樹脂法從發(fā)酵液中分離提取必特螺旋霉素的研究

佟澤勇

摘 要：本文采用大孔吸附富樹脂柱層析結(jié)合HPLC在線檢測，對樹脂法從發(fā)酵液中分離提取必特螺旋霉素進行研究。最佳工藝為： 將處理好的樹脂裝入的樹脂柱中，以流速3 BV/h上樣， 靜止120分鐘，采用蒸餾水洗拖至無色，然后用5倍樹脂床體積的磷酸鹽緩沖液（PH6.8）以3 BV/h流速洗脫，收集洗脫液。本工藝穩(wěn)定、可行、收率高。

關(guān)鍵詞：必特螺旋霉素；工藝；研究

必特螺旋霉素是由發(fā)酵得到的新型抗生素[1-4]。大孔樹脂法marroporr}s irm exci-}ang} purification method一種凈化污溶劑的方法，具有設(shè)備簡單、操作方便、節(jié)省能源、成本低、產(chǎn)品純度高、不吸潮等優(yōu)點[5]。發(fā)酵液指的是液體培養(yǎng)基接人微生物菌種，經(jīng)過培養(yǎng)合成菌體及分泌產(chǎn)物，這種經(jīng)微生物代謝后的液體叫發(fā)酵液。本文采用大孔吸附富樹脂柱層析結(jié)合HPLC在線檢測，對樹脂法從必特螺旋霉素發(fā)酵液中分離提取必特螺旋霉素進行研究。

1儀器與試藥

電子天平FA1004型（南京華欣分析儀器制造有限公司）；600220液相保護柱（天津琛航科苑科技發(fā)展有限公司）； UV-5500（PC）掃描型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司） ；Prominence LC-20A高效液相色譜儀（西安禾普生物科技有限公司）；蘭博OV3000大容量柱溫箱（天津市蘭博實驗儀器設(shè)備有限公司）；PRO-E-UP-100超純水機（上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司）；TN-120超聲波清洗機（常州金壇泰納儀器廠）；HH-W420 電熱恒溫三用水箱（常州翔天實驗儀器廠）。乙腈（滄州鑫安化工產(chǎn)品有限公司）、乙酸銨 （滄州鑫安化工產(chǎn)品有限公司）、甲醇（天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司）、醋酸銨（南京化學(xué)試劑股份有限公司）、醋酸（滄州鑫安化工產(chǎn)品有限公司）、磷酸（南京化學(xué)試劑股份有限公司）、三乙胺（滄州鑫安化工產(chǎn)品有限公司）、磷酸二氫銨（滄州鑫安化工產(chǎn)品有限公司）。必特螺旋霉素對照品（自制）。LX-16（鄭州勤實科技有限公司）、X-5型大孔吸附樹脂（河北耀陽精細化工有限公司）、AB-8型大孔吸附樹脂（西安藍曉科技新材料股份有限公司）、 LX-1600（鄭州勤實科技有限公司）、LX-67（鄭州勤實科技有限公司）、D101型大孔吸附樹脂（西安藍曉科技新材料股份有限公司）、HPD400型大孔吸附樹脂（西安藍曉科技新材料股份有限公司）。

2大孔吸附樹脂預(yù)處理

取樹脂加水使其溶脹，除去懸浮于水溶液面上的樹脂顆粒，用乙醇浸泡過夜。上柱，用5倍柱體積乙醇過樹脂層，直至流出液加2倍水混合后不呈白色渾濁為止，最后用水洗滌除盡乙醇備用。

3測定方法確定

分別考察5%磷酸氫二鈉溶液-甲醇（60∶40），甲醇-乙腈-0.1mol/L醋酸銨溶液（30：30：40），乙腈-0.03mol·L-1醋酸銨溶液20：80），0.1mol.L-1磷酸二氫銨溶液（三乙胺調(diào)節(jié)pH6.5）-乙腈（75∶25）不同比例的流動相，結(jié)果以5%磷酸氫二鈉溶液-甲醇（60∶40）為流動相，供試品各峰分離效果最好，故選用5%磷酸氫二鈉溶液-甲醇（60∶40）為流動相。

依據(jù)查閱文獻及考查的結(jié)果，確定色譜條件如下[6-7]。流動相：5%磷酸氫二鈉溶液-甲醇（60∶40）為流動相，檢測波長：231nm，流速：1.0m·min-1。

4樹脂的動態(tài)吸附和洗脫實驗

考察不同上樣濃度、流速對樹脂吸附性能的影響，確定最佳的吸附工藝條件。

4.1上樣液濃度對吸附效果的影響

將必特螺旋霉素發(fā)酵液分別處理成效價至1.0mg/mL﹑1.2mg/mL﹑1.4mg/mL﹑1.6mg/mL上樣，進行動態(tài)吸附實驗。實驗表明，效價為1.2mg/mL時吸附效果最好。將1.2mg/mL濃度的樣品分別上樣0.5﹑0.7﹑0.3倍柱體積，結(jié)果表明上樣量為0.3倍柱體積為最佳。分別采用1BV/h、2 BV/h、3 BV/h的流速上樣，結(jié)果表明采用2 BV/h和3 BV/h流速上樣優(yōu)與1BV/h，2 BV/h和3 BV/h的流速無明顯差異，所以采用3 BV/h的流速上樣。

4.2洗脫劑乙醇濃度對必特螺旋霉素解吸效果的影響

將效價為1.2mg/mL提取液上柱， 靜止30分鐘，用蒸餾水沖洗至無色。分別采用40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、磷酸鹽緩沖液（PH6.5）、磷酸鹽緩沖液（PH6.6）、磷酸鹽緩沖液（PH6.8）、磷酸鹽緩沖液（PH7.0）、磷酸鹽緩沖液（PH7.2）、磷酸鹽緩沖液（PH7.4），以3 BV/h流速進行洗脫，實驗表明磷酸鹽緩沖液（PH6.8）的洗脫效果最好。將效價為1.2mg/mL提取液上柱，用蒸餾水沖洗至無色。分別采用4倍柱體積、5倍柱體積、6倍柱體積、7倍柱體積磷酸鹽緩沖液（PH6.8）以3 BV/h流速洗脫，結(jié)果表明5倍柱體積、6倍柱體積、7倍柱體積含量相同，所以采用5倍柱體積磷酸鹽緩沖液（PH6.8）洗脫。

4.3最佳吸附-洗脫條件下的驗證實驗

將處理好的樹脂裝入的樹脂柱中，以流速3 BV/h上樣， 靜止120分鐘，采用蒸餾水洗拖至無色，然后用5倍樹脂床體積的磷酸鹽緩沖液（PH6.8）以3 BV/h流速洗脫，收集洗脫液。將洗脫液減壓濃縮，使用高效液相色譜法進行含量測定。

參考文獻：

[1]周建，王軍峰，郝玉有，王永紅，涂國全，郭美錦.基于必特螺旋霉素發(fā)酵過程物理和生理作用的消泡劑篩選[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2008年03期

[2]戴劍漉，王永紅，劉玉偉，肖慈英，佟祖佲，儲炬，張嗣良，律光耀，王以光.必特螺旋霉素基因工程菌發(fā)酵參數(shù)的研究[J].中國抗生素雜志.2005年06期

[3]周建，王軍峰，吳春海，郝玉有，王永紅，郭美錦.剪切力對必特螺旋霉素發(fā)酵的影響[J].食品與藥品；2008年01期

[4]戴劍漉，王永紅，劉玉偉，肖慈英，佟祖佲，儲炬，張嗣良，律光耀，王以光.必特螺旋霉素基因工程菌發(fā)酵參數(shù)的研究[J].中國抗生素雜志. 2005（06）

[5]張嗣良.發(fā)酵過程多水平問題及其生物反應(yīng)器裝置技術(shù)研究——基于過程參數(shù)相關(guān)的發(fā)酵過程優(yōu)化與放大技術(shù)[A].中國生物工程學(xué)會第三次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C].2001年

[6]唐云彪，武毅，王英武，史向國，胡立鋼，顧景凱.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人體血漿和尿液中必特螺旋霉素時的基質(zhì)效應(yīng)[A].中國有機質(zhì)譜學(xué)第十二屆全國學(xué)術(shù)大會論文集[C].2003年

[7]史向國，胡立剛，藤國生，白旭，顧景凱，鐘大放.LC-MS/MS法在必特螺旋霉素Ⅰ期臨床研究中的應(yīng)用[A].中國有機質(zhì)譜學(xué)第十二屆全國學(xué)術(shù)大會論文集[C].2003年