桔梗湯促進肺臟Th1細胞募集及拮抗腫瘤肺臟轉移的作用機制研究

孔令婉，王悅，張玥，張珊，楊雯越，姚成芳，，?

（1. 山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南 250355； 2. 山東中醫藥大學中醫藥創新研究院，山東 濟南 250355； 3. 山東第一醫科大學，山東省醫學科學院，山東 濟南 250117）

肺臟腫瘤的高發病率和高病死率嚴重威脅人類健康。肺臟對淋巴細胞具有較高的依賴性，無論是NK細胞等主導的天然免疫還是T細胞等主導的獲得性免疫，都對維持肺臟免疫微環境的穩定發揮著重要作用。在獲得性免疫中，T細胞是維持肺臟局部免疫反應特異性和持久性的主體免疫細胞，特別是Ⅰ型輔助性T 細胞（type 1 T helper cell，Th1），通過大量分泌γ 干擾素（interferon gamma，IFN-γ）、顆粒酶B（granzyme B，GZMB）等細胞因子發揮抗病毒、抗腫瘤效應［1-3］；同時，Th1還可通過這些細胞因子促進NK、巨噬細胞、樹突狀細胞等天然免疫細胞的活化，增強天然免疫效應。因此，促進肺臟局部淋巴細胞，特別是Th1細胞的局部募集可成為增強肺臟免疫、防治腫瘤發生和發展的重要策略。

桔梗湯（platycodon decoction，PD）是肺系疾病常用方劑，首載于《傷寒雜病論》，由桔梗、甘草組成，具有清熱解毒、利咽止痛、祛痰排膿等功用?，F代藥理研究表明，桔梗湯抗炎作用顯著，可阻斷NF-κB和ERK等信號活化，降低IL-17A、TNF-α等炎性因子的表達，抑制COPD進程或緩解急性肺損傷［4-5］；另有研究證實，桔梗湯可通過調控Th1/Th2細胞平衡，在肝癌、胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤中發揮抗腫瘤效應［6］，但桔梗湯是否可以調控生理狀態下或肺臟腫瘤微環境中Th1在肺臟的分布或募集尚未見報道。本研究利用流式細胞術和單細胞測序等技術，探討桔梗湯在生理狀態下和肺臟腫瘤微環境中，優勢調控Th1細胞在肺臟募集特征及作用機制，為桔梗湯特效治療肺系疾病的臨床應用提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級C57BL/6 雌性小鼠42 只（濟南朋悅實驗動物繁育中心），6～7周齡，體質量18～22 g，動物許可證號：SCXK（魯）20190003，飼養于山東第一醫科大學動物實驗中心，室溫22～26 ℃，相對濕度56%～60%，光照時長12 h，黑暗時長12 h。小鼠適應性飼養1 周，期間自由攝食、飲水。

1.2 實驗藥物與試劑

桔梗、甘草（山東省建聯中藥股份有限公司）；佛波酯、DisPase 酶Ⅱ、離子霉素、蛋白轉錄抑制劑（德國Sigma 公司，貨號：6561-29-8、BCBX6041、871911、569029）；Oligo-dT、TRIzol、M-MLV（美國 Thermo 公司，貨號：406710、279509、00657100）；膠原酶D（瑞士Roche 公司，貨號： 11088858001）；胎牛血清（美國Gemini 公司，貨號：A24G00J）；脫氧核糖核苷、RNA 酶抑制劑（北京康為世紀有限公司，貨號：315A0113、3290-2500）； SYBR?Green master（美國Bio-Rad 公司，貨 號：17282）；破膜 液、Fc-Blocking、CD45-Percp-Cy5.5、CD45-APC-Cy7、CD4-PE、CD3-PE-Cy7、NK1.1-BV510、CXCR3-PE、CD4-BV510、NK1.1-Percp-Cy5.5、IFN-γ-PE-Cy7（美國BD公司，貨號：554714、176542、550994、557659、2293891、560591、563096、562152、100449、551114、557649）；RT-qPCR引物（上海鉑尚生物技術有限公司）。

1.3 實驗儀器

超凈工作臺（型號：SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術公司）；CO2培養箱（型號：STERI-Cyclei160，美國Thermo 公司）；液體真空濃縮煎藥機（型號：YZN50，北京東華原醫療設備有限責任公司）；高速離心機（型號：ST16R，美國Thermo 公司）；細胞計數儀（型號：Countess Ⅱ，美國Thermo 公司）；熒光定量PCR 儀（型號：LightCycler96，羅氏診斷產品有限公司）；PCR 擴增儀（型號：JCS0118，德國Biometra 公司）；酶標儀（型號：Synergy HTX，美國伯騰儀器有限公司）；全自動組織處理器（型號：Gentle MACS，美天旎生物技術有限公司）；震蕩儀（型號：88880018，美國Thermo 公司）；流式細胞儀（型號：FACS Aria Ⅲ，美國BD公司）。

2 實驗方法

2.1 桔梗湯的制備

依據《傷寒雜病論》中的記載，桔梗和甘草的比例為1∶2，因此稱取桔梗250 g，甘草500 g，加入10倍水量浸泡過夜，煮沸后文火煎煮30 min，收集提取液，再次加8 倍水煎煮，合并兩次提取液并進行濃縮、醇沉處理，共得上清5 200 mL，負壓回收乙醇后得藥液240 mL，生藥濃度為3.12 g/mL。4 ℃冰箱保存。HPLC 分析可知，主要藥效成分含量分別為桔梗皂苷D 3 730 μg/mL，甘草苷4 320.75 μg/mL，甘草酸7 801.38 μg/mL。

2.2 動物模型構建及給藥方式

2.2.1 正常小鼠灌胃處理

24 只C57BL/6 雌性小鼠適應性喂養 1 周，依據隨機數字表法分為正常對照組（CTRL 組）和PD 用藥組（PD 組），每組12 只，分別用于流式分析（6 只）和RT-qPCR 檢測（6 只）。按照成人每日服用PD 生藥22.5 g為標準，根據不同動物等效劑量折算系數法，計算每只 小 鼠灌胃劑量 為2.925 g（/kg·d），每天灌 胃1次，連續灌胃10 d，實驗前12 h禁食，自由飲水。

2.2.2 B16黑色素瘤肺轉移模型構建及給藥方式

18 只C57BL/6 雌性小鼠適應性喂養1 周，依據隨機數字表法分為正常對照組（CTRL 組）、B16 黑色素瘤肺轉移模型組（B16 組）和PD 治療組（B16 + PD 組），每組6 只，用于流式分析及分選。除正常對照組外，B16黑色素瘤肺轉移模型組和PD 治療組小鼠尾靜脈注射B16 黑色素瘤細胞（注射濃度為2 × 105個/mL，注射劑量為200 μL/只），其中，PD 治療組小鼠自注射B16 黑色素瘤細胞前3 d 開始灌胃PD，連續灌胃17 d 至實驗結束。動物處理前12 h禁食，自由飲水。

2.3 流式細胞術檢測肺臟Th 細胞及其CXCR3，IFN-γ的表達

取小鼠肺臟，制備單細胞懸液，按照每孔2 × 106個細胞接種24孔板，加入佛波酯、離子酶素、蛋白轉運抑制劑，置5% CO2培養箱孵育5 h。孵育完成后，經200目無菌過濾網將細胞過濾至無菌EP 管中，PBS 緩沖液洗滌兩遍，離心棄上清后加入Fc-Blocking，以阻斷非特異性結合。再次洗滌后加入外標抗體（CD45、CD3、CD4、NK1.1、CXCR3等），放于4 ℃冰箱，避光孵育1 h。PBS 緩沖液再次洗滌后加入穿膜固定液，避光孵育40 min，1 × perm wash洗滌后，加入內標抗體（IFN-γ），放于4 ℃冰箱，避光孵育1 h，洗滌過濾后上機檢測。

2.4 RT-qPCR 檢測肺組織CXCL9，CCL5，IFN-γ，GZMB mRNA水平

取小鼠肺臟，勻漿后加入TRIzol 試劑，室溫放置5 min，提取RNA，檢測其濃度和純度。將RNA 反轉錄合成cDNA，進行實時熒光定量PCR。選用30 μL 的反轉錄體系，18 μL RNA mix（2 μg RNA + 1 μL OligodT + DEPC 水），70 ℃，5 min；再加入12 μL RT mix（6 μL 5 × RT buffer + 3 μL dNTP + 1.5 μL RNase Inhibitor + 1.5 μL RevertAid Reverse TranscriPtase），42 ℃，1 h。反轉錄完成后，選用20 μL 的qPCR 反應體系（1 μL cDNA + 7 μL DEPC水 + 各1 μL上、下游引物 +10 μL SYBR?Green master ），94 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，40 s；72 ℃，5 min； 40 個循環。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.5 單細胞測序分析

取小鼠肺臟，制備單細胞懸液，經流式分選后收集目的細胞并檢測其活性，通過微流控技術收集包裹Cell Barcode 的 bead 和細胞的液滴，裂解液滴中的細胞暴露出mRNA，使細胞標記Cell Barcode，形成 Single Cell GEMs，反轉錄出cDNA 的一條鏈，洗脫序列后，以此為模板通過PCR 合成第二條鏈，并繼續擴增。獲取原始數據后使用FastQC 軟件進行質量評估，使用Cell Ranger軟件進行質量統計，通過Seurat軟件包，Single R數據包篩除質量較低的細胞數據，依據基因表達量對主要數據進行分析，鑒定Marker 基因，細胞類型等，結果使用Loupe Brower進行目的細胞特征基因分析。

2.6 統計學方法

使用GraPhPad Prism 8 軟件統計數據，數據以均數 ± 標準差的形式表示，采用One Way-ANOVA 分析多組間數據、t檢驗分析兩組間數據。P＜ 0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 生理狀態下Th1細胞在肺臟的募集情況

3.1.1 生理狀態下Th細胞在肺臟的募集情況比較

流式細胞術分析結果顯示，與CTRL 組相比，小鼠經PD 灌胃處理后，肺臟CD45+細胞比例和數量均明顯升高（P＜ 0.001）。進一步分析發現，NK細胞比例沒有顯著變化，NKT細胞比例呈下降趨勢，但T細胞比例和數量上升（P＜ 0.001），其中，Th細胞比例和數量升高更為顯著（P＜ 0.001），而CD8+Tc細胞比例相對下降，說明PD可優勢促進Th細胞在肺臟的募集。見表2、圖1。

表2 各組小鼠肺臟淋巴細胞比例及數量比較（±s）

表2 各組小鼠肺臟淋巴細胞比例及數量比較（±s）

注：與CTRL組比較，***P ＜ 0.001。

組別CTRL組PD組Th cells/107 7.95 ± 0.47 12.81 ± 0.84***n6 6 CD45P cells/%55.90 ± 0.01 64.33 ± 2.10***CD45P cells/107 51.69 ± 1.66 69.53 ± 2.29***T cells/%22.60 ± 0.91 27.20 ± 1.29***T cells/107 20.85 ± 0.92 29.25 ± 1.33***Th cells/%38.00 ± 1.01 43.67 ± 1.28***

圖1 各組小鼠肺臟淋巴細胞募集情況

3.1.2 生理狀態下CXCR3+Th 和IFN-γ+Th 細胞在肺臟募集情況比較

CXCR3 是Th1 的標志性趨化因子受體，IFN-γ 是Th1細胞特異性功能因子。流式細胞術分析結果顯示，與CTRL組相比，PD組小鼠肺臟Th細胞表達CXCR3的水平顯著升高，CXCR3+Th細胞比例和數量均上升（P＜0.001，P＜ 0.01）；小鼠肺臟Th細胞表達IFN-γ的水平顯著升高，IFN-γ+Th 細胞比例和數量均上升（P＜0.01，P＜ 0.001）。說明PD可顯著促進CXCR3+Th細胞和IFN-γ+Th細胞在肺臟的募集。見表3、圖2。

表3 各組小鼠肺臟Th細胞CXCR3、IFN-γ表達變化（±s，n = 6）

表3 各組小鼠肺臟Th細胞CXCR3、IFN-γ表達變化（±s，n = 6）

注：與CTRL組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

組別CTRL組PD組IFN-γ+Th cells/107 0.51 ± 0.06 0.93 ± 0.06***CXCR3+Th cells/%5.52 ± 0.40 7.77 ± 0.34***CXCR3+Th cells/107 1.08 ± 0.31 1.73 ± 0.17**IFN-γ+Th cells/%6.37 ± 0.28 7.44 ± 0.52**

圖2 各組小鼠肺臟Th細胞CXCR3、IFN-γ表達情況

3.1.3 生理狀態下肺組織CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA的表達情況比較

CXCL9、CCL5是Th1細胞趨化和遷移的重要趨化因子，IFN-γ、GZMB是Th1細胞的重要功能性因子。RTqPCR結果顯示，與CTRL組相比，經PD灌胃處理后，小鼠肺臟CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA表達水平均不同程度的升高（P＜ 0.001，P＜ 0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.05），說明PD 可通過升高趨化因子CXCL9、CCL5，優勢促進CXCR3+Th細胞在肺臟的分布，并且促進Th1標志性功能因子IFN-γ和GZMB在肺組織中高表達。見表4、圖3。

表4 各組小鼠肺臟CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA表達情況比較（±s，n = 6）

表4 各組小鼠肺臟CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA表達情況比較（±s，n = 6）

注：與CTRL組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

組別CTRL組PD組mRNA相對表達量GZMB 1.03 ± 0.06 1.16 ± 0.08*CXCL9 1.01 ± 0.07 1.75 ± 0.03***CCL5 1.02 ± 0.08 1.16 ± 0.10*IFN-γ 1.03 ± 0.05 1.19 ± 0.07**

圖3 各組小鼠肺組織CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB mRNA表達情況

3.2 Th1 細胞在肺臟腫瘤微環境中分布并抑制B16黑色素瘤的肺轉移情況

3.2.1 肺臟腫瘤微環境中Th細胞的募集情況比較

流式細胞術分析結果顯示，與CTRL 組相比，B16模型小鼠肺臟Th 細胞比例和數量均下降（P＜ 0.001，P＜ 0.05），經PD 治療后，Th細胞比例和數量均顯著升高（P＜ 0.001，P＜ 0.001）。說明在肺臟腫瘤微環境中，PD可促進Th細胞的浸潤或分布。見表5、圖4。

表5 各組小鼠肺臟Th細胞比例及數量變化（±s，n = 6）

表5 各組小鼠肺臟Th細胞比例及數量變化（±s，n = 6）

注：與CTRL 組比較，*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001；與B16 組比較，###P ＜0.001。

Th cells/107 105.7 ± 10.83 90.70 ± 6.22*114.8 ± 7.63###組別CTRL組B16組B16 + PD組Th cells/%44.33 ± 1.45 38.58 ± 2.06***50.20 ± 1.02***###

圖4 各組小鼠肺臟Th細胞募集情況

3.2.2 CXCR3+Th 和IFN-γ+Th 細胞在肺臟腫瘤微環境中的募集情況比較

在B16黑色素瘤肺轉移模型中，經PD治療后，肺臟腫瘤克隆數明顯減少（P＜ 0.01），PD對B16黑色素瘤肺轉移具有顯著的抑制作用。流式細胞術分析結果顯示，與B16模型組相比，經PD治療后，小鼠肺臟Th細胞高表達CXCR3 和IFN-γ，CXCR3+Th 細胞比例和數量均升高（P＜ 0.001，P＜ 0.01），IFN-γ+Th細胞比例和數量均升高（P＜ 0.001，P＜ 0.01）。說明在肺臟腫瘤微環境中，PD 可促進CXCR3+Th 和IFN-γ+Th 細胞在肺臟募集，使其成為肺臟抗腫瘤的重要效應細胞。見表6、圖5。

表6 各組小鼠肺臟腫瘤克隆及Th細胞表達CXCR3、IFN-γ比較（±s）

表6 各組小鼠肺臟腫瘤克隆及Th細胞表達CXCR3、IFN-γ比較（±s）

注：與CTRL組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；與B16組比較，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001。

組別CTRL組B16組B16 + PD組IFN-γ+Th cells/107 3.59 ± 0.81 3.44 ± 0.86**##7.62 ± 1.39**##n 6 6 6腫瘤克隆—93.67 ± 12.69 69.33 ± 3.62##CXCR3+Th cells/%3.81 ± 0.28 10.95 ± 1.08***21.83 ± 1.267***###CXCR3+Th cells/107 4.45 ± 0.49 14.86 ± 3.27**23.54 ± 1.37***##IFN-γ+Th cells/%3.67 ± 0.24 3.20 ± 0.29 6.17 ± 0.99***###

圖5 各組小鼠肺臟腫瘤克隆及Th細胞CXCR3，IFN-γ表達情況

3.2.3 肺臟腫瘤微環境中CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB基因的轉錄水平情況比較

單細胞測序分析發現，經PD 治療后，小鼠肺臟腫瘤微環境中CXCL9，CCL5 基因轉錄水平顯著升高，同時，小鼠肺臟Th1細胞數由59升高至89，并且Th1細胞中IFN-γ 和GZMB 基因轉錄水平也明顯升高，說明在肺臟腫瘤微環境中，PD 可促進肺臟細胞高表達趨化因子CXCL9 和CCL5，促進Th1 細胞在局部募集，且高表達IFN-γ 和GZMB 等抗腫瘤效應因子，進而抑制B16黑色素瘤肺轉移，發揮抗腫瘤作用。見圖6。

圖6 各組小鼠肺臟腫瘤微環境中Th1細胞分布及CXCL9、CCL5、IFN-γ、GZMB基因轉錄水平變化

4 討論

T 細胞是維持肺臟免疫微環境穩定的重要細胞群體，其中，Th 細胞因大量分泌多種細胞因子，成為維持免疫微環境穩定、肺臟局部免疫反應特異性和長效性的關鍵。目前對Th細胞亞群的認識越來越豐富，根據表型和細胞因子分泌特征可將Th 分為Th1、Th2、Th17、Treg、Th9 和Tfh 等多個細胞亞群。其中，Th1 細胞以大量分泌IFN-γ 為主要特征，廣泛刺激天然免疫細胞和獲得性免疫細胞的活化和增殖［7］。在先天免疫反應中，IFN-γ 促進巨噬細胞、Ⅰ型先天淋巴樣細胞（ILC1s）和自然殺傷細胞（NK）的激活；可誘導抗原呈遞細胞（APC）主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子高表達；驅動樹突狀細胞（DC）的擴增，全面協調抗腫瘤先天免疫反應，在腫瘤發展早期作用尤為顯著［8-10］。在適應性免疫過程中，IFN-γ 促進B 細胞產生抗體，加速Th1 極化，促進細胞毒性T 細胞（CTL）的激活和記憶T 細胞（Tm）的擴增，從而增強特異性和持久性抗腫瘤免疫［11-13］。近年來研究發現，Th1 的特異性轉錄因子T-bet 也可誘導Th1 細胞表達GZMB，PRF1 等殺傷性效應因子，實現MHC-Ⅱ限制性和抗原特異性殺傷功能，進一步強化了Th1 細胞的抗腫瘤效能［14］，使Th1 成為抗腫瘤免疫反應的主力軍和放大器。因此，優勢促進Th1細胞在肺臟募集，是保持肺臟局部防御體系完整性、高效性和長效性的重要策略。

Th1 細胞表達CXCR3、CXCR4 和CCR5 趨化因子受體，可在CXCL9/10/11/12 和CCL5 等趨化因子的引導下進行組織分布。其中，Th1細胞優勢表達CXCR3，CXCR3+Th1 細胞具有快速遷移、迅速識別病原信號和大量分泌IFN-γ、GZMB等效應因子的特性，是駐守肺臟門戶的重要防御力量［15-17］。

本研究發現，無論是生理狀態下還是腫瘤微環境中，PD 均可促進小鼠肺臟Th 細胞IFN-γ、CXCR3 表達，提示PD 可優勢促進Th1 細胞在肺臟募集，這與PD上調肺臟基質細胞CXCL9、CCL5的表達密切相關。另外，PD 可增強Th1 對IFN-γ、GZMB 等效應因子的釋放能力，而IFN-γ 可進一步促進CXCL9、CXCR3 的表達［18］，循環放大了Th1免疫效應，逆轉腫瘤微環境的免疫抑制狀態。PD 治療后肺臟腫瘤克隆數顯著降低，同時Th1 細胞中IFN-γ 和GZMB 表達升高，這些結果為PD 靶向調控Th1 募集和活化，放大抗腫瘤效應提供了有力證據。B16 模型組小鼠肺臟CXCR3+Th 細胞比例也明顯升高，但IFN-γ 分泌能力顯著下降，其升高的CXCR3+Th 細胞主要來源于Th17 細胞（結果未展示）。進一步說明PD 可通過促進肺臟趨化因子CXCL9、CCL5 的表達，優勢募集Th1 細胞，并大量分泌IFN-γ和GZMB，全面提高肺臟抗腫瘤免疫功能，抑制B16 黑色素瘤的肺轉移，為PD抗腫瘤肺臟轉移的臨床應用提供了科學依據。

本研究的局限性在于針對PD 的藥理研究沒有進行劑量依賴性系統觀察，雖然檢測了PD中部分有效成分的含量，但仍需對這些成分開展細胞選擇性和趨化因子靶向性的藥理機制研究，為PD的臨床應用提供更加精準的科學證據。