秦皮素與人血清白蛋白相互作用研究①

王倩鈺,郭 嬡,王文強,凡思華,黃柳燕,張 強,王景濤

(1. 佳木斯大學公共衛生學院,黑龍江 佳木斯 154007;2. 廣東石油化工學院生物與食品工程學院,廣東 茂名 525000)

秦皮素(fraxetin)是一種從中草藥秦皮中提取的天然香豆素化合物。目前研究表明,秦皮素具有多種藥理活性,如抗菌、抗炎、抗氧化、神經保護、抗腫瘤以及免疫調節作用等[1～4]。人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是人體內最豐富的血漿蛋白,濃度達到40 mg/mL,約占血漿總蛋白的60%[5, 6]。HSA可與許多內源性和外源性化合物結合,在藥物吸收、分布、排泄和代謝中發揮重要作用[7,8]。因此,研究秦皮素與HSA的相互作用,有助于深入認識秦皮素在體內轉運輸送的效率及其對HSA結構和功能的影響,為明確其潛在的毒性作用提供依據。本研究應用熒光光譜法,在模擬人體生理酸度(pH 7.4)下,研究秦皮素與HSA互作的特征,從分子水平上揭示二者結合的機制,為秦皮素的安全應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

HSA(北京索萊寶科技有限公司);秦皮素(純度≥99%,上海笛柏生物科技有限公司);8-苯胺-1-萘磺酸(ANS,純度96%,上海麥克林生化科技股份有限公司);布洛芬(純度≥98%,上海麥克林生化科技股份有限公司);華法林鈉(純度≥98%,上海麥克林生化科技股份有限公司);氯化血紅素(純度98%,上海麥克林生化科技股份有限公司);洋地黃苷(純度≥98%,上海麥克林生化科技股份有限公司);實驗中使用的其他試劑均為分析純。

1.2 樣品溶液的制備

采用PBS(pH 7.4)配置HSA,濃度為5×10-6mol/L。秦皮素溶解于二甲亞砜(DMSO),母液濃度為4×10-2molL-1。

1.3 熒光光譜測量

向1.0mL HSA(5×10-6mol/L)溶液中,連續滴加5×10-3mol L-1的秦皮素溶液,使其濃度保持在0～5×10-6mol/L。采用F97XP熒光分光光度計(上海,中國)測定含或不含秦皮素、十二烷基硫酸鈉(SDS)和尿素的HSA溶液的熒光光譜。激發波長為280 nm。發射掃描記錄范圍為200～500nm,掃描速度為1000nm/min。激發和發射的狹縫寬度均固定在10nm。熒光測量分別在四種溫度(298 K、303 K、310 K、313K)下進行。

1.3.1 熒光猝滅機理的測定

熒光猝滅是指由各種分子相互作用,如激發態反應、能量轉移、基態復合物形成和碰撞猝滅,導致熒光團的熒光量子產率降低。藥物分子可以通過動態或靜態猝滅機制與人HSA相互作用,通過使用下面的Stern-Volmer方程(方程①)可闡明熒光猝滅機制。

F0/F=1+Kq·τ0·Q=1+KSV·Q

①

其中F0和F分別代表沒有和有猝滅劑(秦皮素)時HSA的熒光強度,Kq是雙分子猝滅常數,τ0是熒光團在沒有猝滅劑(τ0=10-8s)的情況下的壽命,Q是猝滅劑的濃度,Ksv是動態猝滅常數。

1.3.2 表觀結合常數和位點數的測定

在靜態淬滅中,結合常數(K)和結合位點(n)可以根據雙對數方程②獲得。

lg[(F0-F)/F] = lgKa + n·lgQ

②

其中F0和F分別為有無秦皮素存在時的穩態熒光強度,Ka為結合常數,n為結合位點數,Q為猝滅劑濃度。

1.3.3 表觀熱力學參數的測定

基于范特霍夫方程(方程③)和熱力學方程(方程④)計算了秦皮素與HSA相互作用的焓變化、自由能變化和熵變化。

ln Ka=H/(RT)+S/R

③

ΔG=RTlnKa=ΔH-TΔS

④

其中Ka是結合常數,T是絕對溫度,R是氣體常數(8.314J/mol·K)。通常,小分子化合物和生物大分子之間存在四種代表性的相互作用力,即疏水力、氫鍵相互作用、范德華力和靜電相互作用。當ΔH>0和ΔS>0時,主要的結合力是疏水相互作用。當ΔH<0和ΔS<0時,主要的結合力是范德華或氫鍵相互作用。當ΔH<0和ΔS>0時,結合過程中發生氫鍵和疏水相互作用。

1.4 同步熒光光譜學

互作體系與熒光光譜測量相同。激發波長和發射波長(Δλ)之間的差異穩定在15nm或60nm,電壓為650V,激發和發射狹縫寬度均設置為5.0nm。

1.5 疏水探針

互作體系中HSA濃度為5.0×10-6mol/L,秦皮素/ANS濃度在5～45×10-6M之間變化,測定HSA熒光(ex=280 nm,em=340nm)。另一組互作體系中,將秦皮素加入到等摩爾濃度比的HSA-ANS(二者濃度為5.0×10-6mol/L)溶液中,秦皮素的濃度在5～45×10-6mol/L之間,測定ANS熒光(ex=370nm,em=465nm)。

2 結果

2.1 熒光猝滅分析

圖1A顯示,HSA溶液中秦皮素濃度逐漸增加時,HSA的熒光強度值逐漸降低,表明秦皮素對HSA具有熒光淬滅作用。在此過程中,HSA的最大發射熒光峰發生藍移,表明秦皮素與HSA結合形成了復合物,引起熒光光譜特征發生改變。由Stern-Volmer方程擬合得到的圖1B顯示,在秦皮素濃度5～45×10-6mol/L范圍內,F0/F與[D]線性關系良好,且由表1可知,各溫度下秦皮素對HSA熒光淬滅速率常數Kq均大于最大動態熒光淬滅速率常數2.0×1010L/mol·s,表明秦皮素對HSA熒光的淬滅作用是由復合物形成而引起,即靜態淬滅,這與熒光淬滅圖譜顯示結果(圖1A)相符。

表1 不同溫度下秦皮素與HSA作用的淬滅速率常數(Ksv)和雙分子猝滅速率常數(Kq)

A:不同濃度秦皮素對HSA熒光光譜影響;B:Stern-Volmer分析圖;C:雙對數分析圖。A作用溫度298K,B和C作用溫度298K、303K、310K和313K,HSA濃度為5μmol/L,秦皮素濃度為0、5、10、15、20、25、30、35、40μmol/L(從1到9)。

通過進一步分析,以lg[(F0-F)/F]對應lgQ作圖得到圖1C,由曲線的截距和斜率計算秦皮素與HSA作用的結合常數Ka及結合位點n。如表2所示,秦皮素與HSA的結合常數Ka隨溫度升高而增大,說明在一定程度上升高溫度能夠促進二者結合。同時,結合位n隨溫度增加逐漸接近1,說明秦皮素與HSA結合的飽和位點個數為1。

表2 不同溫度下秦皮素與HSA相互作用的表觀結合常數(Ka)、結合位點(n)以及三個表觀熱力學參數

表2中,各溫度下秦皮素與HSA相互作用的自由能G值分別為-25.1、-26.5、-28.5和-29.4kJ/mol,表明二者相互作用是一個自發的非共價結合過程。同時,秦皮素與HSA相互作用的焓變ΔH和熵變ΔS均>0,表明在生理條件下,二者相互作用以疏水力為主。

2.2 同步熒光分析

秦皮素與HSA相互作用的同步熒光光譜分析結果如圖2所示。Δλ=15 nm和Δλ=60nm條件下,增加秦皮素濃度,均可引起HSA特征熒光吸收峰連續猝滅,并且表現藍移趨勢特征,進一步驗證秦皮素與HSA主要通過疏水力產生相互作用。

A:Δλ=15 nm同步熒光光譜;B:Δλ=60nm同步熒光光譜。作用溫度298K,HSA濃度為5μmol/L,秦皮素濃度為0、5、10、15、20、25、30、35、40μmol/L(從1到9)。

2.3 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜技術可以完整呈現樣品的熒光信息,能夠同時描述熒光強度隨激發和發射波長變化而出現的光譜信息。如圖3所示,HSA三維熒光光譜主要有Peak A和PeaK B兩個峰,Peak A(λex = 280 nm,λem= 340 nm左右)主要反映Trp和Tyr殘基的光譜特征。PeaK B是瑞利散射峰(λex = λem)。秦皮素與HSA共同存在時,Peak A相對熒光強度急劇下降,并出現新峰Peak 1(見圖3B),表明秦皮素與HSA相互作用改變了HSA的結構、氨基酸殘基的微環境以及熒光發射峰強度。三維熒光光譜結果進一步驗證了熒光光譜和同步熒光光譜的結果。

A:HSA(5μmol/L)三維熒光光譜;B:秦皮素(25μmol/L)+HSA(5μmol/L)三維熒光光譜。A和B作用溫度均為298 K。

2.4 疏水探針

熒光染料8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)對微環境的變化敏感,可以檢測蛋白質的結構變化。游離ANS表現出輕微或沒有熒光,當與蛋白質的疏水區域結合時,其熒光值顯著增高。以相對熒光強度(F/F0)對秦皮素濃度[Ligand]作圖,如圖4所示。隨著秦皮素逐步加入,ANS的相對熒光強度逐漸降低,表明秦皮素能夠與ANS競爭結合HSA的同一疏水區域。

圖4 秦皮素與HSA相互作用的疏水探針分析

3 討論

熒光光譜法可以分析蛋白質中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的微環境改變,具有用量少、損耗小和儀器靈敏度高、分析成本低的優點[9]。如果某藥物能夠與蛋白質相互作用,蛋白分子的內源性熒光會發生猝滅,可以通過研究熒光猝滅機制獲得這一藥物與蛋白質結合的熱力學參數,如結合常數、結合位點數、焓變和熵變等[10],確定它們之間主要作用力類型,考察蛋白質氨基酸殘基所處微環境和二級結構的變化,探究分子間的相互作用形式及作用位點,從而為闡明藥物分子與蛋白質之間的作用機理提供重要信息。

蛋白質的熒光主要由Trp殘基,Tyr殘基以及Phe殘基的發色團產生,其中Trp殘基和Tyr殘基在280nm處共同被激發,在340nm處有一個特征發射峰[11]。在本研究中,秦皮素能夠淬滅HSA熒光,表明其很可能對疏水性Trp殘基和Tyr殘基具有影響。同時,秦皮素對HSA的熒光猝滅方式為靜態猝滅,其結合過程是自發放熱反應。藥物與蛋白質相互作用的兩個關鍵非共價作用力是氫鍵和疏水相互作用[12]。通過同步熒光光譜的掃描檢測可以得到特定熒光光色基團的周圍微環境信息[13]。當λem與λex的波長差Δλ=60nm時,同步熒光光譜法結果主要表現為色氨酸(Trp)殘基的光譜信息;當激發和發射波長差Δλ=15nm時,表現為酪氨酸(Tyr)殘基的微環境光譜特性[14]。藥物與蛋白結合前后,最大發射波長的峰位變化可以反映出蛋白分子中發光基團微環境的極性變化,峰位紅移說明氨基酸附近微環境極性增強,肽鏈伸展,結構疏松;峰位藍移則表示發色基團微環境極性減弱,疏水性增加[15]。秦皮素與HSA的同步熒光光譜如圖2所示,其中Δλ=60nm的猝滅程度明顯大于Δλ=15nm,這說明秦皮素與HSA分子中的Trp殘基結合程度更強,Trp殘基的光譜峰位置發生了明顯的藍移,也就是說隨著秦皮素的加入,氨基酸附近微環境極性減弱,疏水性增加。

綜上所述,本研究采用熒光光譜法證明了秦皮素能夠與HSA結合,并揭示了二者相互作用的分子特征及作用力。此項研究為闡明秦皮素在人體內轉運及分布提供重要信息,也為今后秦皮素藥效學、藥代學以及毒理學研究提供參考。