壯骨止痛膠囊對去卵巢致骨質疏松大鼠腸道微生態的影響

張天慧，劉 婷，雷曉明，王 舒，王豐林，劉平安*，張國民*

湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是一種常發生于女性絕經后5～10 年內的骨科疾病，由于卵巢功能的下降，雌激素大幅度下降，導致成骨細胞和破骨細胞的動態平衡受到影響，繼而結構和功能發生紊亂，表現為骨痛、易骨折[1]。 目前，臨床中采取的藥物治療，長期服用易產生耐藥性和許多不良反應，因此，亟須尋找更加安全可靠的治療方式[2]。 中醫藥優勢在于資源豐富、藥效理想、不良反應少，可通過調控骨代謝相關信號通路及骨骼相關細胞的增殖分化等來治療骨代謝紊亂導致的PMOP，進而維護骨骼健康[3]。 越來越多的研究表明，中醫藥對骨代謝的調控作用可能與腸道菌群有關，但其具體機制仍需進一步探討[4]。 因此，本研究以去卵巢（ovariectomised, OVX）大鼠為研究對象，探索壯骨止痛膠囊（Zhuanggu Zhitong Capsule, ZGZTC）對OVX 所致骨質疏松癥（osteoporosis, OP）大鼠腸道菌群結構與多樣性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

2 月齡SPF 級SD 雌性大鼠40 只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2019-0009]，于湖南中醫藥大學動物實驗中心飼養，選用無菌顆粒飼料飼養，自由飲水，環境溫度20～25 ℃，室內通風良好。適應性喂養1 周后進行實驗。操作均符合實驗動物倫理學要求，并通過湖南中醫藥大學實驗動物中心倫理審查（倫理號：LL2022110903）。

1.2 主要試劑和儀器

ZGZTC 由補骨脂、淫羊藿、枸杞子、女貞子、骨碎補（燙）、狗脊、川牛膝組成（0.45 g/粒，四川美大康藥業股份有限公司，國藥準字：Z20050118，批號：220703）；戊酸雌二醇（estradiol valerate, EV）片（1 mg/片，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，國藥準字：J20171038，批號：699A）；脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、白細胞介素-17（interleukin-17, IL-17）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）ELISA 試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，批號：YD-31044、YD-30201、YD-31073）；大鼠GAPDH內參引物（生工生物工程股份有限公司，批號：IB08KA7169）。

多功能酶標儀（奧地利TECAN 公司，型號：1811004222）；熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司，型號：LightCycler480 Ⅱ）；顯微鏡（德國Zeiss 公司，型號：Axioscope 5）。

1.3 分組及給藥

將實驗動物隨機分為造模組（30 只）、假手術（SHAM）組（10 只）。 造模組采用國內外公認的去除雌性大鼠雙側卵巢方法建立PMOP 病理模型[5-7]，即經腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.03 g/kg）麻醉后，將大鼠置于俯臥位，備皮消毒，背側正中旁1～2 cm 行縱切口打開腹腔，找到卵巢，結扎摘除該側卵巢組織后，逐層縫合切口，同法處理對側卵巢，SHAM 組僅摘除卵巢周圍等質量脂肪組織，術后注射青霉素。 1周后，將造模組隨機分為OVX 組、ZGZTC 組、EV組，每組10 只。 4 組大鼠均灌胃，ZGZTC 組灌服ZGZTC混懸液[1.944 g/（kg·d）][8]，EV 組灌服EV 混懸液[0.09 mg/（kg·d）][9]，SHAM 組、OVX 組灌服等體積生理鹽水，連續灌胃12 周后處死并取材。

1.4 HE 染色

取左側股骨及一部分結腸用于HE 染色，檢測股骨、結腸病理形態學變化。 取固定的結腸、脫鈣后的股骨組織標本，常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明，浸入石蠟中包埋，包埋完全后切片，厚度約5 μm，切片脫蠟、水化，先后用蘇木素、伊紅染色，脫水透明后采用中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。

1.5 ELISA 法檢測血清IL-17、TGF-β、LPS 表達

大鼠腹主動脈取血，將血液樣本置于4 ℃冰箱過夜，待充分凝固后，4 ℃，3 000 r/min 離心15 min（離心半徑17.8 cm），取上清液。 按照雙抗體夾心法對大鼠血清IL-17、TGF-β、LPS 進行ELISA 檢測，使用多功能酶標儀檢測450 nm 波長處的OD 值，計算濃度。

1.6 RT-PCR 法檢測結腸Occludin、ZO-1 mRNA表達量

取適量結腸組織，使用超純總RNA 提取試劑盒提取RNA，核酸蛋白濃度測定儀測量RNA 濃度。逆轉錄成cDNA 后行兩步法擴增PCR（95 ℃反應1 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火1 min，循環45 次）。 依據原始檢測結果，運用2-ΔΔCt法計算咬合蛋白（Occludin）、閉合小環蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）mRNA 相對表達量。 引物目的基因序列搜索于美國國家生物技術信息中心，設計、合成于生工生物工程股份有限公司，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.7 16S rRNA 測序檢測大鼠腸道菌群

取新鮮大鼠糞便，提取DNA 后進行16S rRNA高通量測序。 采用細菌通用引物擴增16S 的V3-V4區，擴增產物經過純化和質檢后通過Illumina Miseq平臺進行測序。

1.8 統計學分析

本實驗數據采用Graphpad Prism 8.0 統計軟件進行統計分析。 計量資料以“±s”表示，對符合正態分布的數據，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD 檢驗（方差齊時）或Dunnnett's T3檢驗（方差不齊時）；若不符合正態分布，組間比較采用秩和檢驗（Kruskal-Wallis）。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠股骨、結腸HE 染色結果

SHAM 組大鼠股骨組織骨小梁結構完整、分布均勻，骨髓腔大小無異常。與SHAM 組比較，OVX 組股骨的骨小梁網狀結構破壞，骨小梁數目減少，骨小梁部分出現斷裂，脂肪空泡形成增多。 與OVX 組比較，ZGZTC 組、EV 組骨小梁數目增加，脂肪細胞形成的空泡減少。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠股骨微結構情況（HE，×100）

SHAM 組結腸形態正常，杯狀細胞和隱窩細胞數量較多，腺體分布整齊，炎癥細胞浸潤及滲出程度低。OVX 組上皮細胞的形態被破壞并且炎性細胞浸潤。與OVX 組相比，EV 組杯狀細胞有所增多，炎癥細胞浸潤減少；ZGZTC 組見正常杯狀細胞和U 型隱窩，腺體排列整齊，炎癥細胞浸潤顯著變少。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠結腸微結構情況（HE，×200）

2.2 各組大鼠結腸Occludin、ZO-1 mRNA 相對表達量比較

與SHAM 組比較，OVX 組大鼠結腸組織Occludin、ZO-1 mRNA 相對表達量明顯降低（P<0.01）；與OVX 組比較，ZGZTC 組和EV 組大鼠結腸組織Occludin、ZO-1 mRNA 相對表達量明顯升高（P<0.01）。詳見圖3。

圖3 各組大鼠結腸Occludin、ZO-1 mRNA 表達情況（n=10）

2.3 各組大鼠血清IL-17、TGF-β、LPS 值比較

與SHAM 組比較，OVX 組血清IL-17、LPS 值升高（P<0.01），TGF-β 值降低（P<0.01）；與OVX 組比較，ZGZTC 組和EV 組血清IL-17、LPS 值均降低（P<0.01），TGF-β 值升高（P<0.01）；ZGZTC 組和EV組IL-17、TGF-β、LPS 值差異均無統計學意義（P>0.05）。詳見圖4。

圖4 各組大鼠血清中IL-17、TGF-β、LPS 含量（n=10）

2.4 各組大鼠16S rRNA 測序結果

2.4.1 腸道菌群測序有效特征序列分析 3組大鼠共分析得到OTU 物種1 618 個，OVX 組、ZGZTC 組和EV 組各有888、803、801 條，其中，3 組共有物種數目252 個，特有的特征數分別有356、318、322 條。 詳見圖5。

圖5 特征分布韋恩圖

2.4.2 腸道菌群α 多樣性分析 各組大鼠腸道菌群的稀釋曲線最終都趨于平緩，表明各組測序獲得的特征數量合理，物種豐富度足夠，測序深度滿足后續數據分析（圖6）。 此外，各組大鼠腸道菌群的豐富度指數（潮1 指數與Ace 指數）、多樣性指數（辛普森指數與香濃指數）均無顯著性差異（圖7）。

圖6 α 多樣性指數稀釋曲線

圖7 α 多樣性分析指數比較

2.4.3 腸道菌群β 多樣性分析 通過主坐標分析（principal coordinate analysis, PCoA）和聚類分析來分析β 多樣性的差異。 PCoA 結果顯示，各組樣品顯著分離，置換多元方差分析表明組間差異具有顯著性（P=0.006<0.01），聚類分析也顯示出類似的結果。詳見圖8。

圖8 β 多樣性分析比較

2.4.4 各組大鼠腸道菌群結構豐度分析

（1）門水平菌群豐度及差異

由圖9-A 可知，相對豐度最高的10 個菌群分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、彎曲菌門（Campilobacterota）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、螺旋菌門（Spirochaetota）、藍細菌門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、狄氏副擬桿菌（Patescibacteria），其中，厚壁菌門和擬桿菌門為腸道的優勢菌群，相對豐度占比80%以上。 在厚壁菌門豐度比較中，相比于OVX 組（69.53%），ZGZTC 組（67.96%）和EV 組（61.16%）的相對豐度均下降。 在擬桿菌門豐度比較中，相比于OVX 組（21.94%），ZGZTC 組（25.16%）和EV 組（30.09%）的相對豐度均增加。

圖9 門水平（A）及屬水平（B）的腸道菌群相對豐度

（2）屬水平菌群豐度及差異

由圖9-B 可知，相對豐度前10 的菌屬有毛螺菌科＿NK4A136 菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）、普氏菌屬（Prevotella）、龍布茨氏菌屬（Romboutsia）、全緣球菌屬（Alloprevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、疣微菌屬（Turicibacter）、普雷沃氏菌科＿Ga6A1 菌屬（Prevotellaceae_Ga6A1_group）、優桿菌科＿ 惰性菌屬（[Eubacterium]_siraeum_group）、優桿菌科＿ 反芻菌屬（[Eubacterium]_ruminantium_group）。 在毛螺菌科＿NK4A136 菌屬豐度比較中，相比于OVX 組（14.23%），ZGZTC 組（6.10%）豐度明顯降低，而EV 組（18.17%）相較于OVX 組豐度增加；在普氏菌屬比較中，對比于OVX 組（8.36%），ZGZTC 組（4.71%）的相對豐度明顯降低，而EV 組（8.71%）相較于ZGZTC 組的相對豐度增加；在龍布茨氏菌屬比較中，相比于OVX組（1.68%），ZGZTC 組（11.03%）的相對豐度顯著增加，而EV 組（1.55%）相較于ZGZTC 組的相對豐度下降。

3 討論

中醫古籍并無PMOP 的記載，但其臨床表現與“骨痿”相似[10]。“骨痿”以肝腎陰虛證、脾腎陽虛證及腎虛血瘀證多見，故治療多從先后天之本——脾腎入手[11]。 ZGZTC 作為治療OP 的良藥之一，具有補益肝腎、壯骨止痛之效。 方中君藥補骨脂可溫腎壯陽，臣藥淫羊藿可強筋壯骨，二藥共奏助生肝腎之陽之功；枸杞子、女貞子滋補肝腎，骨碎補活血通經，狗脊補肝腎、強腰膝，四者共助補下焦肝腎之陰、強筋壯骨之功，共為佐藥；使藥牛膝則引藥下行達病所[12]。然而，基于腸道菌群探討ZGZTC 防治PMOP 的相關機制尚未闡明，有待進一步驗證。

PMOP 的發病核心是骨代謝失衡，而導致骨代謝失衡的原因有炎癥高表達、免疫系統失衡、雌激素水平降低，過程中均有腸道菌群參與。 MCCABE 等[13]發現，腸道炎癥可導致OP 發生，其中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和IL-17 等炎癥因子可刺激破骨細胞形成。MA 等[14]發現，OVX 大鼠閉合蛋白-1（Claudin-1）和Occludin 表達降低，提示PMOP 會破壞腸道屏障功能，而腸道菌群可能通過激活免疫細胞來調節Claudin-1 和Occludin 蛋白表達。隨著絕經后雌激素水平逐漸降低，甲狀旁腺素分泌逐漸增多，但腸道菌群主要代謝產物短鏈脂肪酸的產生可以降低甲狀旁腺素水平，從而增加礦物質吸收，影響激素代謝[15]。EV 可提高體內的雌激素水平，具有抗骨質疏松作用。 臨床上將EV 和淫羊藿總黃酮合用，淫羊藿的雄激素樣作用可抵抗雌激素的毒副作用，從而起到平補陰陽、益腎健骨的療效[16]。 健骨顆粒對腸道菌群環境和骨免疫調節有影響，可通過腸道菌群-短鏈脂肪酸-調節性T 細胞（regulatory T cell, Treg）/輔助性T細胞17（T helper cell 17, Th 17）軸調節骨代謝[17]。 亦有研究表明，腸道中的有益菌群可通過調節腸道微生物群的組成和功能來影響Treg/Th17 細胞及其相關細胞因子IL-17、TGF-β 之間的平衡以維持骨骼穩態[18]。因此，本實驗檢測了各組血清炎癥標志物水平，結果顯示，與SHAM 組相比，OVX 組大鼠IL-17 明顯升高、TGF-β 降低，腸道黏膜存在大量炎性細胞，緊密連接相關蛋白ZO-1、Occludin 表達均降低。 與OVX 組比較，ZGZTC 組及EV 組IL-17 明顯降低、TGF-β 升高，腸道炎癥情況明顯改善。 因此，減少炎癥因子的產生，增加益生菌含量可能是ZGZTC 通過腸道菌群改善PMOP 的機制之一。

腸道厚壁菌門-乳桿菌屬的減少與老年階段常見疾病之間存在密切相關性[19]。研究顯示，與骨密度正常的受試者相比，OP 患者的腸道菌群在門的水平上，厚壁菌門顯著增加，而擬桿菌門顯著減少，厚壁菌門/擬桿菌門與腰椎骨密度呈負相關；在屬的水平上，OP 患者腸道菌群中梭菌屬、糞球菌屬、乳酸桿菌屬的相對豐度顯著增加，韋榮氏球菌屬的相對豐度顯著下降[20]。本研究通過對比腸道菌群門、屬豐度發現，門水平上，相比于OVX 組，ZGZTC 組與EV 組厚壁菌門豐度減少，擬桿菌門豐度上升，而此菌在幫助宿主維持腸道微生態平衡方面起到相當重要的作用，同時可通過與雌激素之間的相互作用有效調節骨代謝[21]，說明ZGZTC 可能通過改善OVX 大鼠腸道菌群中厚壁菌門/擬桿菌門的比例，改善由OVX所致的腸道菌群紊亂狀態。 在屬的水平上，ZGZTC能逆轉瘤胃球菌屬優勢菌屬在OVX 大鼠腸道菌群中的豐度減少的情況，減少OVX 組致病菌屬的存在，進一步防止LPS 分泌增加及腸黏膜屏障破壞。毛螺菌科是體內的有害菌，與體質量及血清總膽固醇含量呈正相關，提示其與骨-脂代謝的調節密切相關[22]。本實驗結果顯示，ZGZTC 組毛螺菌科豐度降低，提示ZGZTC 可能通過腸道菌群及其代謝產物進行骨-脂代謝調節，從而發揮抗PMOP 作用。

綜上所述，ZGZTC 能夠通過調節腸道菌群結構、減少炎癥因子生成、改善腸道炎癥等方式調節OVX 大鼠骨的形態學變化。 本實驗為ZGZTC 治療OVX 提供了一定的科學依據，并且證實了其作用機制與調節腸道微生態有關，為補腎類方藥通過調節腸道微生態改善疾病提供了研究基礎。 但本研究只采用了16S rRNA 進行測序，存在覆蓋不足等缺陷，后續將進行更深入的生物信息學分析，并對涉及的相關信號通路行進一步實驗研究。