響應面法優化豬鬃草總黃酮提取工藝及抗氧化性研究

基金項目：

貴州省科技廳平臺人才項目［20185216］。

作者簡介：

陳菊（1979—），女，苗族，碩士，副教授，研究方向為中草藥方面教學及基礎研究。E-mail：511285737@qq.com

通信作者：

【摘? 要】

目的：研究豬鬃草總黃酮提取工藝，分析其抗氧化活性。方法：利用Box-Behnken響應面試驗設計優選豬鬃草總黃酮超聲波提取工藝的最佳條件，并測定豬鬃草總黃酮提取物對·OH和DPPH自由基的清除能力。結果：豬鬃草總黃酮超聲波提取的最優工藝條件為：料液比1∶33 g/mL，超聲提取時間21 min，超聲次數2次，該條件下總黃酮的提取率為6.17%；抗氧化試驗中，豬鬃草總黃酮對·OH和DPPH自由基均有清除效果，對·OH清除率為45.09%，對DPPH清除率為63.12%。結論：Box-Behnken分析法優化豬鬃草總黃酮提取工藝是可行的，豬鬃草總黃酮具有較好的抗氧化能力。

【關鍵詞】

豬鬃草；總黃酮；超聲提取；響應面法；抗氧化性

【中圖分類號】R284.1??? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）20-0044-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.20.zgmzmjyyzz202320010

Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Adiantum

capillus-veneris by Response Surface Method

CHEN Ju

Qiandongnan Vocational and Technical College for Nationalities，Kaili 556000，China

Abstract：

Objective The extraction technology and antioxidant activity of total flavonoids from Adiantum capillus-veneris were studied. Methods With Box-Behnken response surface method，the ultrasonic-assisted extraction process parameters of total flavonoids from Adiantum capillus-veneris were optimized .The antioxidant capacity of total flavonoids to·OH and DPPH·free radical were adopted. Results The optimum extraction conditions was as follows： material-liquid ratio 1∶33 （g/mL）， extraction time 20min， extraction times 2 times. Under these conditions， the average extraction rate of polysaccharides reaches 6.17%.The total flavonoids in Adiantum capillus-veneris had good antioxidant effect on·OH radicals and DPPH radicals，and the scavenging rate was 45.09% and 63.12%. Conclusion The response surface method is feasible to optimize extraction process of Adiantum capillus-veneris total flavonoids and the total flavonoid had good antioxidant activity.

Keywords：

Adiantum Capillus-veneris；Total Flavonoids；Ultrasonic-assisted Extraction；Response Surface Methodology；Antioxidant Activity

豬鬃草為鐵線蕨科（Adiantaceae）植物鐵線蕨（Adiantum capillus-veneris）及團羽鐵線蕨（Adiantum capillus-junonis Rupr）［1］，又名豬毛漆、鐵絲草、魚鱗草［2］，常生于溪邊隱濕處，廣泛分布在貴州境內，其中在貴州省黔東南地區民間常用來治療尿路感染及結石，具有較好的療效。豬鬃草性涼，味微苦，以全草入藥，可清熱祛風、利尿消腫、補腎止咳，用于治療感冒咳嗽、腰酸背痛、跌打損傷、尿結石、乳腮炎、腎炎、血淋、遺精等［2-6］。據《貴州民間方藥集》記載豬鬃草中含黃酮類、糖類、揮發油和鞣質等多種物質。黃酮是藥用植物中一類多功能的天然活性物質，具有抗心腦血管病、抗腫瘤、抗糖尿病等作用［7］。由于黃酮類化合物特有的理化性質和特殊結構，使得它能選擇性地抑制體內酶的活性，而具有抗氧化性［8］，已經被廣泛應用到藥品、食品和化妝品中。

響應面分析法是一種能確定多因素系統的試驗方法，它采用多元二次回歸方程來擬合試驗因素與響應值之間的函數關系，并通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數［9］。目前，響應面法優化黔東南地區豬鬃草總黃酮的提取研究未見報道，本研究擬在單因素試驗基礎上，利用響應面試驗設計對超聲波提取豬鬃草總黃酮進行優化，并就其清除·OH和DPPH自由基的能力進行研究，為該地區豬鬃草提取物的開發利用提供數據參考和依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑? 豬鬃草購于黔東南州民族藥材市場，由我院楊海莉副教授鑒定為鐵線蕨科植物鐵線蕨，新鮮的豬鬃草用自來水沖掉泥沙，然后在蒸餾水下沖洗干凈，再用定性濾紙吸干表面水分，置于110℃烘箱內殺青，60℃下烘干至恒重。烘干后的豬鬃草經粉碎，并過篩，即得豬鬃草粉末，室溫下密封保存備用。

主要試劑：標準品蘆丁（HPLC＞98%）購于北京中科質檢生物技術有限公司，DPPH自由基、 H2O2、維生素C及其他試劑均為分析純。蒸餾水，實驗室自制。

主要儀器：電熱鼓風干燥箱（DUG-90764型，上海精宏實驗設備有限公司）；紫外可見分光光度計（UV8000S型，上海元析儀器有限公司）；電子分析天平［MS204S型，梅特勒托利多（上海）儀器有限公司］；超聲波清洗器（SK8200HP型，上海科導超聲儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（SYG-6型，常州朗越儀器制造有限公司）；循環水式真空泵［SHZ-D（Ⅲ）型，鞏義市予華儀器有限責任公司］。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 蘆丁標準曲線的制備? 準確稱取105℃條件下，干燥至恒重的蘆丁標準品6.55 mg，加無水乙醇適量使其溶解并定容到20mL容量瓶中，搖勻，得0.3275mg/mL標準溶液。精密吸取上述標準溶液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL，分別放入25mL的容量瓶中，先各加入0.5mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻并靜置6min，再各加入0.5mL的10% 硝酸鋁溶液，充分搖勻放置6min，再分別加入5mL的 4%氫氧化鈉溶液，最后用70%的乙醇定容至刻度，搖勻。常溫下放置15min，然后在500 nm處測定吸光度A值，繪制蘆丁標準溶液濃度C（mg/mL）與吸光度A的標準曲線圖（如圖1所示），計算出回歸方程：A=12.837C+0.15，相關系數R=0.999，表明在0.0028～0.0817mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

1.2.2? 豬鬃草總黃酮超聲提取工藝及得率計算? 準確稱取豬鬃草粉末適量，加70%乙醇浸泡30min后，進行超聲波提取，過濾，濾液用70%乙醇定容于50mL容量瓶中，搖勻，得樣品溶液。精密吸取樣品溶液2.00mL，放置于20mL容量瓶中，同“1.2.1節”操作加入5% NaNO2、10%Al（NO3）3和4%的NaOH定容，在510 nm處測定吸光度。根據測得的吸光度和標準曲線回歸方程計算豬鬃草中黃酮的含量，然后計算豬鬃草黃酮提取率：

豬鬃草總黃酮提取率（%）=豬鬃草總黃酮質量豬鬃草質量×100%

1.2.3? 單因素試驗設計? 固定提取工藝中其他因素水平，選取料液比（1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶30 g/mL、1∶40 g/mL、1∶50 g/mL）、超聲提取時間（5min、10min、20min、30min、40min）和超聲次數（1次、2次、3次、4次、5次）為影響因素，分別進行單因素試驗，考究各單因素變化對總黃酮提取率的影響，以確定響應面試驗中各因素取值范圍。

1.2.4? 響應面優化試驗設計? 結合單因素試驗結果，以料液比（A）、超聲提取時間（B）、超聲次數（C）為考察因素，各設定3個水平，以-1、0、1分別編碼，采用Box提出的中心組合試驗設計原理，利用軟件進行響應面分析，確定超聲提取豬鬃草總黃酮的最優工藝，試驗因素和水平設計見表1。

1.2.5? 豬鬃草總黃酮抗氧化活性測定

1.2.5.1? 對羥基自由基清除能力的測定? 參考張琳等［10］的方法稍以改動，將1.2.2節豬鬃草黃酮提取液進行濃縮，用蒸餾水稀釋濃縮液并配成0.05mg/mL、0.15mg/mL、0.25mg/mL、0.35mg/mL、0.45mg/mL、0.55mg/mL、0.65mg/mL7個不同濃度的樣品溶液，取7支比色管，先各加入2.0mL的 6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、不同質量濃度的豬鬃草總黃酮溶液及6 mmol/L雙氧水溶液，充分搖勻，25℃條件下放置10min后，再加2.0mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，搖勻并放置于37℃水浴條件下反應30min ，然后分別在510 nm測定不同質量濃度總黃酮溶液的吸光度M1；同時測定用蒸餾水代替水楊酸乙醇溶液的吸光度 M2和用蒸餾水代替黃酮溶液的吸光度M0，試驗采用維生素C為陽性對照，通過下面公式計算出豬鬃草總黃酮對·OH清除率：

羥基自由基清除率（%）=1-（M1-M2）M0×100%

1.2.5.2? 對DPPH自由基清除能力的測定? 參考王世彬等［11］的方法，在2.5mL濃度為0.2 mmol/L 的DPPH乙醇溶液中分別加入不同質量濃度的豬鬃草總黃酮溶液2.0mL，搖勻后，在25℃條件下避光反應30min，于紫外-可見分光光度計517 nm波長處測定吸光度N1，同時測定2.5mL無水乙醇與2.0mL不同質量濃度豬鬃草總黃酮溶液混合液的吸光度N2、以及用2.0mL無水乙醇代替樣品溶液與2.5mL0.2 mmol/LDPPH溶液反應的吸光度 N0。試驗以維生素C為陽性對照，計算豬鬃草總黃酮對DPPH·清除率：

DPPH自由基清除率（%）= 1-（N1-N2）N0×100%

2? 結果與分析

2.1? 單因素試驗分析? 單因素料液比、超聲時間和超聲次數對豬鬃草總黃酮提取率的影響結果如圖2所示。

由圖2a看出，隨著溶劑用量的增加，豬鬃草總黃酮提取率也增加，當料液比達1∶30時，提取率最大，超過1∶30之后，提取率逐漸下降。料液比過大時不但提取溶劑的用量增加，而且不利于濃縮，所以選擇料液比在1∶30附近進一步優化試驗。

由圖2b可知，隨著超聲提取時間的延長，總黃酮提取率呈增加趨勢， 30min后，豬鬃草總黃酮提取率反而下降。這也許是由于超聲時間太短，提取不充分，黃酮類化合物還沒有完全溶出，但超聲時間過長部分溶劑會揮發，同時溶液中的非黃酮類物質逐漸增多，導致提取率下降。因此，選擇超聲時間在30min左右為宜。

由圖2c可知，超聲提取1次時，豬鬃草總黃酮提取率明顯較低，超聲提取2次時提取率達最高，繼續增加提取次數，提取率不再增加并開始下降。因此，宜選擇提取次數在2次左右。

2.2? 響應優化試驗結果與方差分析? 用自變量A、B、C分別表示料液比（g/mL）、超聲提取時間（min）和超聲次數3個影響因素，Y為響應值表示豬鬃草總黃酮提取率，采用分析軟件設計，共17個試驗， 1～12為析因試驗，其余13～17五個試驗為中心試驗。響應面試驗設計及結果見表2，方差分析見表3，回歸模型可靠性分析見表4。

對表2試驗結果進行多項式分析，可建立如下二次多項回歸方程：

Y=6.06+0.93A+0.35B+0.35C-0.11AB+0.52AC-0.63BC-1.79A2-0.16B2-0.51C2

表3方差分析顯示，模型P<0.0001，表明二次回歸方程模型高度顯著；失擬項P＝0.1058＞0.05，差異不顯著，表明該殘差均由隨機誤差所引起。表4中的回歸模型決定系數R2=0.9878，表明98.78%的試驗數據是合理的，說明該回歸模型與實際測量值擬合得較好。因此可用該回歸方程對試驗結果進行分析。由表3可知，該二次回歸方程的一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2均達顯著水平以上，交互項中除AB項的交互作用不顯著外，其他BC和AC項兩項交互作用達也都顯著水平。因此，影響超聲提取豬鬃草黃酮的主次因素為A＞B＞C，即料液比＞超聲提取時間＞超聲次數。

根據回歸模型擬合結果，通過軟件對回歸模型進行預測分析，得到豬鬃草總黃酮超聲波提取的最佳條件為：料液比1∶33.27g/mL，超聲時間20.27min，超聲次數2.46 次，此條件下豬鬃草黃酮提取率為6.29%。為方便試驗操作，將工藝條件調整為料液比1∶33g/mL，超聲時間21min，超聲次數2次。在調整后的工藝條件下進行驗證試驗，重復3次，測得豬鬃草黃酮提取率為6.17%，接近模型預測值，說明預測值與試驗值之間具有較好的擬合性，證明了響應面分析法優化豬鬃草總黃酮提取工藝的可行性。

2.3? 豬鬃草總黃酮抗氧化活性分析

2.3.1? 對·OH自由基的清除效果? 由圖3可知，在所試質量濃度0.05～0.65mg/mL范圍內，羥基自由基的清除率隨著總黃酮質量濃度的增加逐漸增強，兩者之間成正比例關系，當總黃酮質量濃度為0.55mg/mL時，羥基自由基清除率達最大，為45.09%。與同濃度的維生素C相比較，豬鬃草總黃酮清除·OH自由基的能力雖然弱于維生素C清除·OH自由基的能力，但也具有較好清除·OH自由基的能力。

2.3.2? 對DPPH自由基的清除效果? 由圖4可知，豬鬃草總黃酮在質量濃度0.05～0.65mg/mL范圍內，隨著豬鬃草總黃酮質量濃度的增加，清除DPPH自由基的能力增強，當總黃酮質量濃度為0.65mg/mL時，對DPPH自由基的清除力可達63.12%。與相同濃度的維生素C相比較，雖然豬鬃草總黃酮清除DPPH自由基的能力沒有維生素C清除DPPH自由基的能力強，但豬鬃草總黃酮也具有一定清除DPPH自由基的能力。

3? 結論

目前黃酮類物質的提取方法主要有超聲波提取法［12］、微波提取法［13］、回流提取法［14］等。鑒于超聲波提取法具有提取率高、操作簡單、試劑使用量少的優點［15-16］，此次研究采用超聲波提取豬鬃草總黃酮。研究考察了料液比、超聲時間、超聲次數對豬鬃草總黃酮提取率的影響，并通過響應面分析法建立了影響因素與提取率間的數學模型方程，最終確定了超聲波提取豬鬃草總黃酮的最佳工藝參數為：料液比1∶33g/mL，超聲時間21min，超聲次數2次，在此條件下豬鬃草總黃酮的平均提取率為6.17%，與預測值6.29%接近。

該研究從清除·OH和DPPH自由基的能力研究了豬鬃草總黃酮的抗氧化活性，并以維生素C為陽性對照。結果表明，在豬鬃草總黃酮質量濃度在0.05～0.65mg/mL范圍內，隨著豬鬃草總黃酮質量濃度的增加，清除·OH和DPPH自由基的能力逐漸增強。當黃酮質量濃度為0.55mg/mL時，對·OH的清除率為45.09%；當黃酮質量濃度為0.65mg/mL時，對DPPH自由基清除率的為63.12%。

綜上所述，采用響應面法優化豬鬃草總黃酮的提取工藝是合理可靠的，可用于豬鬃草總黃酮的提取。本研究結果表明，豬鬃草總黃酮具有很好的抗氧化活性，可以作為天然抗氧化劑資源進行開發利用。相關研究結果為豬鬃草總黃酮的提取及抗氧化活性成分的開發提供了科學依據。然而，有關豬鬃草總黃酮體內抗氧化性以及抗氧化作用的機理尚不清楚，有待進一步的研究。

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（收稿日期：202-02-03? 編輯：劉? 斌）