美洲大蠊提取物體外對肝癌耐藥細胞BEL-7402/5-FU自噬和侵襲轉(zhuǎn)移的影響

馬璟婷，周杰，李彩琳，吳定宇，彭芳?

（1. 大理大學藥學院，云南 大理 671000； 2. 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南 大理 671000）

肝細胞癌（hepatocellualar carcinoma，HCC），簡稱肝癌，是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因［1］。近年來，全球大部分國家和地區(qū)的肝癌發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢［2-3］。我國每年肝癌的增加患者達到40 萬人，病死率是全球病死率的2.54 倍［4-5］。HCC 的發(fā)生是一個涉及多種危險因素的復雜過程，治療方法主要包括藥物化療和手術(shù)治療，但肝癌患者在接受藥物化療后易產(chǎn)生耐藥性，甚至是產(chǎn)生多藥耐藥性（multiple drug resistance，MDR）［6］。MDR的產(chǎn)生不僅使本身治療的藥物產(chǎn)生耐藥，可能還會使其他具有不同結(jié)構(gòu)和作用機制的化療藥物也產(chǎn)生耐藥性，已成為腫瘤化療成功的最大障礙［7］。目前，很多西藥在逆轉(zhuǎn)耐藥性方面多針對單一機制入手，但其不良反應大，在臨床應用中有很大的局限性。

中藥具有高效低毒、多靶點、特異性強等特點，可通過多個途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤的MDR［8］。美洲大蠊（Periplaneta americanaL.）作為蜚蠊科體積最大的藥用昆蟲在我國古代中醫(yī)藥書目中早有記載。本研究團隊的前期實驗研究表明，美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏具有逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的效果，且初步探明其可能是通過減少藥物外排、促進細胞凋亡、減少多藥耐藥相關(guān)基因和酶介導多藥耐藥途徑中相關(guān)基因的mRNA及其蛋白的表達等方式逆轉(zhuǎn)肝癌的MDR［9-11］，但對產(chǎn)生了MDR 的惡性腫瘤組織的高浸潤和高轉(zhuǎn)移的特性研究尚未見報道。因此，本研究以肝癌敏感細胞BEL-7402 和耐藥細胞BEL-7402/5-FU（5-fluorouracil，5-FU）為試驗對象，并給予CⅡ-3 和脫脂膏進行干預，以此來探討這些美洲大蠊提取物是否具有影響耐藥細胞自噬和侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細胞株

人肝細胞癌敏感細胞株BEL-7402、5-FU人肝細胞癌細胞株（BEL-7402/5-FU），批號均為：MXC050，由上海美軒生物科技有限公司提供。

1.2 主要樣品與試劑

美洲大蠊提取物脫脂膏系褐色黏稠膏狀，得率約為75.18%，批號：P14805-20171023，由美洲大蠊干燥蟲體的醇提物制備的浸膏制得；美洲大蠊脫脂膏進一步純化粗提取得CⅡ-3為黃褐色凍干粉末，得率約為0.2%，批號：17102125，以上兩種均由大理大學昆蟲生物醫(yī)藥研究院張成桂博士提供。5-FU（美國 Sigma公司，批號：WXBC0190V）；索拉非尼（北京索萊寶科技有限公司，批號：819C021）；0.25% Trypsin-EDTA 胰酶（MESGEN 公司，批號：092619200313）；ECL 試劑盒（南京建成生物科技有限公司，批號：092019200325）。

1.3 主要儀器

PCR 儀（美國伯樂公司，型號：785BR15145）；激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡公司，型號：Leica TCS SP8 X）；酶標儀（美國Bio-Teck公司，型號：225939）。

2 方法

2.1 腫瘤細胞的培養(yǎng)

常規(guī)培養(yǎng)BEL-7402 細胞，并選擇對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

2.2 主要藥品配制

用二甲亞砜配制母液為100 mg/mL 的美洲大蠊提取物CⅡ-3 和脫脂膏，索拉菲尼則配成10 mg/mL 的藥物母液，以上均置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩嶒灂r用培養(yǎng)基倍比稀釋為實驗所需的各個濃度。

2.3 分組與給藥

試驗分為敏感組、耐藥組、索拉菲尼組、CⅡ-3 組和脫脂膏組。其中，敏感組加入BEL-7402 細胞，其余各組加入BEL-7402/5-FU 細胞。給藥時，敏感組和耐藥組加入常規(guī)培養(yǎng)基，索拉菲尼組給予3 μg/mL索拉菲尼，CⅡ-3 組和脫脂膏組則分別加入200 μg/mL CⅡ-3和脫脂膏。

2.4 免疫細胞化學法檢測自噬標志性蛋白p62的生成

取對數(shù)生長期的BEL-7402和BEL-7402/5-FU細胞經(jīng)處理后制成單細胞懸液，然后按2 × 106個/皿的細胞密度接種于事先放有細胞爬片的12 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后按照上述實驗分組分別加入含相應濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。經(jīng)過一定的孵育、清洗、顯色、脫水、封片等系列處理后，在倒置顯微鏡下觀察拍照。通過Image J 軟件計算灰度值，結(jié)果圖采用Graphpad Prism 8軟件繪制。

2.5 激光共聚焦檢測細胞自噬蛋白LC3形成

細胞前期處理及加受試藥等操作基本同“2.4”項，按每皿3 × 104個的細胞密度進行接種。隨后按照LC3檢測的基本程序進行操作。第2 天于激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

2.6 實時熒光定量法檢測細胞自噬和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子mRNA水平

取對數(shù)生長期的BEL-7402 和BEL-7402/5-FU 細胞制成單細胞懸液，按每皿1 × 107個的細胞的密度接種于皿中，按照上述分組給藥。加入Trizol 試劑提取RNA，然后按第一鏈合成試劑盒說明進行操作。分別在42 ℃ 60 min、80 ℃ 10 min 的反應條件進行逆轉(zhuǎn)錄。隨后在建立20 μL 反應體系、落實自噬和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子引物后觀察RT-PCR 反應，并按照以下公式計算各基因的相對表達量。引物序列表見表1 和表2。

表1 自噬相關(guān)因子引物序列表

表2 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子引物序列表

2.7 劃痕試驗檢測細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力

取對數(shù)生長期的BEL-7402 以及BEL-7402/5-FU 制成單細胞懸液后，按6 × 105個/皿的細胞密度接種于在底部（背面）畫直線的小皿中，按照上述分組給藥進行處理。按劃痕試驗操作步驟進行操作，并分別在24、48 h顯微鏡下拍照記錄劃痕的愈合情況，并按照以下公式計算細胞劃痕的愈合率。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 各組對p62蛋白水平的比較

結(jié)果顯示，與敏感組相比，耐藥組細胞中p62 蛋白表達量明顯降低（P＜ 0.01），提示耐藥組細胞自噬作用增強。給予索拉菲尼、CⅡ-3 和脫脂膏后，耐藥細胞中p62 蛋白表達量則顯著升高（P＜ 0.01），表明CⅡ-3 和脫脂膏可明顯抑制肝癌耐藥細胞的自噬作用。見圖1和表3。

表3 各組細胞中p62蛋白水平比較（±s）

注：與敏感組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與耐藥組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

p62（相對表達量）0.16 ± 0.01 0.09 ± 0.01**0.11 ± 0.01**#0.13 ± 0.01**##0.12 ± 0.01**##組別敏感組耐藥組索拉非尼組CⅡ-3組脫脂膏組n6 6 6 6 6

3.2 各組對LC3蛋白形成的影響

本研究采用熒光標記法來觀察LC3蛋白。與敏感組相比，耐藥組細胞具有更多的綠色熒光斑點，提示耐藥組細胞可能具有更強的自噬作用。在使用CⅡ-3和脫脂膏處理后，耐藥組中的綠色熒光部分減少，表明CⅡ-3 可顯著抑制細胞的自噬作用，而脫脂膏組的作用效果并不顯著。見圖2。

圖2 各組對細胞中LC3蛋白形成的影響（× 200）

3.3 各組對自噬相關(guān)因子mRNA的影響

與敏感組細胞相比，耐藥組中自噬相關(guān)因子自噬相關(guān)蛋白5（autophagy related 5，ATG 5）、自噬相關(guān)蛋白7（autophagy related 7，ATG 7）、磷酸肌醇-3-激酶3（phosphoinositide-3-kinase class 3，PIK3C3）、BECLIN 蛋白（BECLIN protein，BECLIN）、LC3B 均呈現(xiàn)高表達，而p62的表達量顯著降低；給予CⅡ-3和脫脂膏處理后，可顯著抑制ATG5、PIK3C3、BECLIN、LC3B的表達，升高耐藥組中p62的表達。其中，CⅡ-3對ATG7的表達無顯著影響，而脫脂膏則可明顯升高其表達。見表4。

表4 各組對自噬相關(guān)因子mRNA的影響比較（±s）

表4 各組對自噬相關(guān)因子mRNA的影響比較（±s）

注：與敏感組比較，*P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01；與耐藥組比較，#P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01；與索拉非尼組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。

組別敏感組耐藥組索拉菲尼組CⅡ-3組脫脂膏組p62 1.86 ± 0.25 1.00 ± 0.00*0.14 ± 0.02*##0.74 ± 0.14##1.61 ± 0.29**##n 6 6 6 6 6 ATG7 0.8 ± 0.07 1.00 ± 0.00 1.12 ± 0.21*0.96 ± 0.15 1.52 ± 0.31*##△ATG5 0.85 ± 0.11 1.00 ± 0.00 0.25 ± 0.05**##0.63 ± 0.10**##0.52 ± 0.10**##PIK3C3 0.49 ± 0.09 1.00 ± 0.00**0.29 ± 0.05*##0.42 ± 0.14##△0.74 ± 0.15*##△△BECLIN 0.25 ± 0.05 1.00 ± 0.00**0.13 ± 0.01**##0.10 ± 0.02**##△0.22 ± 0.03**##LC3B 0.59 ± 0.06 1.00 ± 0.00**0.30 ± 0.03**##0.83 ± 0.05**#0.61 ± 0.19#

3.4 各組對侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子mRNA的影響比較

與敏感組細胞相比，耐藥組中侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子除哺乳動物雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表達降低外，金屬基質(zhì)蛋白酶2（metal matrix proteinase-2，MMP-2）、金屬基質(zhì)蛋白酶9（metal matrix proteinase-9，MMP-9）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）蛋白、真核細胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）的表達均顯著升高；給予CⅡ-3和脫脂膏后可顯著降低耐藥細胞中MMP-9、Akt、4EBP1 的表達，而升高MMP-2、mTOR的表達。以上結(jié)果表明CⅡ-3和脫脂膏均可影響耐藥肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移因子。見表5。

表5 各組對細胞侵襲相關(guān)因子mRNA的影響比較（±s）

表5 各組對細胞侵襲相關(guān)因子mRNA的影響比較（±s）

注：與敏感組比較，*P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01；與耐藥組比較，#P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01；與索拉非尼組比較，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。

組別敏感組耐藥組索拉非尼組CⅡ-3組脫脂膏組4EBP1 0.72 ± 0.12 1.00 ± 0.00*0.14 ± 0.02#0.80 ± 0.09△0.29 ± 0.05#n 6 6 6 6 6 MMP-2 0.13 ± 0.05 1.00 ± 0.00**0.02 ± 0.01##1.43 ± 0.57**#△△1.20 ± 0.19**△△MMP-9 0.11 ± 0.02 1.00 ± 0.00**0.00 ± 0.01##0.65 ± 0.14**##△△0.05 ± 0.01##mTOR 1.25 ± 0.2 1.00 ± 0.00*0.24 ± 0.05*##1.15 ± 0.39 1.25 ± 0.41△Akt 0.48 ± 0.12 1.00 ± 0.00**0.18 ± 0.04**##0.36 ± 0.09##△0.24 ± 0.13*##△

3.5 各組對細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響比較

在劃痕試驗中，細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力越強細胞劃痕的愈合速度越快，愈合率越高。和敏感細胞相比，耐藥細胞在24、48 h時細胞的劃痕愈合率較高，表明耐藥細胞比敏感細胞具有更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力；給予陽性藥索拉菲尼和CⅡ-3作用24、48 h后劃痕愈合率顯著降低，說明CⅡ-3 可顯著抑制細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而脫脂膏則無顯著的抑制效果。見表6。

表6 各組對細胞劃痕愈合率的影響比較（±s）

表6 各組對細胞劃痕愈合率的影響比較（±s）

注：與敏感組比較，*P ＜ 0.05；與耐藥組比較，#P ＜ 0.05；與索拉非尼組比較，△P ＜ 0.05。

劃率組別48 h 55.98 ± 5.20 75.06 ± 9.79*41.40 ± 3.45*#50.13 ± 5.77#△67.51 ± 6.92*△n 6 6 6 6 6 24 h 23.79 ± 5.77 38.69 ± 6.20*27.01 ± 4.37#28.15 ± 5.60#36.21 ± 6.53*△敏感組耐藥組索拉非尼組CⅡ-3組脫脂膏組

4 討論

針對目前高發(fā)的HCC，臨床上治療主要手段還是以化學治療為主，如目前臨床效果較好的索拉非尼。但由于化學治療藥物的長期使用造成了MDR，而新的藥物研究成本大，研究時間長等使得我國HCC 目前的臨床治療現(xiàn)狀不容樂觀。作為HCC 發(fā)病率大國，提高HCC的有效治療，增加有效治愈率，克服HCC的多藥耐藥等已經(jīng)成為了HCC治療中亟待解決的問題。而諸多中藥具有高效、低毒、作用靶點并不單一的特點，美洲大蠊作為昆蟲藥物具有極其重要的作用，其化學成分非常豐富，主要含蛋白類、多肽類、糖類、脂肪酸類化合物［12-14］。豐富的化學成分為美洲大蠊發(fā)揮多樣的藥理活性提供了可能［15-17］。本研究團隊通過幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏具有抗腫瘤的作用，也有一定的對抗腫瘤MDR 的作用［9-11，18-19］，而對CⅡ-3和脫脂膏是否影響腫瘤的自噬與侵襲轉(zhuǎn)移則沒有深入的研究。因此，筆者就是針對這一問題展開研究。

細胞自噬是一種自我降解的機制，是依賴溶酶體的自我消化過程。其中LC3 蛋白和p62 蛋白均可作為在自噬起始階段自噬體的標記蛋白，且在肝癌組織及癌旁組織中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)［20］。LC3是自噬體與溶酶體融合的關(guān)鍵分子。在自噬過程中，LC3 被蛋白酶ATG4 裂解產(chǎn)生LC3-Ⅰ，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ能與p62 蛋白相互作用，p62 能把膜結(jié)合的LC3-Ⅱ蛋白將其送至自噬小體進行降解。另外，p62 蛋白本身也能被自噬降解，因此p62 蛋白在細胞質(zhì)中的積累被用作自噬通量減少的標志［21］。自噬相關(guān)基因ATG 家族在自噬過程中也扮演了極其重要的角色，其中ATG5 能促進自噬前體膜的延伸，如果其本身突變，還會影響自噬體的形成。ATG7在自噬體的形成過程中起到了重要的調(diào)控作用。本實驗用肝癌敏感細胞BEL-7402 和肝癌耐藥多藥耐藥細胞BEL-7402/5-FU 為試驗對象，通過免疫細胞化學法和激光共聚焦試驗觀察細胞的自噬蛋白表達，通過RT-PCR檢測自噬相關(guān)因子的表達。實驗結(jié)果顯示，美洲大蠊提取物CⅡ-3 和脫脂膏可對自噬相關(guān)因子產(chǎn)生不同程度的影響，其中對ATG5 影響最為明顯，而對ATG7以及p62 的影響較小，表明美洲大蠊提取物可能只能作用于自噬的某些階段。

侵襲轉(zhuǎn)移在腫瘤細胞生命活動中具有重要作用。MMP家族可以通過降解膠原蛋白和層粘連蛋白來促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［22-24］，而這個家族蛋白中尤以MMP-2和MMP-9與腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤密切相關(guān)，兩者在正常細胞及癌細胞中的高表達均能增加細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［12，25-27］。另外mTOR、Akt、4EBP1等相關(guān)因子也能影響腫瘤細胞的凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等一系列生命活動［13］。因此，本研究通過檢測侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達和利用劃痕試驗檢測細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力來間接反映美洲大蠊提取物CⅡ-3和脫脂膏是否通過影響細胞的侵襲轉(zhuǎn)移來發(fā)揮抗HCC的作用。試驗結(jié)果表明耐藥肝癌細胞具有更強侵襲轉(zhuǎn)移能力，且美洲大蠊提取物能抑制耐藥細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，但僅僅能影響部分相關(guān)因子。本研究主要是基于mRNA水平進行檢測，仍存在一定的局限性，在后續(xù)實驗中，還需要對更多檢測水平進行研究并進一步探索美洲大蠊提取物對自噬和侵襲轉(zhuǎn)移的體內(nèi)影響，為美洲大蠊提取物逆轉(zhuǎn)肝癌 MDR的臨床研究奠定基礎(chǔ)。