4000km天然森林生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)[4],森林土壤中存在8個(gè)大類共計(jì)160余種ARGs,且ARGs多樣性與草本植物多樣性、細(xì)菌多樣性及可移動(dòng)遺傳元件(MGEs)多樣性顯著相關(guān).另外,環(huán)境中的ARGs可借助MGEs,如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等在同種甚至不同種細(xì)菌之間實(shí)現(xiàn)水平基因轉(zhuǎn)移(HGT),從而加快了ARGs的傳播和擴(kuò)散,對(duì)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生潛在的危害,故ARGs被認(rèn)為是一種新型的生物污染物[5].因此,認(rèn)識(shí)和探究ARGs的分布及其對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境和人類健康具有重要作用.

葉際由植物地上部分組成,以葉片為主[6].據(jù)估計(jì),全球植物葉表面積達(dá)108km2,每km2包含細(xì)菌數(shù)量超過1016[6-7].葉際微生物是環(huán)境中ARGs的重要儲(chǔ)存庫(kù)[3,8-9].通過對(duì)比分析不同來源的生菜葉片ARGs[10],共檢測(cè)到134種ARGs和6種MGEs,其絕對(duì)拷貝數(shù)達(dá)1.76×108.葉際是一個(gè)相對(duì)開放的生境,與土壤、大氣等外界環(huán)境緊密聯(lián)系.攜帶ARGs的土壤微生物可通過根內(nèi)-葉內(nèi)-葉際的植物體內(nèi)途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)移,也能借助大氣氣溶膠以植物體外遷移途徑到達(dá)葉表[11-12].同時(shí),宿主植物周圍的環(huán)境因子,包括溫度、太陽輻射、濕度、土壤類型等非生物因素,以及植物種類和基因型、對(duì)資源分泌物(如初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物)的適應(yīng)性等生物因素,也會(huì)影響葉際微生物的組成[6,13].例如,植物葉片在生長(zhǎng)過程會(huì)釋放揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs),其中萜烯類VOCs具有抗菌作用,可能會(huì)抑制葉際細(xì)菌活性[14-15].微生物群落結(jié)構(gòu)是ARGs組成的決定因素,因此環(huán)境因子會(huì)通過葉際微生物對(duì)葉際ARGs產(chǎn)生影響.由此可見,葉際ARGs種類豐富,相對(duì)豐度高,且易受外界環(huán)境的影響,具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)[9].目前已有大量的研究報(bào)道農(nóng)作物葉際ARGs的賦存情況,但對(duì)受人類影響較小的森林生態(tài)系統(tǒng)樹木葉際ARGs的分布還知之甚少[8].

據(jù)IPCC預(yù)計(jì)到21世紀(jì)末,全球平均氣溫將上升2.6～4.8 ℃[16].氣候變暖作為全球氣候變化的一個(gè)主要特征,對(duì)元素循環(huán)和陸地生態(tài)系統(tǒng)的功能產(chǎn)生重要影響[17],進(jìn)而改變植物群落組成和葉際微生物組[13].一方面,增溫會(huì)改變植物根系營(yíng)養(yǎng)吸收狀況,影響葉際微生物組成,使其攜帶的ARGs可能發(fā)生改變.另一方面,增溫會(huì)直接影響微生物的生長(zhǎng)速率和群落結(jié)構(gòu)[18-19],提高水平基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[20].因此,增溫會(huì)直接或間接地影響葉際ARGs 組成.有研究發(fā)現(xiàn)土壤增溫4℃將導(dǎo)致部分天然林和人工林土壤ARGs相對(duì)豐度顯著增加[21].另有研究采用黃河水進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)ARGs的豐度隨著溫度升高而增加[22].然而,目前僅有關(guān)于增溫對(duì)土壤和水體ARGs影響的研究[21-22],卻鮮有關(guān)注增溫對(duì)葉際ARGs多樣性和豐度的報(bào)道.除了溫度外,季節(jié)變化也被認(rèn)為是影響葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[23-24].因此,研究季節(jié)變化對(duì)ARGs的影響,可以更加全面地了解增溫背景下抗生素抗性組的分布和變化特征.

亞熱帶森林是我國(guó)典型的森林生態(tài)系統(tǒng),具有重要的生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能,對(duì)全球變暖的響應(yīng)十分敏感[25].木荷()作為亞熱帶常綠闊葉林中分布最為廣泛的優(yōu)勢(shì)樹種之一,具有重要生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在我國(guó)南方林業(yè)和亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位.因此,本文依托福建省三明市長(zhǎng)期土壤增溫實(shí)驗(yàn)平臺(tái),以亞熱帶天然林木荷葉片為研究對(duì)象,運(yùn)用高通量熒光定量PCR技術(shù)分析增溫對(duì)葉際ARGs豐度和多樣性的影響及季節(jié)變化特征,同時(shí)分析環(huán)境因子對(duì)ARGs組成的影響,為闡明氣候變暖情景下環(huán)境ARGs的傳播擴(kuò)散機(jī)制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究地概況與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)區(qū)位于福建三明森林生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站的格氏栲天然林增溫平臺(tái)(26?9?～26?12?N,117?27?～117?29?E).該地區(qū)地貌以低山丘陵為主,海拔250～500m,屬中亞熱帶型季風(fēng)氣候,年均溫19.5 ℃,年均降水量1700mm.增溫平臺(tái)試驗(yàn)地的相對(duì)濕度為81%.研究區(qū)內(nèi)以黃崗巖發(fā)育的黃壤和紅壤為主.植被類型屬亞熱帶常綠闊葉林,主要為格氏栲(),其他樹種包括米櫧()、木姜子()、木荷()、杜英()等.

研究于2014年10月在格氏栲天然林隨機(jī)設(shè)置10個(gè)6m×6m的試驗(yàn)樣地,設(shè)增溫(+4 ℃)和對(duì)照(不增溫)兩種處理,每種處理5個(gè)重復(fù).土壤增溫處理,在樣地地面以下10cm處鋪設(shè)平行電纜進(jìn)行加熱,相鄰電纜的距離為20cm[21].同時(shí)在每個(gè)樣地布設(shè)多個(gè)溫度和濕度傳感器來監(jiān)測(cè)不同土層的土壤溫、濕度的變化.增溫平臺(tái)樣地于2015年10月開始增溫,期間盡量減少外來擾動(dòng)對(duì)土壤的影響.

1.2 樣品采集與處理

分別于2019年7月(夏季)、2019年10月(秋季)、2020年1月(冬季)在每個(gè)樣地中采集葉際與土壤樣品.每個(gè)樣地隨機(jī)選取幾棵長(zhǎng)勢(shì)一致的木荷,在同一高度處(距地面1.4～1.6m,避免高度過低受到土壤影響),剪取20g成熟葉片放入自封袋中[26],同一樣地葉片混合為一個(gè)葉際樣品.同時(shí),每個(gè)樣地用直徑5cm的土芯取樣器隨機(jī)取5點(diǎn)采集0～15cm的表層土壤,同一樣地的5份土壤混合成一個(gè)土樣.葉際樣品和土壤樣品均在冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室.葉際樣品保存于-20℃的冰箱用于DNA提取.土壤樣品過 2mm篩,4℃保存用于理化性質(zhì)分析.

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤含水量用烘干法測(cè)定.土壤pH值(土水比為1:5)用pH計(jì)(FE20Mettler Toledo,德國(guó))測(cè)定.土壤銨態(tài)氮(NH4+-N)和硝態(tài)氮(NO3--N)用2mol/L的KCl進(jìn)行浸提(土水比為1:4),振蕩離心后通過0.45 μm濾膜用連續(xù)流動(dòng)分析儀(Skalar San++,荷蘭Skalar)測(cè)定.土壤微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸K2SO4浸提法,再分別用總有機(jī)碳分析儀(TOC-VCPH/CPN,日本Shimadzu)和連續(xù)流動(dòng)分析儀(Skalar San++,荷蘭Skalar)測(cè)定.土壤總氮(TN)和總碳(TC)使用碳氮元素分析儀(Vario MAX C / N,德國(guó)Elementar)測(cè)定.土壤可溶性有機(jī)碳(DOC)和可溶性有機(jī)氮(DON)用去離子水(土水比為1:4)浸提,分別用總有機(jī)碳分析儀(TOC-VCPH/CPN,日本Shimadzu)和連續(xù)流動(dòng)分析儀(Skalar San++,荷蘭Skalar)測(cè)定.土壤理化性質(zhì)的詳細(xì)信息見表1[21].

1.4 葉際DNA提取

將5g木荷葉片剪碎后置入250mL錐形瓶,加入100mL滅菌磷酸緩沖鹽溶液,超聲5min,然后置于搖床中180r/min振蕩1h后取出[10].用滅菌紗布過濾出植物組織,濾液全部通過0.22 μm濾膜.剪碎濾膜后用FastDNA Spin試劑盒(美國(guó)MP Biomedicals)提取植物葉際 DNA,并用紫外分光光度計(jì)ND-1000測(cè)定DNA濃度及純度,儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用.

1.5 ARGs與MGEs的高通量熒光定量PCR分析

利用WaferGen SmartChip Real-time PCR Systems高通量熒光定量PCR分析平臺(tái)測(cè)定天然林葉際微生物所攜帶的ARGs與MGEs多樣性(即檢測(cè)到的靶基因數(shù)目)和豐度.PCR過程中設(shè)置296對(duì)引物,包括285個(gè)環(huán)境中廣泛存在的ARGs(涵蓋9類常見抗生素:氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺-鏈陽霉素B類、磺胺類、四環(huán)素類、萬古霉素類、多重耐藥類和其他類)、10個(gè)MGEs基因(2個(gè)整合子基因、8個(gè)轉(zhuǎn)座子基因)和1個(gè)16S rRNA基因.WaferGen平臺(tái)一次可進(jìn)行5184個(gè)反應(yīng),每個(gè)PCR反應(yīng)100nL.PCR反應(yīng)體系為: 25μL TB Green Premix Ex TaqII,前后引物各0.4μL, DNA模板1μL,RNA-free water 0.7μL.熱循環(huán)過程: 95℃預(yù)變性10min;95℃變性30s,60℃退火延30s,共40個(gè)循環(huán).T值為PCR反應(yīng)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù).根據(jù)儀器的檢測(cè)限和靈敏度,設(shè)置T值的檢測(cè)閾值為31.每個(gè)樣品包含3個(gè)技術(shù)重復(fù),3次重復(fù)T值均小于31時(shí)認(rèn)為是陽性擴(kuò)增.

采用2-?CT法計(jì)算每個(gè)樣品中ARGs和MGEs的相對(duì)豐度,其中ΔT=(T detected ARGs-T 16S rRNA gene)[27].

1.6 數(shù)據(jù)分析與繪圖

采用重復(fù)測(cè)量方差分析以探究季節(jié)和增溫處理及其交互作用對(duì)葉際ARGs的影響.利用單因素方差分析(one-way ANOVA)和多重比較檢驗(yàn)不同季節(jié)及各處理之間ARGs的差異.利用Levene′s法檢驗(yàn)方差齊性,方差齊性時(shí)使用鄧肯法進(jìn)行多重比較,方差不齊時(shí)則使用塔姆黑尼T2進(jìn)行多重比較.使用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析增溫處理對(duì)于ARGs亞型的影響.上述統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均在SPSS 26中進(jìn)行.冗余分析(RDA)和主坐標(biāo)分析(PCoA)分別采用R 4.2.2的vegan軟件包的rda函數(shù)和pcoa函數(shù)進(jìn)行.結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)使用AMOS 25 生成,其中數(shù)據(jù)包括增溫處理(設(shè)置為種類變量,對(duì)照處理為0,增溫處理為1)、季節(jié)因素(采用采樣月平均溫度)、土壤理化性質(zhì)(選取10個(gè)土壤理化性質(zhì)指標(biāo)的主坐標(biāo)分析第一主成分作為結(jié)構(gòu)方程模型分析數(shù)據(jù))、MGEs及ARGs的相對(duì)豐度.合格模型需滿足以下標(biāo)準(zhǔn):(1)非顯著性2檢驗(yàn):>0.05;(2)近似誤差均方根RMSEA<0.08;(3)擬合優(yōu)度指數(shù)GFI>0.9;(4)比較擬合指數(shù)CFI>0.9.應(yīng)用Origin 2021繪制餅圖、柱狀圖與箱線圖,采用R 4.2.2進(jìn)行主坐標(biāo)分析和冗余分析可視化.

表1 不同處理土壤基本理化性質(zhì)和月平均溫度的季節(jié)差異[21]

2 結(jié)果與分析

2.1　葉際ARGs和MGEs多樣性和豐度

采用高通量定量PCR技術(shù),在木荷葉際樣品中共檢測(cè)到255種ARGs和10種MGEs,表明ARGs在受人類干擾較少的自然環(huán)境中廣泛存在.如圖1(a)所示,各樣本中檢測(cè)到的ARGs數(shù)量范圍為77～115種,其中多重耐藥類(48種)和β-內(nèi)酰胺類(47種)的數(shù)量最多,其他數(shù)量較高的ARGs包括MLSB類(42種)、氨基糖苷類(32種).在相對(duì)豐度組成方面,9類ARGs中相對(duì)豐度占比較高的為多重耐藥類(47.4%)、β-內(nèi)酰胺類(20.3%)和氨基糖苷類(11.8%)(圖1b),表明多重耐藥類ARGs為葉際優(yōu)勢(shì)ARGs類型.ARGs主要抗性機(jī)制包括:抗生素失活機(jī)制(104種)、抗生素外排泵機(jī)制(78種)、細(xì)胞核糖體保護(hù)機(jī)制(64種),其中抗生素外排泵的相對(duì)豐度最高(52.8%)(圖1c,d),在ARGs的抗性機(jī)制中占主導(dǎo)地位,其次為抗生素失活機(jī)制(35.6%).

圖1 不同種類的ARGs多樣性、相對(duì)豐度占比和不同抗生素抗性機(jī)制的多樣性、相對(duì)豐度占比

ARGs在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移主要由MGEs介導(dǎo).在檢測(cè)到的10種MGEs中,包含2個(gè)整合子基因()和8個(gè)轉(zhuǎn)座子基因().整合子基因的相對(duì)豐度占比達(dá)97%,其次為整合子基因(2%),這表明基因在MGEs中具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位.

2.2 不同季節(jié)與增溫處理對(duì)于 ARGs 與 MGEs 多樣性及豐度的影響

總體上看,冬季木荷葉際ARGs數(shù)量顯著高于夏季(0.05),秋季和冬季ARGs相對(duì)豐度顯著高于夏季(0.05),而MGEs數(shù)量和相對(duì)豐度在不同季節(jié)間均無顯著差異(0.05)(圖2),說明季節(jié)對(duì)ARGs的影響較大.同一季節(jié)不同處理間,秋季增溫ARGs相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照(0.05),而夏季MGEs數(shù)量則表現(xiàn)為增溫顯著高于對(duì)照(0.05).

圖2 不同季節(jié)與處理葉際中ARGs和MGEs的多樣性、相對(duì)豐度

表2 重復(fù)測(cè)量方差分析季節(jié)、增溫對(duì)ARGs和MGEs的多樣性和相對(duì)豐度的影響

注:表中加粗?jǐn)?shù)字和*表示<0.05.

具體來說,對(duì)照處理葉際磺胺類ARGs數(shù)量、萬古霉素類ARGs相對(duì)豐度及整合子類MGEs數(shù)量均表現(xiàn)為秋季顯著高于夏季(<0.05),-內(nèi)酰胺類ARGs相對(duì)豐度為冬季顯著高于夏季(<0.05).而增溫處理葉際氨基糖苷類ARGs數(shù)量冬季顯著高于夏季和秋季(0.05),整合子類MGEs數(shù)量在夏季和冬季顯著高于秋季(0.05).大部分ARGs的數(shù)量和相對(duì)豐度在同一季節(jié)不同處理間無顯著差異(>0.05),僅秋季四環(huán)素類ARGs相對(duì)豐度的增溫顯著低于對(duì)照(<0.05).在MGEs中,夏季整合子類數(shù)量的增溫顯著高于對(duì)照(<0.05),但其秋季的增溫顯著低于對(duì)照(<0.05).這意味著增溫對(duì)MGEs的作用會(huì)受到季節(jié)影響.

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示,季節(jié)對(duì)ARGs數(shù)量和相對(duì)豐度產(chǎn)生了顯著影響(<0.05),而增溫對(duì)MGEs數(shù)量有顯著影響(<0.05)(表2).另外,季節(jié)與增溫的交互作用對(duì)ARGs及MGEs的數(shù)量和相對(duì)豐度均無顯著影響(>0.05).基于ARGs相對(duì)豐度進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)(圖3),結(jié)果發(fā)現(xiàn)主成分PC1和PC2對(duì)ARGs分布變異的解釋分別為25.6%和12.8%.從圖中可以看出不同季節(jié)葉際ARGs有明顯差異(Adonis test,<0.001),主要表現(xiàn)在夏季和其他兩個(gè)季節(jié)間的差異,而對(duì)照和增溫處理之間則差異不顯著(Adonis test,>0.05).

進(jìn)一步對(duì)所有 ARGs 亞型的相對(duì)豐度進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)8 種ARGs在對(duì)照和增溫處理之間相對(duì)豐度差異顯著(<0.05),表明其對(duì)溫度變化較為敏感(圖4).這8種ARGs亞型分別屬于多重耐藥類、氨基糖苷類、MLSB類和四環(huán)素類.其中,僅在增溫處理下顯著富集(<0.05),其余7種 ARGs亞型(包括)的相對(duì)豐度則在增溫處理下顯著下降(<0.05),說明增溫對(duì)不同種類ARGs的影響存在差異.

圖3 基于Bray-Curtis距離的不同季節(jié)和處理的ARGs主坐標(biāo)分析

三角形為增溫處理,正方形為對(duì)照

圖4 對(duì)溫度敏感的葉際ARGs亞型的對(duì)照和增溫處理的相對(duì)豐度

2.3 環(huán)境因子對(duì)ARGs的影響

為探究不同因子對(duì)木荷葉際ARGs的影響,本文將土壤理化性質(zhì)、MGEs、月平均溫度與ARGs相對(duì)豐度進(jìn)行spearman相關(guān)性分析.結(jié)果表明總ARGs數(shù)量、總ARGs相對(duì)豐度與DOC分別呈顯著(<0.05)和極顯著正相關(guān)(<0.01),而總ARGs數(shù)量、總ARGs相對(duì)豐度與SMC、DON、MBN、MMT呈顯著(<0.05)或極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)(表3),并分別與MBC、pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01).這意味著總ARGs數(shù)量和相對(duì)豐度受到多種環(huán)境因子的影響.不同季節(jié)中,夏季ARGs相對(duì)豐度與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05).秋季、冬季ARGs數(shù)量與DON呈顯著(<0.05)和極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01).冬季ARGs相對(duì)豐度與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、TN和TC顯著正相關(guān)(<0.05).說明不同季節(jié)ARGs的主要影響因子不同.在所有環(huán)境因子中,僅MGEs與ARGs各種指標(biāo)均無顯著關(guān)系,可能是因?yàn)榧竟?jié)對(duì)MGEs的影響不顯著.

選取主要土壤性質(zhì)、月平均溫度和MGEs與ARGs相對(duì)豐度進(jìn)行冗余分析.由圖5可得,第1和第2排序軸分別解釋了葉際ARGs組成分布差異的25.77%和17.91%.夏季ARGs與秋季、冬季ARGs沿第1排序軸明顯分開.影響ARGs組成的主要環(huán)境因子為DON、DOC、MBN和MMT,而pH值、MGEs和銨態(tài)氮的影響較小.

表3 ARGs數(shù)量、相對(duì)豐度與環(huán)境因子的spearman相關(guān)系數(shù)

注: * 和加粗?jǐn)?shù)字表示<0.05, ** 表示<0.01.

圖5 環(huán)境因子與ARGs的冗余分析

三角形表示增溫處理,正方形為對(duì)照

采用結(jié)構(gòu)方程模型進(jìn)一步解釋季節(jié)、增溫處理、土壤理化性質(zhì)與MGEs對(duì)ARGs作用的效應(yīng)(圖6).為了降低模型的復(fù)雜性,使用2001～2019年三明1月、7月和10月的月平均溫度(分別為10 ,29 ,22 ℃)代表季節(jié)因子,且對(duì)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行主坐標(biāo)分析并提取第一主成分作為SEM分析的土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù).土壤理化性質(zhì)第一主成分解釋總變異的48.29%,因此提取的變量能較好地反映相關(guān)數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn).最終SEM解釋了葉際ARGs變化的29.2%.通過模型計(jì)算和評(píng)估,結(jié)果顯示模型參數(shù)為= 1.00,GFI = 1.00,CFI = 1.00,RMSEA = 0.00,表明所建的結(jié)構(gòu)方程模型較為可靠.在4個(gè)環(huán)境因子中,對(duì) ARGs 影響最大的因素為季節(jié)因素,對(duì)ARGs具有間接的負(fù)效應(yīng).其次為土壤理化性質(zhì),對(duì)ARGs的影響主要為直接正效應(yīng).模型的所有路徑中僅季節(jié)因素對(duì)土壤理化性質(zhì)具有極顯著負(fù)作用(<0.01),其余路徑作用效果不顯著.這意味著季節(jié)因素可能通過土壤理化性質(zhì)而間接影響葉際ARGs組成.MGEs對(duì)ARGs的影響為直接正效應(yīng).增溫處理對(duì)ARGs的影響為直接負(fù)效應(yīng),與月平均溫度和總ARGs數(shù)量、相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)一致.

圖6 結(jié)構(gòu)方程模型解析不同因子對(duì)ARGs分布的影響

虛線箭頭表示路徑系數(shù)為正, 實(shí)線箭頭表示路徑系數(shù)為負(fù), *表示路徑系數(shù)顯著(<0.05)

3 討論

3.1 葉際ARGs的多樣性和相對(duì)豐度

以往關(guān)于土壤-植物系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)土壤比葉際含有更豐富的ARGs和MGEs種類[11,28–30],而在本研究亞熱帶天然林木荷葉際上檢測(cè)到255種ARGs和10種MGEs,說明亞熱帶天然林中葉際ARGs的多樣性比土壤豐富[21].Do等[31]同樣發(fā)現(xiàn)草地植物葉際ARGs、MGEs和細(xì)菌多樣性比土壤高,表明葉際ARGs組成受多種因子的影響[12].本研究葉片采集高度為1.4～1.6m之間,取成熟的中間層葉片,采樣部位能有效避免來自土壤顆粒的影響.此外,有學(xué)者認(rèn)為在貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中,微生物是通過釋放抗生素裂解敏感菌株而獲得到營(yíng)養(yǎng),為生存提供了物質(zhì)[32].植物葉際生存條件苛刻,葉際微生物不僅面臨水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足、劇烈變化的強(qiáng)光、高溫和高紫外線照射等問題,還要面對(duì)植物或其他微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)[6].因此,葉際微生物在惡劣的葉際環(huán)境會(huì)釋放更多的抗生素,增加環(huán)境對(duì)ARGs的選擇壓力,導(dǎo)致葉際ARGs多樣性較高.本研究中,葉際ARGs的優(yōu)勢(shì)抗性基因種類為多重耐藥類,這與已有研究一致[12,33-34].需要注意的是,攜帶多重耐藥類基因的微生物會(huì)對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性從而成為超級(jí)細(xì)菌,對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅.在抗性機(jī)制方面,抗生素外排泵類和抗生素失活類的ARGs(共計(jì)88.4%)占主導(dǎo)地位,這可能是因?yàn)橥馀疟迷谂懦股氐耐瑫r(shí)排出重金屬和其他有毒分子,從而有助于微生物更好地適應(yīng)不利環(huán)境條件[35].在大多數(shù)情況下,它是土壤中主要的抗性機(jī)制[12],而抗生素失活機(jī)制是細(xì)菌通過對(duì)抗生素的降解或取代活性基團(tuán)來改變抗生素的結(jié)構(gòu),使抗生素失活.其中,產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶使β-內(nèi)酰胺類抗生素失活是細(xì)菌耐藥的最常見和最重要的機(jī)制,而在本研究中β-內(nèi)酰胺類ARGs相對(duì)豐度占比達(dá)20.3%的研究結(jié)果也佐證了以上推測(cè).已在各種環(huán)境中被頻繁檢出,人類活動(dòng)(如醫(yī)院污水、工業(yè)污染等)可導(dǎo)致大量的釋放,因此與人類活動(dòng)緊密相關(guān)[36-37].本文發(fā)現(xiàn)基因豐度占所測(cè)的10種MGE的97%,這意味天然林植被ARGs具有較高的傳播潛力[8].在One Health視角下,不僅要制定防止ARGs在人類活動(dòng)場(chǎng)所中傳播的對(duì)策,還需要研究控制抗性基因在野外傳播擴(kuò)散的措施,這對(duì)人類和動(dòng)物的健康具有重要影響[3,38].

3.2 增溫對(duì)ARGs分布的影響

隨著抗生素耐藥性問題的日漸嚴(yán)重及全球氣候的持續(xù)變化,人們?cè)絹碓疥P(guān)注這兩個(gè)全球性問題之間的潛在聯(lián)系.已有研究發(fā)現(xiàn)氣溫升高與人類常見病原體的抗生素耐藥性上升和抗生素耐藥率增加相關(guān)[39-40].然而本研究發(fā)現(xiàn),增溫對(duì)葉際總ARGs的多樣性和相對(duì)豐度無顯著影響,但月平均溫度與總ARGs數(shù)量和相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān).這可能是因?yàn)槿~際溫度主要受大氣溫度影響[41],土壤增溫對(duì)植物葉際ARGs的直接影響較小.研究中增溫對(duì)MGEs數(shù)量有顯著影響,ARGs與MGEs并無顯著相關(guān).這表明增溫并未通過影響MGEs進(jìn)而影響ARGs.本文前期關(guān)于增溫對(duì)土壤ARGs和MGEs的研究中也得到類似的結(jié)果[21].同時(shí),發(fā)現(xiàn)不同種類ARGs對(duì)溫度的響應(yīng)不同.大部分ARGs亞型的對(duì)照與增溫處理間無顯著差異.在檢測(cè)到的255種ARGs中,僅7 種 ARGs亞型(包括和)的相對(duì)豐度在增溫處理下顯著降低,基因則在增溫處理下顯著富集.Yu等[22]和Yang等[42]通過宏基因組測(cè)序技術(shù)探究黃河水ARGs對(duì)系列溫度梯度(23,26,29,32,35℃)的響應(yīng),同樣發(fā)現(xiàn)少量ARGs和MGEs對(duì)溫度變化較為敏感,但增溫會(huì)導(dǎo)致某些高風(fēng)險(xiǎn)ARGs豐度上升.Li等[21]前期研究也發(fā)現(xiàn)增溫使8種天然林土壤ARGs亞型的相對(duì)豐度顯著上升.這可歸因于攜帶ARG微生物的熱敏感性不同.增溫會(huì)導(dǎo)致更適應(yīng)環(huán)境變化的細(xì)菌類群數(shù)量增多[19],或影響細(xì)胞膜的通透性,使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性和代謝酶失活,導(dǎo)致一些敏感微生物無法生存[22],從而改變?nèi)~際細(xì)菌群落組成.亞熱帶木荷葉際細(xì)菌門水平上,變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門的豐度較高[43],且研究表明增溫處理導(dǎo)致放線菌門的相對(duì)豐度顯著增加,變形菌門的相對(duì)豐度顯著減少[19].因此在木荷葉際中,增溫可能通過改變不同類型ARGs宿主菌豐度使相應(yīng)ARGs的豐度上升或下降.必須注意的是,葉際微生物中人類病原體、動(dòng)物寄生蟲或共生體等功能分組的相對(duì)豐度則在增溫處理下顯著增加[19].這將增加ARGs進(jìn)入人類或動(dòng)物致病菌的風(fēng)險(xiǎn),所以我們?nèi)匀徊豢珊鲆曉鰷貤l件下ARGs對(duì)人類健康的影響.盡管已有一些研究發(fā)現(xiàn)增溫會(huì)影響樹木葉片生理特征,進(jìn)而影響葉際微生物,而對(duì)ARGs產(chǎn)生潛在的影響[44-46],然而,迄今尚缺乏直接證據(jù)證明增溫可以通過影響宿主植物的生理狀態(tài)而間接影響葉際ARGs的組成,相關(guān)內(nèi)容有待未來進(jìn)一步研究.總之,溫度對(duì)于ARGs的作用是一個(gè)復(fù)雜的過程,具體影響機(jī)制還需要深入研究和探討,以便更好應(yīng)對(duì)全球變暖情境下的抗生素耐藥問題.

3.3 季節(jié)對(duì)ARGs的影響

方差分析和PCoA結(jié)果表明,葉際ARGs的組成具有季節(jié)性差異,具體表現(xiàn)為冬季和秋季ARGs的多樣性和相對(duì)豐度高于夏季.微生物群落結(jié)構(gòu)是ARGs組成變化的重要驅(qū)動(dòng)因素,葉際ARGs的季節(jié)差異性可能源于植物葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化[23-24].這種季節(jié)動(dòng)態(tài)受到溫度、太陽輻射、水分可利用性等環(huán)境因素,與植物生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的碳水化合物、有機(jī)酸、揮發(fā)性有機(jī)物等影響[6,41,47]. Pe?uelas等[48]報(bào)道,在地中海夏季惡劣環(huán)境條件下,葉際細(xì)菌和真菌群落的豐富度和均勻度低于春季.研究發(fā)現(xiàn)木荷枝葉VOCs以萜烯類化合物為主,秋季的萜烯類化合物的總相對(duì)含量較低[49].因此,夏季較高的溫度與釋放較多的萜烯類VOCs,可能導(dǎo)致葉際細(xì)菌多樣性下降,降低了夏季葉際的ARGs多樣性和相對(duì)豐度.

除生物因素外ARGs 也會(huì)受到環(huán)境因子的直接影響.例如水庫(kù)中的 ARGs 的豐度和總基因拷貝數(shù)與水質(zhì)富營(yíng)養(yǎng)元素TN,TP,TOC和重金屬含量顯著相關(guān)[50-51].土壤的鹽濃度,pH 值以及營(yíng)養(yǎng)狀況的改變會(huì)使細(xì)菌群落發(fā)生變化并且進(jìn)一步影響抗生素耐藥性[52-53].Li等[21]利用隨機(jī)森林模型發(fā)現(xiàn)DOC和銨態(tài)氮是預(yù)測(cè)土壤ARGs組成變化主要的非生物因子.本研究也發(fā)現(xiàn),總ARGs數(shù)量和相對(duì)豐度與多個(gè)土壤理化指標(biāo)顯著相關(guān),且冗余分析表明DON、DOC和MBN是主要預(yù)測(cè)因子.當(dāng)環(huán)境因素季節(jié)變化將會(huì)導(dǎo)致ARGs的季節(jié)性變化[54].本研究中,夏季ARGs相對(duì)豐度與pH值呈顯著負(fù)相關(guān),而秋冬季ARGs數(shù)量與DOC呈顯著負(fù)相關(guān).且冬季ARGs相對(duì)豐度與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、TC和TN呈顯著正相關(guān).可能是因?yàn)橄募続RGs受到pH值影響,而秋冬季ARGs受到養(yǎng)分因子限制.賈世杰等[55]同樣發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)影響ARGs的主導(dǎo)環(huán)境因子不同,風(fēng)速和溫度是影響冬季氣溶膠ARGs組成最重要的因素,春季氣溶膠中ARGs的分布則主要受到溫度和濕度的影響.結(jié)構(gòu)方程模型進(jìn)一步證明季節(jié)因素通過改變土壤環(huán)境因子而對(duì)葉際ARGs產(chǎn)生間接影響.

因此,季節(jié)變化可以通過生物和非生物等多種途徑對(duì)ARGs產(chǎn)生直接或間接的影響,使得ARGs呈現(xiàn)季節(jié)動(dòng)態(tài)變化.本研究結(jié)果表明,冬季木荷葉際ARGs多樣性和相對(duì)豐度較高.Sun等[56]研究發(fā)現(xiàn)冬季是人們大量使用抗生素如青霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類的季節(jié)高峰.因此,冬季環(huán)境中較高的ARGs多樣性和豐度可能會(huì)削減臨床上抗生素的治療效果,是人類健康的重大隱患.全球氣候變化將會(huì)影響四季更替,這可能會(huì)對(duì)植物微生物群落的組成以及植物抗性組產(chǎn)生重大影響[57].故需深入研究增溫背景下葉際ARGs的季節(jié)變化,為緩解全球耐藥問題提供更多信息.

4 結(jié)論

4.1 在天然林木荷葉際中檢測(cè)到255種ARGs和10種MGEs,其中多重耐藥類為優(yōu)勢(shì)ARGs類型(相對(duì)豐度占比47.4%),抗生素外排泵為主要抗性機(jī)制(相對(duì)豐度占比52.8%).MGEs中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位(相對(duì)豐度占比97%).ARGs與MGEs之間無顯著相關(guān)(>0.05).

4.2 木荷葉際ARGs的組成具有季節(jié)性差異,表現(xiàn)為ARGs多樣性和相對(duì)豐度在秋季(93.5種,0.614±0.303拷貝/16S rRNA)、冬季(101.4種,(0.589±0.218)拷貝/16S rRNA)較夏季(87.2種,(0.291±0.101)拷貝/ 16S rRNA)高.季節(jié)因子主要通過改變土壤理化性質(zhì)(DON、DOC、MBN)間接影響葉際ARGs的組成.

4.3 增溫導(dǎo)致acrA-01基因相對(duì)豐度顯著上升(<0.05),7種抗性基因(2-03、-02、、/、-01、-01、-02)的相對(duì)豐度顯著下降(<0.05).

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Effect of stimulated warming on phyllosphere antibiotic resistance genes of.

LIN Xiao-ru1, LI Zi-xin1, SUN An-qi1, JIN Sheng-sheng1, XU Chao-die1, CHEN Shi-dong1,2, LIU Xiao-fei1,2, SHEN Ju-pei1*

(1.State Key Laboratory for Subtropical Mountain Ecology of the Ministry of Science and Technology and Fujian Province, School of Geographical Sciences/School of Carbon Neutrality Future Technology, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China；2.Fujian Sanming Forest Ecosystem National Observation and Research Station, Sanming 365002, China)., 2023,43(12)：6689～6699

To understand the effect of warming on the distribution and seasonal dynamics of antibiotic resistance genes (ARGs) in the phyllosphere, we conducted a study involving collection of foliar samples from natural forest leaves during summer, autumn and winter from two treatments: control and warming (+4℃). The numbers and relative abundance of ARGs in the phyllosphere were determined by high-throughput quantitative PCR. Results showed that a total of 255 ARGs and 10 MGEs were detected in all phyllosphere samples, among which multidrug resistance was the dominant gene type in the phyllosphere, accounting for 47.4% of the total. The antibiotic efflux pump was the main resistance mechanism. ANOVA analysis and principal coordinate analysis showed that season significantly influenced the distribution of phyllosphere ARGs. The relative abundance of phyllosphere ARGs in autumn and winter was (0.614 ± 0.303)copies/16S rRNA and (0.589 ± 0.218)copies/16S rRNA, respectively, which was higher than that in summer ((0.291 ± 0.101)copies/16S rRNA), and the diversity of ARGs in autumn and winter was also higher than that in summer. We found that the relative abundance of seven ARGs(2-03,-02,,/,-01,-01,-02) decreased significantly (<0.05), while the relative abundance of the-gene increased significantly (<0.05) in the warming treatment. Redundancy analysis and structural equation modeling showed that seasonality was the main factor driving the composition of phyllosphere ARGs via mediating soil physicochemical properties, while warming had no significant effect.

antibiotic resistance genes；seasonal variation；plant phyllosphere；global climate change

X713

A

1000-6923(2023)12-6689-11

林小如,李子歆,孫安琪,等.模擬增溫對(duì)木荷葉際抗生素抗性基因的影響 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2023,43(12):6689-6699.

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2023-04-15

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2022J02026);福建省“閩江學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”項(xiàng)目(2021)

* 責(zé)任作者, 研究員, Jpshen@fjnu.edu.cn

林小如(2001-),女,廣東潮州人,福建師范大學(xué)本科生,研究方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)學(xué).linxiaoru0310@foxmail.com.