酒、醋、鹽炙赤芍物性參數與化學成分相關性分析

王春燕，史可，王嬌，馬彥江，陳天朝，?

（1. 河南中醫藥大學，河南 鄭州 450008； 2. 河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000）

赤芍為毛茛科植物芍藥（PaeonialactifloraPall.）或川赤芍（PaeoniaveitchiiLynch）的干燥根［1］。赤芍始載于《神農本草經》，其味苦，性微寒，歸肝經，在臨床上常以川芎-赤芍藥對的形式出現，具有清熱涼血、散瘀止痛之功效［2-3］。赤芍中化學成分復雜，不僅含有淀粉、糖類等大分子物質，亦有萜類及其苷、黃酮類、酚酸、鞣質類等小分子物質，其中萜類及其苷在芍藥中的含量極高，是赤芍發揮藥效的主要活性成分［4］。赤芍藥理作用廣泛，具有調節免疫、抗炎抑菌、抗腫瘤、抗抑郁等作用，可用于治療抑郁癥、癌癥、糖尿病等臨床常見病癥［5］。赤芍生品微寒，經炮制后其寒涼之性可緩和，目前酒、醋、鹽炙赤芍等炮制方法在臨床最為常見［6-7］。

飲片在炮制過程中其內在化學成分和外在表觀均會發生相應的變化，其質量亦會隨之改變，而飲片炮制程度的判斷常以炮制的經驗為準，此標準極易受外界因素的影響而存在主觀性較強、易出現個體偏差的缺點，進而無法通過炮制程度來把控赤芍飲片的炮制質量［8-9］。此外，目前對于把控中藥飲片的質量多體現在檢測其化學成分含量的研究上，評價指標極其單一，而中藥飲片質量的優劣受化學成分和物理屬性等多種屬性共同影響［10-11］，因此本研究引入物性參數這一概念，通過測量赤芍及其炮制品的吸水膨脹度、氧化值、pH值及相對密度把飲片的外在表觀“形、色、氣、味、質”通過數字的形式更為直觀地表達出來，并根據課題組前期在中藥材料學研究的基礎上選擇赤芍中的主要大分子物質淀粉和有效成分芍藥苷兩類化學成分進行含量測定，運用CRITIC 客觀評價法對赤芍炮制飲片中的化學成分（淀粉和芍藥苷）進行權重評分，進而對含量和權重評分與物性指標（吸水膨脹度、氧化值、pH 值及相對密度）進行皮爾遜相關性分析，探討酒、醋、鹽炙赤芍物性參數與化學成分之間的相關性及不同炮制方法對赤芍飲片質量的影響，以期為赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍的質量評價提供一定的參考依據。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

炒藥機（溫州頂歷醫療器械有限公司，型號：CY-25）；電子天平（北京醫用激光儀器廠常熟分廠，型號：DT-400）；高速萬能粉碎機（科偉永興儀器有限公司，型號：FW-600）；紫外-可見分光光度計（賽默飛世爾科技，型號：Thermo Evolution201）；實驗室pH 計（上海創益儀器儀表有限公司，型號：pHSJ-3F）；高效液相色譜儀（Waters中國有限公司，型號：e2695）。

1.2 主要材料

赤芍（安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：1712041）經河南中醫藥大學第一附屬醫院陳天朝主任藥師鑒定，符合2020 年版《中華人民共和國藥典》一部項下的各飲片來源規定；黃酒（浙江湖州市長興縣林城工業園區，執行標準：GB/T 13662）；米醋（山西紫林醋業股份有限公司，執行標準：GB/T 18187）；食鹽（河南省衛裙多品種鹽有限公司，批號：DZ-010）；支鏈淀粉（上海源葉生物科技有限公司，批號：J02M9M60109）；直鏈淀粉（上海源葉生物科技有限公司，批號：J17M9M56190）；純度 ≥ 98%芍藥苷（上海源葉生物科技有限公司，批號：X12ABC33672）。

2 方法與結果

2.1 物性參數測定

2.1.1 相對密度

準確稱取赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍各5.0 g，分別投入盛有50 mL 輕質液狀石蠟的100 mL 量筒中，靜置待液狀石蠟凹液面穩定時記錄體積，結果見表1。

表1 赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍物性參數測定結果（n = 4）

2.1.2 吸水膨脹度

分別準確稱取赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍各5.0 g，用量筒量取100 mL 蒸餾水，分別置于50 mL 錐形瓶中，于0、5、10、20、40、60、120、240、480、1 440 min 時過濾出飲片，錐形瓶中的液體倒進量筒中讀取體積，記錄數據。選擇上述飲片吸水飽和時對應時間，浸泡中藥飲片，記錄排開水體積差值，根據膨脹度（S） = 膨脹后體積（V）/飲片重量（W）進行計算，平行測定3 份，取平均值，結果見表1。

2.1.3 氧化值

準確稱取赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍各5.0 g，量取200 mL 蒸餾水于500 mL 圓底燒瓶中，搖勻后蒸餾，精確收集前50 mL 餾分。用移液管準確量取10 mL 餾分置于滴定瓶內，加入5 mL H2SO4水溶液和0.002 mol/L KMnO4溶液10 mL，振蕩均勻，于室溫下靜置。加入0.15 g/mL KI溶液5 mL，滴加Na2S2O3標準溶液，當溶液由黃棕色變成淺黃色時，加淀粉指示劑1 mL，繼續用0.101 2 mol/L Na2S2O3標準溶液滴定，觀察顏色變至無色時，記錄消耗Na2S2O3標準溶液體積為A（ mL）。取等體積水重復上述操作作為空白試驗，記錄消耗Na2S2O3標準溶液體積為B（ mL）。根據Ox =（B-A） ×C× 200（/5 × 0.002 ×V×M1）進行計算，結果見表1。

2.1.4 pH值

準確稱取赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍各5.0 g于100 mL純化水中，浸泡24 h，待溶液達到飽和時過濾，取濾液，用pH酸度計測定，記錄相同溫度下的各飲片pH值，結果見表1。

2.2 芍藥苷含量測定

2.2.1 色譜條件選擇

色譜柱：Agilent 色譜柱HC-C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（40∶60）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃，檢測波長：230 nm，進樣量：10 μL。芍藥苷及赤芍不同飲片液相色譜圖見圖1、2。

圖1 芍藥苷對照品HPLC圖

圖2 赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍HPLC圖

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的芍藥苷對照品，加甲醇配制成1.65 mg/mL的對照品溶液，搖勻即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

分別精密稱取赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍約0.50 g，置于錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定重量，浸泡4 h，超聲處理20 min，冷卻至室溫，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，取濾液即得。

2.2.4 標準曲線的制備

分別精密吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，甲醇定容至5 mL，稀釋得系列濃度為0.16、0.33、0.66、0.99、1.32 mg/mL 的 對 照 品 溶 液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，將峰面積Y 與進樣濃度X 進行線性回歸，得標準曲線方程為：Y= 12 461 386X-132 202，R2 = 0.999 9，表明芍藥苷在0.16～1.32 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度考察

精密吸取芍藥苷對照品溶液適量，于波長230 nm處連續進樣6 次并測定芍藥苷峰面積，計算得RSD=0.67%，結果表明該儀器的精密度良好。

2.2.6 重復性考察

精密稱取赤芍同一份粉末6 份，樣品溶液的制備按照“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法操作，于波長230 nm處進樣，計算得RSD = 1.44%，結果表明該方法的重復性良好。

2.2.7 穩定性考察

精密吸取供試品溶液適量，于制備后0、3、6、9、12、24 h 按照“2.2.1”項下色譜條件依次進樣，并記錄峰面積，計算得RSD = 0.39%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

取赤芍及其不同炮制品飲片粉末6 份，按“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法操作，加入適量芍藥苷對照品，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算得加樣回收率為99.76%，RSD = 1.33%，表明該方法的加樣回收率良好。

2.2.9 含量測定

測得赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍的芍藥苷含量依次為34.47、30.20、32.20、28.58 mg/g，結果見表2。

表2 赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍成分含量測定結果

2.3 支、直鏈淀粉含量測定

2.3.1 標準品溶液的配制

精密稱量支鏈、直鏈淀粉標準品各0.100 g，用少量無水乙醇潤濕，分別加入1 mol/L 的氫氧化鉀溶液15 mL，水浴加熱，蒸餾水定容至50 mL，得標準溶液。

2.3.2 吸收圖譜的繪制

精密量取支鏈淀粉標準溶液7.0 mL、直鏈淀粉標準溶液2.0 mL于50 mL容量瓶中，加入25 mL蒸餾水，0.1 mol/L鹽酸調節pH值為3.00，加0.2 mL碘試劑，蒸餾水定容，靜置20 min。以加入0.1 mol/L 鹽酸和碘試劑的蒸餾水為空白，在波長400～900 nm 范圍內進行掃描，繪制可見光吸收掃描圖譜。

2.3.3 測定波長及參比波長的確定

在紫外可見分光光度計400～900 nm 內進行掃描，確立兩者的測定波長。運用等吸收點作圖法得支鏈淀粉的測定參比波長分別為546、707 nm；直鏈淀粉的測定參比波長分別為610、481 nm。

2.3.4 標準曲線的繪制

精密吸取2 mg/mL支鏈淀粉標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，加25 mL左右蒸餾水，用鹽酸調節pH值至3.00，加入0.2 mL碘試劑，于50 mL容量瓶中定容，混勻，得濃度40、80、120、160、200、240、280 μg/mL的標準溶液，在λ1、λ2兩波長處分別測定A1和A2，即得ΔA=A2-A1，以ΔA 為縱坐標，支鏈淀粉濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制雙波長支鏈淀粉標準曲線，回歸方程為Y= 0.001 6X+ 0.000 8（R2= 0.998 3），結果表明支鏈淀粉含量在40～280 μg/mL 濃度范圍內呈良好的線性關系。取2 mg/mL 直鏈淀粉標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，加25 mL 蒸餾水，鹽酸調節pH至3.00，加入0.2 mL 碘試劑，于50 mL 容量瓶中定容，混勻。得濃度20、40、60、80、100、120、140 μg/mL 的標準溶液。以加入鹽酸和碘試劑的蒸餾水為空白，在λ3、λ4兩波長處分別測定A3和A4，即得ΔA=A3-A4，以ΔA為縱坐標，直鏈淀粉濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制雙波長直鏈淀粉標準曲線，Y= 0.002 6X+ 0.012 4（R2=0.997 9），表明直鏈淀粉含量在20.00～120.00 μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.3.5 樣品處理及樣品溶液制備

分別精密稱取赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍樣品細粉適量，烘干5 h，置于干燥器內，冷卻，測得水分含量為W（1%），將樣品烘干后放入索氏提取器中，加入石油醚（30～60 ℃）浸沒樣品，加熱回流4 h 進行脫脂處理，再加入85%乙醇，加熱回流4 h 進行脫糖處理，放入干燥箱中烘干，干燥器內冷卻后稱重，測得糖分和脂肪含量為W（2%）。精確稱取脫水脫糖樣品0.100 0 g，無水乙醇將其濕潤，加入濃度為1 mol/L 氫氧化鉀溶液10 mL，沸水浴中分散溶解10 min，加蒸餾水定容至50 mL，混勻。吸取樣品液3 mL，加入25 mL蒸餾水，用0.1 mol/L 鹽酸調節pH 值至3.0，加0.4 mL 碘試劑，蒸餾水定容至50 mL，混勻后靜置。

2.3.6 精密度考察

精密吸取支、直鏈淀粉對照品溶液適量，按照“2.3.4”項下處理方法處理，連續測定6 次，經計算得到支鏈淀粉和直鏈淀粉的RSD 值分別為1.21%、0.56%，結果表明該儀器的精密度良好。

2.3.7 重復性考察

精密稱取赤芍樣品6 份，按照“2.3.5”項下方法制備供試品溶液，測定支鏈、直鏈淀粉吸光度，經計算得到兩者的RSD 值分別為1.22%、0.56%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.8 穩定性考察

取“2.3.5”項下樣品溶液，在“2.5”項下波長處，分別于0、10、20、30、40、50、60 min時間點在“2.3.3”項下波長處進行測定支鏈、直鏈淀粉吸光度，經計算得到兩者的RSD 值分別為1.27%、3.23%，結果表明該樣品溶液在60 min內穩定性良好。

2.3.9 含量測定

依據回歸方程求出樣品溶液中支鏈淀粉濃度Y支（μg/mL）和直鏈淀粉濃度Y直（μg/mL），測得赤芍及酒、醋、鹽炙赤芍中支鏈淀粉的含量依次為15.59%、15.73%、14.16%、16.30%；直鏈淀粉的含量依次為9.55%、9.10%、6.76%、8.70%。結果見表2。

2.4 CRITIC法確定各指標成分權重

CRITIC 法（criteria importance through intercriteria correlation）是一種基于指標相關性的權重確定方法［12-13］，其中以變異性和沖突性為基礎，分別通過標準差和相關系數的形式體現評價指標之間的變異性和沖突性，此評價方法較為客觀。首先對生品及酒、醋、鹽炙赤芍的芍藥苷和淀粉含量進行標準化處理，然后運用SPSS25.0 軟件對數據相關性分析，得相關系數矩陣表，結果見表3。

表3 各指標相關性

①按照公式（1）指標數據的無量綱化處理。

②按照公式（2）用處理后的數據計算對比強度。

③按照公式（3）用處理后的數據計算沖突性。

④按照公式（4）計算指標的客觀權重。

公式（1）中對于第i個個體，第j個指標越高越好，而赤芍中芍藥苷、支鏈淀粉、直鏈淀粉含量愈高愈好可應用此公式；公式（2）中Zij為無量綱處理后的樣本指標值；公式（3）和（4）中Cj表示第j評價指標所包含的信息量，δi為標準化之后各列指標的標準差，Wj表示第j個指標的客觀權重。最終計算赤芍各指標的變異性、沖突性、信息量及客觀權重，其中客觀權重系數分別為0.464 9、0.314 7、0.220 4，結果見表4。

表4 相關指標數據

根據公式Y=（Y1i/Y1max）權重100 +（Y2i/Y2max）權重100 +（Y3i/Y3max）權重100 對已得出的權重系數加權得權重評分，結果見表5。

表5 CRITIC權重評分表

2.5 物性參數與化學成分相關性分析

采用軟件SPSS25.0 對赤芍不同炮制品的相對密度、吸水膨脹度、氧化值、pH 值和芍藥苷、支鏈淀粉、直鏈淀粉進行Pearson 相關性分析，結果見表6。通過分析相關性可知，酒、醋、鹽炙赤芍的物性參數與化學成分之間具有相關性，其中相對密度與芍藥苷呈正相關，吸水膨脹度與芍藥苷呈負相關（P＜ 0.05）。

2.6 回歸模型的建立

2.6.1 芍藥苷含量與物性參數回歸分析

在芍藥苷含量與相對密度、吸水膨脹度的多元線性回歸分析中發現，自變量之間存在共線性，因此采用“步進法”，余下吸水膨脹度一項自變量，因此建立逐步回歸分析模型為Y（芍藥苷）= 154.386-52.239X（吸水膨脹度），R2= 0.968，P= 0.016 ＜ 0.05，該模型具有統計學意義，芍藥苷含量與吸水膨脹度呈負相關，可用吸水膨脹度預測分析芍藥苷含量，ANOVA表見表7。

表7 芍藥苷含量與吸水膨脹度回歸模型ANOVA表

2.6.2 權重評分與物性參數回歸分析

在權重評分與物性參數的相關性分析中發現，只有氧化值與權重評分具有相關性，相關系數為0.996，因此建立回歸方程為Y（權重評分）= 65.765 + 4.216X（氧化值），R2= 0.992，P= 0.004 ＜ 0.01，該模型具有統計學意義，權重評分與物性參數氧化值呈顯著正相關，可用氧化值根據此模型在一定程度上預測分析赤芍炮制品的質量，ANOVA表見表8。

表8 權重評分與氧化值回歸模型ANOVA表

3 討論

3.1 炮制方法的選擇

赤芍味苦微寒，生用以活血化瘀、清熱涼血作用為主，多用于治療各種吐血、衄血癥［14］，其炮制后寒涼之性可緩和，常用有酒、醋、鹽炙等炮制方法。酒可滲入到赤芍內部細胞中溶解生物堿并形成溶液，進而可以通過內部細胞間隙擴散到赤芍的各個部位發揮藥效［15-16］。醋為弱酸，可與赤芍中的游離生物性堿結合生成可溶性鹽，增加其在水中的溶解度，提高生物利用度［17-18］；并且中醫五行學說認為“五味入五臟”，醋以酸味為主，酸又入肝，因此赤芍經醋炙后引藥入肝經，增強疏肝理氣、活血化瘀止痛的作用［19-22］。鹽炙法即把加水溶化的食鹽與中藥飲片加熱拌炒［23］，鹽水對飲片細胞的穿透力較強，可增加藥物成分的溶解度及煎出量，起到增強療效、擴大臨床藥用范圍的目的，調節了機體的水液代謝平衡，增加腎臟對水的通透性［24］。

3.2 評價指標的選擇

中藥化學成分復雜，經液體輔料炮制后藥材內部分子結構發生變化，進而其化學成分、物理化學性質及總體質量也會發生改變，而物理化學性質是飲片性狀鑒別中反映形、色、氣、味、質的內在因素［25-26］。“形”即飲片的形狀和大小；“色”代表化學結構、功能團/呈色團；“氣”一般為揮發性，氧化值可替代；“味”可以測量飲片pH 值；“質”即飲片的質地，可用相對密度代表［27-28］。2020年版《中華人民共和國藥典》中規定芍藥苷作為檢測赤芍質量的指標成分，但赤芍中化學成分眾多［29］，在炮制過程中不能只憑借單一指標成分來評判飲片炮制質量，而是需要多種指標參數為指導，因此選用赤芍中的主成分淀粉和藥理活性顯著的芍藥苷兩個化學成分指標進行含量測定，以大小分子相結合的方式去研究分析［3，30］；物性參數中選取相對密度、吸水膨脹度、氧化值、pH 值4 個物性指標，通過測定上列指標數據，探究赤芍炮制品物性參數與化學成分之間的相關性，這對于評價酒醋鹽炙赤芍飲片的質量具有一定可靠性。

3.3 權重方法的確定

在綜合評價中對于各個指標權重系數的確定是科學準確做出評價的基礎［31］，現如今主要有主、客觀兩類賦權方法確定權重系數，其中主觀賦權法以AHP 層次分析法為代表，此評價方法往往是根據個人的主觀經驗對各指標之間的關系進行判定，片面性較強，因而其評價結果具有很強的主觀性［32］；而CRITIC 法作為客觀賦權法的代表之一，把真實數據作為基礎，以變量和沖突為依據，以標準偏差的形式表示沖突，進而得出各指標的權重系數，相較于主觀的賦權方法，CRITIC 賦權法更加科學合理、準確真實，更客觀全面［33-34］。

中藥飲片的炮制過程是動態變化的，其質量隨炮制程度的不同而發生改變，目前對于中藥炮制品的質量大多是從其“形、色、氣、味、質”五個方面去直接判斷其真偽優劣，此方法雖簡單易行，但主觀性較強。本課題組對于中藥的“物性參數”的探究已有多年，因此本研究引入這一概念，測量酒、醋、鹽炙赤芍的物性指標和化學成分，采用CRITIC 法對赤芍飲片中的淀粉和芍藥苷兩個化學指標進行權重分析，進而利用SPSS 軟件進行相關性分析得回歸方程，得出芍藥苷含量與吸水膨脹度呈顯著負相關；赤芍飲片的權重評分與氧化值有顯著相關性，表明構建的回歸模型具有統計學意義。已有研究表明芍藥苷是赤芍發揮藥效的主要活性成分［35］，此外《中華人民共和國藥典》中把芍藥苷作為檢測赤芍質量的唯一指標成分，因此在一定程度上可用吸水膨脹度預測分析酒醋鹽炙赤芍中芍藥苷含量的高低，進而可作為赤芍炮制過程中質量控制的一個標準，以便于對其質量進行預測，為中藥的質量評價標準提供一定的參考依據。但因本研究樣本量準備不夠充分，后期會加大樣本量以保證該結果的準確性。