干/祖細胞在肺動脈高壓中的研究進展

陳玲 何夢鈺 張甲燚 解衛平

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是指在海平面靜息狀態下平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure,mPAP)≥20mmHg,肺血管阻力≥3 Wood units的臨床綜合征[1]。PAH的病理特征主要是肺動脈內皮細胞(pulmonary arterial endothelial cells,PAECs)、肌成纖維細胞、肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)、成纖維細胞增殖,血管內膜細胞外基質沉積,中膜纖維化導致的肺血管重塑,從而引起肺血管阻力增加,進而導致不同程度的右心功能下降,最終引起死亡[2]。組織駐留及循環干/祖細胞通過遷移至目標血管,分化成具有自我更新能力和集落形成能力的血管細胞進而參與肺血管重塑過程。因而,明確干/祖細胞在PAH肺血管重塑中的作用有助于為PAH治療提供新的靶點。本文就各類干/祖細胞在PAH病理生理過程中的作用及其治療價值進行綜述。

一、內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)

1. EPCs定義

Asahara等于1997年通過磁珠分選細胞表面抗原CD34陽性和血管內皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)陽性細胞,首次分離培養出EPCs[3]。最初認為EPC起源于骨髓,募集至外周循環。然而近期研究發現,骨髓移植患者外周血分離的晚期EPC基因型與骨髓受者表型一致,提示晚期EPCs可能有部分起源于血管壁龕[4]。根據分離培養時間長短將EPCs分為兩種亞群:早期EPCs(小于2周)及晚期EPCs(大于2周)[5]。早期EPCs呈紡錘形,表達造血細胞標志物CD14、CD45;晚期EPCs呈鵝卵石樣,表達內皮標志物CD31、VE-cadherin,而CD14、CD45陰性表達(圖1)。

圖1 EPCs起源及分類

2. EPCs治療PAH的潛力

目前關于EPCs在PAH發生發展過程中的變化及其作用仍然存在爭議。有研究發現循環 EPCs數量隨著mPAP增加而減少[6];肺組織內EPCs數量隨著mPAP升高而增加[7],其原因可能是隨著疾病的加重更多的EPCs代償性的招募于受損血管參與內膜修復,導致外周循環EPCs消耗,肺組織內EPCs增加。分離PAH患者的晚期EPCs進行功能研究表明,位于肺血管重塑區及叢狀病變區域的EPCs存在過度增殖、血管形成功能受損和骨形成蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor 2,BMPR2)信號突變[8]。移植骨髓源性EPCs可預防野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導的PAH,降低右心室收縮壓,改善右心室肥大,保護肺毛細血管連續性,維持肺微血管結構[9]。移植外周血源性EPCs可改善慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(chronic thromboembolic pulmonary hypertension,CTEPH)動物右心室功能,提高右心室毛細血管密度[10]。體外實驗發現,大鼠外周血源性EPCs外泌體可抑制缺氧誘導的PASMCs增殖、遷移,促進凋亡,具有治療PAH的潛力[11]。此外,目前認為EPCs移植聯合藥物或基因修飾對PAH的療效優于單純移植EPCs。研究發現轉染內皮型一氧化氮合酶的外周血EPCs可升高MCT-PAH大鼠血清及肺部氮氧化合物水平,降低右心室收縮壓、改善右心室肥大及延緩肺小動脈肌化[12]。靜脈注射高表達BMPR2的骨髓源性EPCs增加了MCT-PAH大鼠肺組織中BMPR2及細胞內信號蛋白的表達水平,減少肺血管重構,改善肺動脈高壓[13]。研究發現接受利奧西呱治療的CTEPH患者循環EPCs數量顯著升高,分離外周血EPCs進一步發現利奧西呱組EPCs對人肺微血管內皮細胞的血管形成及細胞遷移促進效果更強,內皮調節功能更強[14]。由此可見,以EPCs為基礎的細胞治療可能成為PAH治療的新策略。

但部分研究顯示EPCs不能改善PAH,甚至可能加重內皮損傷,促進PAH。Ikutomi等發現骨髓源性晚期EPCs雖然對系統性血管損傷有修復作用,但不能募集于肺組織參與肺小血管修復,因而不能改善MCT-PAH[15]。分離PAH患者EPCs并移植入小鼠體內,引起小鼠肺EPCs損傷及原位血栓形成,導致小鼠PAH發生率和死亡率增加[16]。這可能與EPCs的分離方法多樣,EPCs群體具有高度異質性有關。研究發現,肺組織駐留CD34+EPCs與骨髓來源CD34+EPCs發揮不同作用,組織駐留EPCs響應血管損傷分化為內皮細胞,改善內皮損傷;骨髓來源EPCs轉化為CD45+白細胞,促進炎癥反應,加重內皮損傷形成[17]。未來需要更多研究識別EPCs的各個群體及不同群體在PAH發生發展中的作用。

二、SMC祖細胞(SMC progenitor cells,SPCs)

1. SPCs定義

SPCs指能定向分化為血管SMCs的細胞群, Simper等于2002年通過條件培養基法首次從外周血單核細胞內分離培養出SPCs[18]。然而,關于SPCs的特定分子標志物仍存在爭議,但較明確的是SPCs不表達成熟SMCs標志蛋白,如:α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、平滑肌22α(smooth muscle-myosin heavy chain,SM22α)等,而表達干細胞標記蛋白,如:干細胞抗原-1[19]。

2. SPCs治療PAH的潛力

目前發現血管壁中的SPCs參與動脈粥樣硬化過程中的血管內膜新生,也參與了缺血損傷誘導的血管再生[20]。PAH肺血管重塑的特征之一是SMCs出現于肺動脈中膜層,導致非肌化的肺小動脈肌化和部分肌化血管的異常肌化[21]。肺動脈肌化由SMCs增殖、內皮-間充質轉化、多種駐留和(或)循環祖細胞群參與。PAH病理過程中,內皮功能障礙、內皮源性生長因子(如:血小板源性生長因子、VEGF、成纖維細胞生長因子、IL-6)、BMPR2信號減少等因素促進SMCs發生增殖、遷移,聚集于新生內膜參與重塑血管[7]。在缺氧相關性PAH,位于肺動脈肌化和非肌化區域交接處的SMCs通過高表達多潛能因子KLF4,抑制平滑肌-肌球蛋白重鏈表達進行去分化及再分化過程轉變為SPCs。SPCs進一步向非肌化區域遷移、增殖及分化為成熟SMCs導致肺血管重塑[22]。

親子表達的基因3(paternally expressed gene 3,Pw1/Peg3)參與調節細胞周期、細胞應激及細胞代謝等過程,慢性缺氧誘導的PAH 模型中PDGFRα+/PW1+祖細胞群可分化為平滑肌樣細胞參與肺動脈高壓發展,抑制PDGFRα可抑制PW1+祖細胞群增殖,減少血管重塑[23]。cKit+細胞、CD133+細胞、Sca1+細胞等駐留/循環祖細胞群也可分化為SMC樣細胞,參與血管重塑[21, 24, 25]。

周細胞近似于多能間充質干細胞,具有成骨、成軟骨和成脂化的能力,目前也被認為是SMCs樣細胞的來源之一,可能是PAH潛在治療靶點[25]。周細胞通過物理接觸和旁分泌信號與ECs進行細胞通信,維持毛細血管前小動脈、毛細血管和毛細血管后小靜脈結構[26]。研究提出周細胞參與了PAH血管重塑過程。在慢性缺氧PAH模型及MCT誘導PAH模型中已經證實大量周細胞趨化、募集至肺血管,激活轉化生長因子-β信號通路分化成SMC樣細胞[27, 28]。在IPAH患者及遺傳性PAH患者肺組織內也證實存在α-SMA+/SM22+的周細胞[29]。

三、間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)

1. MSCs定義

MSCs起源于中胚層,呈紡錘形,在體外可誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞[30, 31]。MSCs來源廣泛,脂肪、骨髓、外周血、新生兒臍帶、胎盤、羊水等均可分離培養出MSCs。不同組織來源的MSCs具有不同功能,其表面標志物具有差異[30, 31]。MSCs表達CD73、CD105、CD90,不表達CD34、CD14、CD45、CD11b、CD19、人類白細胞抗原Ⅱ類分子[31]。

2. MSCs治療PAH的潛力

MSCs因其體外擴增能力強、免疫豁免、來源廣泛、可分化為多種細胞類型的特性,目前廣泛應用于細胞移植治療領域[30]。在動物模型中證實基于MSCs的細胞移植對PAH有治療作用,靜脈注射 MSCs可降低慢性缺氧、缺氧聯合SU5416、MCT誘導的肺動脈高壓動物的肺動脈壓力,減少肺小動脈肌化,緩解右心室肥大,降低右心室收縮壓[32-34]。由于MSCs來源廣泛,也有研究對不同來源MSCs的PAH治療效果進行深入研究,發現臍帶血來源MSCs治療效果最佳,具有更強的抑制炎癥反應、延緩血管重塑、改善右心室功能的作用[35]。MSCs聯合藥物或基因修飾對PAH的療效可能優于單純移植MSCs。近期研究發現將轉染成纖維細胞生長因子的MSCs與PAECs共培養能改善PAH病理過程中PAECs活力,提高PAECs增殖能力,減少細胞凋亡;有效降低右心室收縮壓,緩解右心室肥大[36]。前列腺素 E1 處理后MSCs缺氧誘導因子-1α表達升高,對MCT-PAH大鼠的治療效果優于無前列腺素 E1處理的MSCs[37]。 Lodenafil(磷酸二酯酶-5抑制劑)聯合人MSCs可逆轉缺氧聯合SU5416誘導的PAH大鼠右心室肥大、纖維化及間質細胞浸潤[38]。雖然MSCs移植能改善PAH病理過程,但組織病理發現移植后的MSCs廣泛分布于肺間質而未聚集于肺血管周圍,推測MSCs可能通過其旁分泌功能發揮治療作用[33]。一項薈萃分析發現,MSCs條件培養基可減少炎癥細胞及炎癥因子,改善肺部和全身炎癥,發揮與MSCs治療相似的抗炎作用,且條件培養基具有生物穩定性好、感染風險低、排異風險小的優勢[39]。MSCs外泌體可在體外抑制缺氧誘導的PAECs凋亡及SMCs增殖,改善MCT-PAH大鼠右心室肥大及肺血管重塑[40]。MSCs細胞外囊泡可預防肺動脈高壓發生,在缺氧聯合SU5416誘導肺動脈高壓前注射MSCs細胞外囊泡可降低大鼠右心室壓力,改善右心室肥大,減少周圍血管肌化[41]。

盡管MSCs外泌體、細胞外囊泡等可能發揮PAH治療作用,但其旁分泌功能易受外界刺激影響,越來越多的研究關注于提高MSCs外泌體的療效及穩定性。目前認為可以通過:(1)MSCs移植前進行缺氧或生物、化學分子預處理。(2)構建轉基因MSCs。(3)利用MSCs遞送外源性藥物三種方式更有效發揮MSCs治療作用[42]。此外,MSCs療效探索多局限于基礎研究,臨床研究鮮有報道,其原因可能是:(1)靜脈注射MSCs后存在肺栓塞風險。據報道靜脈注射MSCs后25%到40%的實驗動物因發生肺栓塞而死亡[43]。(2)PAH動物模型與人PAH病理過程存在差異。(3)臨床應用MSCs的來源、治療細胞數量以及途徑和時間等問題暫未解決。

四、結語

干/祖細胞在PAH領域是一把雙刃劍。一方面PAH進展過程中干/祖細胞功能異常參與了叢狀損害的形成,加重肺血管重塑;另一方面,干/祖細胞通過趨化、遷移至損傷血管替換受損細胞,參與血管修復過程;以干/祖細胞為基礎的細胞移植更為PAH的治療提供新的方向。然而,目前關于干/祖細胞移植的臨床應用仍需要不斷探索。因而,深入進行干/祖細胞在PAH領域的基礎研究、建立大樣本的臨床試驗才能為PAH的細胞治療夯實基石。