基于ISSR分子標記技術的土沉香遺傳多樣性分析

于 彤，申文輝，覃日亮，韋文龍，李俊曉，譚長強，滕維超，曹艷云，郝海坤

（1.廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西南寧 530002；2.廣西大學，廣西南寧 530004；3.廣西優良用材林資源培育重點實驗室，廣西南寧 530002；4.柳江區沖馬嶺林場，廣西柳州 545100；5.浦北縣綠化工作站，廣西浦北 535300；6.齊齊哈爾大學，黑龍江齊齊哈爾 161000）

土沉香（Aquilariasinensis）是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬多年生常綠喬木，又名牙香樹、沉香和白木香，是我國特有的珍貴樹種，分布于我國廣東、海南、廣西和福建等地[1]。土沉香以含樹脂的心材入藥，具有較好的醫療價值和經濟效益[2]。由于無節制地砍伐，野生土沉香資源受到嚴重破壞，現已被列為國家珍稀瀕危三級保護植物及國家二級重點保護野生植物[3]。

近年來，分子標記技術的迅速發展為物種的遺傳變異、親緣關系及種質資源多樣性等研究提供支持。簡單重復間序列（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）是一種基于簡單序列重復（Simple Sequence Repeat，SSR）特征開發的分子標記技術，其特點在于能高效地擴增簡單序列重復區間，產生高度多態性，具有很好的穩定性和操作簡便性。目前該技術在植物的品種鑒定[4]、遺傳作圖[5]和遺傳多樣性[6]等研究中得到了廣泛應用。

土沉香的研究主要集中在組織培養[7-8]和植物生理[9]等方面，對土沉香種質資源遺傳多樣性的研究較少。本研究采用ISSR分子標記技術，分析廣西3個居群、云南1個居群和海南9個居群共13個居群147 個土沉香家系的遺傳分化，探討居群間的親緣關系及家系間的遺傳差異，為我國野生土沉香資源的保護和合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年6月，在廣西、海南和云南選取樹齡10～20年、生長健壯且具有代表性的土沉香單株；2017年7月，在廣西壯族自治區林業科學研究院苗圃（108°35′E，22°92′N）內嫁接。試驗材料包括來自廣西馬山（MS）、浦北（PB）和北流（BL）3 個居群的40個家系，海南儋州（DZ）、瓊中（QZ）、瓊海（QH）、萬寧（WN）、屯昌（TC）、澄邁（CM）、海口（HK）、樂東（LD）和陵水（LS）9個居群的92個家系及云南（YN）1個居群的15個家系，共147個家系。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及檢測

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[10]提取土沉香的基因組DNA；采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V，電泳45 min，在GelDoc XR+ 凝膠成像儀上成像），檢測DNA 樣品質量；采用紫外分光光度計（UV1800PC，上海精若科學儀器有限公司）檢測DNA 質量濃度；取A260/A280值大于1.8 的DNA樣品稀釋至40 mg/L，于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 PCR引物篩選、ISSR-PCR擴增及檢測

參考加拿大哥倫比亞大學公布的100 條ISSR引物序列設計[11]，該100 條引物均由上海生工生物工程有限公司合成。每個居群隨機選取3個家系的DNA 樣品進行引物篩選，最終篩選出條帶清晰、反應穩定的引物進行PCR 擴增。PCR 反應總體系為20 μL，含有40 mg/L 的DNA 樣品1.5 μL、20 μmol/L的引物1.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol/L 的Mg2+2 μL、2.5 mmol/L 的dNTPs 1.25 μL、5 U/μL 的Taq 酶0.25 μL 和8.5 μL ddH2O。PCR 擴增反應在Biometra TProfessional PCR 擴增儀上進行。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38 個循環；72 ℃延伸8 min，4 ℃結束反應保存。PCR 產物在2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓130 V，電泳50 min）。電泳后，在Gel-Doc XR + 凝膠成像儀上拍照保存結果。每條引物均重復擴增和電泳3 次，選取清晰并穩定的條帶作為最終結果。

1.3 數據處理

采用Gel-pro 32 軟件與人工相結合的方法讀取條帶，根據條帶有無的方法進行統計，“有”條帶賦值為1，“無”條帶賦值為0，得到并導出0、1 矩陣[12]。采用POPGEN 32 軟件對遺傳數據進行多樣性統計，計算遺傳特征值，即有效等位基因數（Ne）、等位基因數（Na）、多態性位點百分率（Percentage of Polymorphic Loci，PPL）、居群總基因多樣性（Ht）、居群內基因多樣性（Hs）、Nei's 遺傳距離（D）、Nei's 基因多樣性指數（H）、香農信息指數（I）、遺傳分化系數（Gst）和基因流（Nm）等。采用NTSYS 2.10E 軟件構建13 個土沉香居群的UPGMA 系統樹狀圖，采用SPSS 軟件中的Mantel檢驗分析地理距離與遺傳距離的相關性。

2 結果與分析

2.1 ISSR-PCR擴增結果

從100 條ISSR 引物序列篩選出條帶重復性好、穩定且清晰的34 條引物用于土沉香147 個家系的ISSR-PCR 擴增。34條ISSR引物共獲得擴增位點數291 個，其中多態性位點數230 個，平均PPL 為78.97%（表1）。平均每條引物擴增位點數為8.56個，平均每條引物多態性位點數為6.76 個。PPL 達100%的引物有7條，分別為引物807、823、835、844、848、880和884。引物886擴增位點數最多（19個）。

表1 34條ISSR引物在土沉香147個家系中的多態性檢測Tab.1 Polymorphism test of 34 ISSR primers in 147 families of A.sinensis

2.2 遺傳多樣性分析

13個土沉香居群的Na為1.430 4～1.734 8，居群水平均值為1.591 6，家系水平均值為1.982 6；Ne為1.309 2～1.470 2，居群水平均值為1.399 1，家系水平均值為1.518 3；H為0.171 9～0.270 6，居群水平均值為0.226 1，家系水平均值為0.310 4；I為0.250 5～0.400 4，居群水平均值為0.332 0，家系水平均值為0.472 8（表2）。各指數最高值均出現在廣西馬山居群，最低值均出現在海南陵水居群。

表2 13個土沉香居群遺傳多樣性指數Tab.2 Genetic diversity indices of 13 populations of A.sinensis

13個土沉香居群的PPL為43.04%～73.48%，居群水平均值為59.09%；多態性位點數為99～169，居群水平均值為136.08；PPL 表現為廣西馬山＞海南瓊中＞廣西北流＞海南瓊海＞海南萬寧＞云南＞海南澄邁＞海南儋州＞廣西浦北＞海南海口＞海南屯昌＞海南樂東＞海南陵水。

2.3 遺傳分化分析

13 個土沉香群居的Ht、Hs、Gst和Nm均值分別為0.307 6、0.226 1、0.265 0和1.387 1（表3）。

表3 13 個土沉香居群遺傳分化分析Tab.3 Genetic differentiation analysis on 13 populations of A.sinensis

2.4 13個土沉香居群的遺傳距離和聚類分析

13個土沉香居群的遺傳距離為0.050 2～0.172 8，其中海南屯昌與海南澄邁居群間的遺傳距離最小，海南樂東與廣西浦北居群間的遺傳距離最大；13個土沉香居群的遺傳一致度為0.841 3～0.951 0，其中海南樂東與廣西浦北居群間的遺傳一致度最小，海南屯昌與海南澄邁居群間的遺傳一致度最大（表4）。

表4 13 個土沉香居群的遺傳距離（D）與遺傳一致度（I）Tab.4 Genetic distances(D)and genetic consistencies(I)of 13 populations of A.sinensis

以遺傳距離0.9 為閾值，13 個土沉香居群可被劃分為3類，第一類為廣西馬山、廣西浦北和云南居群；第二類為廣西北流、海南儋州、海南瓊中、海南瓊海和海南萬寧居群；第三類為海南屯昌、海南澄邁、海南海口、海南樂東和海南陵水居群（圖1）。

圖1 基于Nei's遺傳距離的13個土沉香居群UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA clustering diagram of 13 populations of A.sinensis based on Nei's genetic distance

2.5 13 個土沉香居群遺傳距離與地理距離相關性分析

13 個土沉香居群間的遺傳距離與地理距離不相關（圖2）。Pearson 為0.031，表示遺傳距離與地理距離的解釋率為3.1%，說明土沉香的遺傳多樣性不可以用地理距離解釋。

圖2 13個土沉香居群遺傳距離與地理距離相關性散點圖Fig.2 Scatter plots of correlations among genetic distances and geographical distances of 13 populations of A.sinensis

3 討論與結論

本研究首次采用ISSR分子標記技術對13 個土沉香居群147個家系的遺傳多樣性及親緣關系進行分析，篩選得到34 條ISSR 引物，共獲得擴增位點數291 個，其中多態性位點數230 個，PPL 均值為78.97%，表現出豐富的多態性。H居群水平均值為0.226 1，家系水平均值為0.310 4；I居群水平均值為0.332 0，家系水平均值為0.472 8。說明土沉香居群具有較高的遺傳多樣性，與黃久香等[13]研究土沉香遺傳多樣性的結論較一致。廣西馬山的土沉香居群遺傳多樣性豐富，各指數值均最高，海南陵水的土沉香居群遺傳多樣性最低。

遺傳分化系數是用于衡量植物群體間分化程度的重要指標，為遺傳分化的研究提供有力的解釋和說明[14]。0 ≤Gst≤0.05時，群體間遺傳分化水平較低；0.05＜Gst≤0.15 時，群體間遺傳分化水平為中度；0.15＜Gst≤0.25 時，群體間遺傳分化水平較高；0.25

基因流是指基因在同種植物群體內或群體之間的運動，有助于提高植物群體的遺傳多樣性水平，防止種群分化[16]。當Nm＞1 時，基因流動性較強[17]。本研究中，Nm均值為1.387 1，說明13 個土沉香居群間存在較強程度的基因流動。

遺傳距離可用來衡量物種之間或同一物種群體之間遺傳差異（基因組差異）的程度。本研究中，海南屯昌與海南澄邁居群間的遺傳距離最小、遺傳一致度最大，海南樂東與廣西浦北居群間的遺傳距離最大、遺傳一致度最小。13 個土沉香居群可被劃分為3 類，第一類為廣西馬山、廣西浦北和云南居群；第二類為廣西北流、海南儋州、海南瓊中、海南瓊海和海南萬寧居群；第三類為海南屯昌、海南澄邁、海南海口、海南樂東和海南陵水居群。土沉香居群間的遺傳距離與地理距離不相關，土沉香的遺傳多樣性不可以用地理距離解釋。這可能是因為3個地區種源的土沉香是由1 個原生種源擴張，由于擴張到采樣點的時間較短，繁殖代數較少，還未形成地理距離差異。

植物種源的親緣關系對于種群的遺傳多樣性保護具有重要意義。本研究中，基于34 條ISSR 引物對13 個土沉香居群147 個家系進行分子層面分析，發現13 個土沉香居群147 個家系具有較高的遺傳多樣性和極高的遺傳分化水平，可為土沉香種質資源保護、開發與利用和優種栽培等領域提供理論依據。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻聲明：于彤負責研究計劃制定、數據收集與分析和論文撰寫與修改；申文輝負責研究計劃制定；覃日亮、韋文龍負責試驗調查；李俊曉負責數據收集與分析；譚長強負責研究計劃制定、數據收集與分析和論文修改；滕維超負責論文撰寫；曹艷云、郝海坤負責文獻檢索。