電針通過調控基質金屬蛋白酶-2/金屬蛋白酶組織特異性抑制劑-1對跟腱損傷大鼠生物力學及損傷修復的影響※

白文博 劉國偉 李 娜

(1．河北省石家莊市中醫院功能科,河北 石家莊 050051;2．河北省石家莊市中醫院針灸科,河北 石家莊 050051)

跟腱是人體最重要的多功能肌腱之一,跟腱斷裂是臨床最常見的肌腱損傷[1]。據報道,我國每年跟腱斷裂人數不斷增多,最常見于中青年活動人群,且男性居多[2]。臨床對跟腱斷裂患者多進行手術治療,但術后組織粘連問題仍是臨床需解決的問題[3]。研究發現,針灸能調節機體功能,增強抵抗疾病的能力[4]。針灸可通過激發機體內止痛物質的釋放而緩解疼痛[5]。治療跟腱炎時取跟腱疼痛穴位進行針灸,可起到治療效果[6]。基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)是機體內水解酶之一,能對幾乎所有的細胞外基質進行降解,廣泛存在于各種結締組織中[7]。金屬蛋白酶組織特異性抑制劑-1(TIMP-1)是機體天然存在的基質金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑,廣泛存在于機體的組織和體液中。TIMP-1對MMPs家族的所有成員均有抑制作用,MMPs/金屬蛋白酶組織特異性抑制劑(TIMPs)調節異常可引起細胞外基質合成或降解的失衡,介導各種組織、器官纖維化和疾病的發生發展[8]。有研究證實,MMP-2和TIMP-1在跟腱損傷中高表達,但具體機制尚不清楚[9]。本研究通過給予跟腱損傷大鼠電針治療,觀察電針通過調控MMP-2/TIMP-1對跟腱損傷大鼠生物力學及損傷修復的影響,結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠50只,8周齡,體質量200～220 g,均購自青海大學醫學院動物實驗中心,許可證號:SCXK(青)2018-0013。飼養于大鼠動物房,室溫恒定于18～22 ℃,房間內光照12 h,晝夜交替。

1.2 試劑與儀器 4%異氟烷(上海江萊生物科技有限公司);MMP-2抗體(南京歐凱生物科技有限公司);TIMP-1抗體(武漢伊艾博生物科技有限公司);干擾金屬蛋白酶組織特異性抑制劑-1(sh-TIMP-1)質粒(上海澤葉生物科技有限公司);4%多聚甲醛固定液、蘇木素-伊紅(北京索萊寶科技有限公司);SH08SDZ.ⅡA型電子治療儀(北京北信科儀分析儀器有限公司);熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、透射電鏡(日本OLYMPUS公司);5415D型離心機(德國Eppendorf公司);AGIS-MS型電子萬能試驗機(日本島津公司)。

1.3 動物分組及模型制備 將50只SD大鼠按照隨機數字表法分為5組,假手術組、模型組、電針組、sh-TIMP-1組和電針+sh-TIMP-1組,每組10只。采用跟腱縱軸中間橫行貫通切斷法制備跟腱損傷大鼠模型[10]。各組大鼠用麻醉呼吸機吸入4%異氟烷麻醉,仰臥位固定于無菌操作臺,用碘伏消毒右后肢,在右后肢跟腱上方自近端向遠端縱行切開跟腱表面皮膚,將約2 cm亮白色的跟腱全段完全暴露在外,肉眼可見跟腱分為粗細兩端。先將相對較細的副腱切除,使用垂直于膠原纖維的15號手術刀刀片,在肌腱跟骨插入,近端約5 mm處橫斷跟腱,后縫合斷裂跟腱,并逐層縫合皮膚。假手術組僅劃開跟腱表面皮膚,游離跟腱周邊軟組織,而后間斷縫合皮膚傷口。

1.4 干預方法 造模結束后次日,電針組大鼠仰臥位固定,取腎俞、足三里、陽陵泉,腎俞(第2腰椎棘突下旁開7 mm,左右各一穴)刺入8 mm,足三里(雙膝關節外側,約腓骨小頭下5 mm處)刺入7 mm,陽陵泉(距足三里上外側5 mm,左右各一穴)刺入6 mm。行針1 min后穴位加用電子治療儀治療,刺激強度以大鼠腿部肌肉出現微微顫動為度,通電時間為5 min,振動波幅為2 Hz。電針每日治療1次,6天為1個療程,共治療3個療程。sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織中注射sh-TIMP-1質粒300 μL治療,每周治療1次,共治療3周。電針+sh-TIMP-1組大鼠在跟腱組織中注射sh-TIMP-1質粒300 μL,同時予電針干預,方法同電針組。假手術組、模型組大鼠不予任何干預。

1.5 實驗樣本取材 最后一次干預結束后24 h取材,麻醉各組大鼠,取出實驗大鼠的跟腱組織,將跟腱組織于0.9%氯化鈉注射液中浸泡,紗布包裹浸泡的跟腱組織于凍存管中,置于-80 ℃冰箱待用。

1.6 生物力學指標檢測 將大鼠跟腱取出并夾于夾具中,采用電子萬能試驗機進行跟腱生物力學性能測試。檢測前對跟腱循環拉伸預處理。實驗時用加載速率3 mm/min進行拉伸破壞實驗。以跟腱組織不在夾具處斷裂為實驗成功標準,記錄載荷-變性曲線。實驗過程中在跟腱組織上不斷滴加0.9%氯化鈉注射液保濕組織,后對數據進行處理并計算力學參數。假手術組大鼠拉斷點均在肌肉連接處(跟腱無損傷縫合),評估跟腱損傷愈合情況失真,故未對假手術組進行生物力學測試。

1.7 跟腱組織病理學變化 取出各組大鼠跟腱組織,固定于4%多聚甲醛固定液中,組織脫水后用石蠟包埋組織,切成組織切片,厚度為5 μm。烤箱烘烤切片組織30 min,0.9%氯化鈉注射液清洗切片組織3次,每次沖洗1 min。蘇木素染色3 min,自來水沖洗切片3 min,繼續將組織經伊紅染色10 s,乙醇脫水,向組織切片中滴加中性樹脂。將組織切片置于顯微鏡下觀察。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達 取各組大鼠跟腱組織20 mg,將組織在冰上研磨呈粉末狀,將裂解液加入到組織中,制成組織懸液后離心,對蛋白樣本總濃度進行測定。轉移蛋白樣品至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),加入5%脫脂奶粉封閉樣品2 h。蛋白樣品中分別加入一抗MMP-2、TIMP-1、β-actin,孵育后洗滌蛋白樣品,將HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶2000)加入到蛋白樣品中,室溫孵育1 h。用底物化學發光(ECL)液顯色,Image J軟件觀察條帶灰度值并計算蛋白表達。

2 結果

2.1 4組大鼠生物力學指標比較 假手術組大鼠拉斷點均在肌肉連接處(跟腱無損傷縫合),評估跟腱損傷愈合情況失真,未對假手術組進行生物力學測試;電針組、sh-TIMP-1組、電針+sh-TIMP-1組大鼠最大載荷、能量吸收、彈性模量和最大應力均高于模型組(P<0.05),應變低于模型組(P<0.05),比較差異有統計學意義;電針+sh-TIMP-1組大鼠最大載荷、能量吸收、彈性模量和最大應力均高于電針組、sh-TIMP-1組(P<0.05),應變低于電針組、sh-TIMP-1組(P<0.05),比較差異有統計學意義。見表1。

表1 4組大鼠生物力學指標比較

2.2 5組大鼠跟腱組織病理學變化 假手術組大鼠跟腱纖維排列有序,無炎癥浸潤;模型組大鼠肌腱組織增生明顯,纖維結構排列疏松且無序,并伴有新生血管生成和炎癥細胞浸潤;電針組大鼠跟腱組織得到明顯改善,跟腱組織纖維結構排列較整齊,且新生血管和炎癥細胞浸潤程度明顯減輕;sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織纖維結構排列較整齊,有新生血管和炎癥細胞浸潤;電針+sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織改善,跟腱組織纖維結構排列較整齊,且新生血管和炎癥細胞浸潤程度明顯減輕。見圖1。

▲區域為跟腱區

2.3 5組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達及MMP-2/TIMP-1比值比較 與假手術組比較,模型組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達及MMP-2/TIMP-1比值均升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、sh-TIMP-1組、電針+sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達及MMP-2/TIMP-1比值均降低(P<0.05);與電針組、sh-TIMP-1組比較,電針+sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達及MMP-2/TIMP-1比值均降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達及MMP-2/TIMP-1比值比較

3 討論

跟腱損傷在臨床骨科最為常見,由于跟腱損傷修復相對困難,且愈合時間長,嚴重影響患者生活質量[11]。雖然臨床治療肌腱損傷有一定療效,但效果并不十分理想[12]。目前,中醫學治療跟腱斷裂有較好療效,能有效減少并發癥,并促進組織愈合,針刺對人體功能產生廣泛作用[13],效果尤為顯著。有研究報道[14-17],針刺干預治療跟腱末端病,其臨床癥狀及生物力學功能顯著改善。

跟腱組織在載荷作用下能發生結構和形態的變化,進而對所承受的載荷環境進行適應[18]。但跟腱的功能適應性存在一個載荷范圍,且有最佳載荷值。在該范圍內的載荷量可顯著提升肌腱的生物力學性能,過大的載荷值甚至可能損傷跟腱[19]。本研究通過對各組大鼠生物力學指標檢測發現,電針組大鼠最大載荷、能量吸收、彈性模量和最大應力均增加,應變指標顯著降低,提示電針能提高跟腱損傷大鼠跟腱生物力學性能。跟腱彈性模量的增加可導致變性跟腱彈性力增大,即在其他條件相同時肌腱能傳遞的肌力更大。由于肌腱損傷及斷裂通常是在一定應變下肌腱內部的膠原纖維部分或全部遭到破壞,故跟腱彈性模量的增加及應變的減小,可使肌腱受力損傷的幾率降低。劉佳麗等[20]研究發現,可通過增加跟腱損傷大鼠跟腱生物力學性能而產生功能適應性變化,進而對大鼠跟腱損傷的恢復起促進作用。

MMP-2是專門分解Ⅰ型膠原的蛋白酶,在肌腱組織的代謝與重塑中發揮重要作用,在正常肌腱組織中含量極少,在變性、損傷或壞死的肌腱組織中含量會迅速增加,其升高幅度也與肌腱變性、受損或壞死程度呈正比,以發揮分解變性或者壞死肌腱組織的作用。TIMP-1作為MMP-2的拮抗劑,在實驗中常會作為MMP-2的配對指標共同測定,以檢驗MMP-2的正確性,其含量會隨著MMP-2的升高而升高[21]。本研究結果顯示,電針可降低跟腱損傷大鼠跟腱組織中MMP-2和TIMP-1蛋白表達,表明跟腱組織內變性和壞死的肌腱已經大量減少,有了較大程度的恢復。且HE染色結果也證實了電針能促進跟腱損傷大鼠的跟腱組織恢復。史曉偉等[22]研究證實,跟腱末端病發生時跟腱組織中MMP-1和TIMP-1表達均增加,提示MMP-1和TIMP-1參與跟腱末端病的重塑。因此猜測能否通過調控MMP-2/TIMP-1表達而增加跟腱生物力學性能,促進跟腱組織愈合。本實驗通過向跟腱損傷模型大鼠注射sh-TIMP-1發現,sh-TIMP-1能抑制跟腱損傷大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達,升高跟腱生物力學性能,顯著改善跟腱損傷組織病理學變化,對跟腱損傷的修復起促進作用。為進一步證實電針通過對MMP-2/TIMP-1的調控而影響跟腱損傷的生物力學和損傷修復,本研究通過聯合使用電針和sh-TIMP-1干預治療,結果顯示電針聯合sh-TIMP-1組的MMP-2、TIPM-1蛋白表達更低,且跟腱生物力學性能、損傷組織的修復效果優于單獨使用電針或sh-TIMP-1,由此證明sh-TIMP-1對跟腱損傷大鼠的損傷恢復有促進作用,進一步證實電針可通過調控MMP-2/TIMP-1信號通路促進跟腱損傷大鼠損傷修復。

綜上所述,電針可增加跟腱損傷大鼠跟腱生物力學性能,促進損傷修復,其機制可能與抑制MMP-2/TIMP-1表達有關。