桃紅四物湯誘導間充質干細胞動員促進骨折修復的機制

曾 朋，陸小龍，徐無忌，向黎黎，李汪洋*，熊 輝*

1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

中醫骨傷科治療骨折以“三期辨證”理論為指導。骨折早期，骨斷筋傷，血溢脈外，治療予以活血化瘀。 既往研究從改善局部血液循環、改變血液流變及增加成骨細胞的活性等方面研究活血化瘀法促進骨折愈合的機制[1]。 隨著研究的深入，發現活血化瘀法能促進間充質干細胞（mesenchymal stem cell, MSC）“歸巢”[2]。 MSC“歸巢”是指MSC 離開原有的微環境（主要是骨髓）進入外周血循環，從外周血管遷移至組織損傷處的過程[3-4]。活血化瘀法促進MSC“歸巢”，包括其促進MSC 動員和遷移，如加味丹參飲促進心肌損傷再灌注損傷大鼠MSC 動員[5]；川芎提取物川芎嗪促進MSC 向缺血腦組織遷移[6]。 “三期辨證”理論對應中醫骨傷“瘀去、新生、骨合”，其相關因子在促骨折愈合、骨形成過程中均與MSC 相關，其中，在促骨愈合早期，MSC“歸巢”作為骨形成的先決條件，在此過程中起著關鍵作用[7]。 目前，藥物促進骨折愈合有局部注射重組人骨形態發生蛋白（recombinant human bone mophogenetic protein, rhBMP）、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）[8]、動物骨多肽類[9]、神經生長因子[10]等方法。 這些藥物主要通過成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF）信號通路、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）信號通路、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）信號通路、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor, IGF）信號通路、Notch 信號通路、Wnt/β-catenin 信號通路等發揮作用。 在骨折早期MSC 定向移動時，各種生長因子、趨化因子和炎性因子都發揮重要的作用[11]。采用蛋白芯片檢測骨折早期主要細胞因子的表達水平。在外周血中存在多種細胞因子，如：VEGF、CX3C趨化因子（fractalkine,FKN）、CXC 趨化因子5（lipopolysaccharide-induced CXC chemokine, LIX）、CC 趨化因子5（normal T cell expressed and presumably secreted,RANTES）、中性粒細胞趨化因子-1（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1,CINC-1）、白細胞介素-1α（interleukin 1α, IL-1α）、細胞間黏附分子-1（soluble intercellular adhesion molecule-1, sICAM-1）、L-選擇素（L-Selectin）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP-1）和巨噬細胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α, MIP-1α），這些因子及相關信號通路參與骨折修復的炎癥期、修復期、重建期[12]。

桃紅四物湯（Taohong Siwu Decoction, THSWD）是骨折早期活血化瘀法的代表方劑，臨床應用甚為廣泛。 已有研究證實，THSWD 不僅在增加血流變、相關因子分泌方面可促進骨愈合[13]，還能增強在血腫期骨痂中CNIC-1、CNIC-3、LIX、VEGF 等多種因子的表達，促進MSC 的“歸巢”[14]。 本研究將建立右側股骨干開放性骨折大鼠模型，觀察THSWD 在骨折早期對骨髓內MSC動員的影響，探究MSC 動員與外周血細胞因子的相關性，試圖探明THSWD 影響MSC 動員的分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

24 只5 周齡SPF 級雄性SD 大鼠，體質量（120±10） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。 動物合格證號：430727221100472812。所有大鼠飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（湘）2019-0009。飼養條件：室溫20～24 ℃，相對濕度50%～70%，12 h 晝夜交替照明，滅菌飼料喂養，自由攝食和飲水。 實驗方案經湖南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，倫理批號：LL20191010001。

1.2 藥物制備

THSWD 的組成和臨床用量參照《醫宗金鑒·卷四十四》，組方如下：生地黃20 g，當歸20 g，赤芍20 g，川芎10 g，桃仁20 g，紅花10 g（批號分別為：NY2001902、NG19121701、NG19122401、SL19112207、2019070204、HY19121803），購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房。 按照上述藥量比例稱取生藥材共300 g，水煎2 次濃度定容至2.4 g/mL，分裝，放置-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要藥物與實驗試劑

SD 大鼠骨髓MSC 完全培養基、SD 大鼠骨髓MSC成骨誘導分化培養基、SD 大鼠脂肪MSC 成脂誘導分化培養基（廣州賽業生物科技有限公司，批號分別為：RASMX-90011、RASMX-90021、RASMD-90031）；CD29 抗體（FITC）及其IgG1 kappa 同型對照、CD45抗體（PE）及其IgG1 kappa 同型對照、紅細胞裂解液（美國賽默飛世爾科技公司，批號分別為：12-0291-80、11 -0291 -80、12 -0461 -80、12 -4714 -81、00 -4300-54）；CD90 抗體（Alexa Fluor 647）及其IgG1 kappa 同型對照（北京Biolegend 生物科技有限公司，批號分別為：202508、400130）；細胞因子蛋白芯片（美國R&D Systems 公司，批號：Ab78608）；戊巴比妥鈉注射液（北京寰宇化工有限公司，批號：096956-001）；PBS 緩沖液（美國西格瑪奧德里奇公司，批號：P4417）。

1.4 主要儀器

細胞流式儀（美國貝克曼庫爾特公司，型號：MoFloAstrios EQ）；光學顯微鏡（中國摩迪克顯微鏡公司，型號：BA410T）；超凈工作臺（北京亞泰隆公司，型號：YT-CJ-2NB）；離心機（美國賽默飛世爾科技公司，型號：ST16R/ST16）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器有限公司，型號：H1650R）；直熱式二氧化碳培養箱（上海三騰儀器有限公司，型號：DH-160I）；倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業儀器儀表有限公司，型號：DSZ2000X）；全自動凝膠成像分析系統（英國Syngene 公司，型號：GBOX-H12-E-M）。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組及藥物干預

將24 只SD 大鼠采用隨機數字表法分為正常組、骨折組和藥物組，每組8 只。前期研究中，在采用包含陽性對照組的試驗中證明THSWD 早期干預下可以促進骨折愈合[15]。 因此，本研究為THSWD 的作用機制研究，未設置陽性對照組。 除正常組大鼠外，其余兩組大鼠采用右側股骨干開放性骨折方法造模。 術前6 h 禁食，去除腿毛，予以1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，進行動物造模[16]。 右側大腿縱行切開長約2 cm 外側切口，沿肌肉間隙將前后肌肉群鈍性分離，暴露股骨干后；將肌肉輕輕牽開，使用迷你型電磨機沿骨干中部橫斷；克氏針從斷端逆行插入近端，穿出大轉子；斷端對位良好后，固定，將克氏針從近端向遠端推進至股骨髁，剪掉大轉子處多余的克氏針，折彎埋入皮下。消毒縫合皮膚。術后將骨折大鼠放置恒溫墊觀察30 min，待所有大鼠復蘇后，予青霉素鈉80 000 U 腹腔注射。 術后第1 天，拍攝X線見骨折內固定在位，斷端對位對線良好，判定造模成功[15]。術后第1 天開始灌胃，每天8:00 和17:00 各灌胃1次。 藥物組予20 g/（kg·d）THSWD，正常組與骨折組予等量蒸餾水，早晚各1 次，連續灌胃5 d。 大鼠的給藥劑量按人與動物體表面積公式折算[17]，將成人臨床等效劑量1.2 g（生藥材）定為本次動物實驗的中劑量，前期實驗證實高倍率稀釋后[18]，采用藥物干預劑量為20 g/（kg·d）。

2.2 外周血和骨髓來源MSC 的分離培養

在藥物組中，使用抗凝真空負壓采血管進行腹主動脈采血，采血量約2 mL/只，每份血液樣本與PBS按照1∶1 比例稀釋后，經過紅細胞裂解液2 次裂解后，離心獲得外周血單核細胞，經PBS 洗滌1次后以完全培養基重懸。 從骨折組大鼠左側未予骨折的股骨干和脛骨取材，使用基礎培養基沖出骨髓，離心后得到細胞沉淀，完全培養基重懸。將外周血來源的單核細胞與骨髓來源的細胞沉淀置于37 ℃含5%CO2的培養箱中孵育，每隔3 d 更換液1 次，至90%融合時傳代消化，收集第5 代細胞用于細胞實驗。

2.3 外周血中的項目檢測

2.3.1 外周血CD45-CD90+CD29+MSC 數目檢測 采用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠后，使用抗凝真空負壓采血管進行腹主動脈取血2 mL/只，進行細胞分離、流式前處理、細胞上樣：分別吸取大鼠外周血500 μL 加入3 mL 紅細胞裂解液，4 ℃下裂解10 min；400×g 5 min 離心得到沉淀；加入3 mL 紅細胞裂解液，4 ℃下裂解10 min；400×g 5 min 離心得到沉淀；采用PBS 重懸收集細胞沉淀，統計細胞總數，用PBS洗滌細胞1 次，并收集細胞；加入500 μL 的Binding Buffer 緩沖液懸浮細胞；加入CD29、CD45、CD90 抗體避光孵育30 min；PBS 洗滌2 次；進行流式細胞儀檢測。

2.3.2 外周血和骨髓來源的MSC 表型鑒定 通過細胞流式分析第5 代外周血和骨髓來源的MSC 的免疫表型。選擇CD90 和CD29 作為陽性標記，CD45作為陰性標記。 具體如下：收集生長良好的P5 代細胞，以1×106個/mL 的密度重懸于PBS 中洗滌細胞1次；加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細胞；加入CD29、CD45、CD90 抗體于溶液中避光孵育30 min，每組以純化的同型熒光標記的小鼠IgG抗體作為對照；PBS 洗滌2 次后于流式固定液中固定30 min；每次采集不低于1×104個細胞進行流式細胞儀檢測。

2.3.3 外周血和骨髓來源的MSC 成骨分化和成脂分化誘導 取生長良好的MSC，以3×104接種于6孔板中，24 h 后棄掉培養基，加入2 mL 成骨誘導液，每3 d 換液1 次，誘導21 d。取出標本進行茜素紅染色和油紅O 染色[19]，PBS 沖洗3 遍，每次5 min；每孔加入2 mL 4%多聚甲醛，固定30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；每孔加入1 mL 稀釋茜素紅染色液或1 mL油紅O 染色工作液，30 min 后，PBS 沖洗3次，每次5 min；顯微鏡下觀察礦化結節或脂滴情況。

2.3.4 外周血血清獲取及蛋白芯片檢測 腹主動脈取血時，更換真空負壓采血管，每只大鼠取血4 mL/管。 分離血清條件：37 ℃水浴15 min，常溫下3 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），獲得的血清進行蛋白芯片檢測，具體操作步驟依照說明，檢測外周血血清中細胞因子的表達情況。

2.4 統計學方法

所有數據采用Graphpad Prism 7.0 統計軟件處理，計量資料以“±s”表示，使用單因素的方差分析，組間差異采用Tukey's 多重比較。 以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 THSWD 可促進CD45-CD90+CD29+MSC 的動員

MSC 不表達CD45 抗原，表達CD90 和CD29 表面抗原。 FCM 三色標記法檢測3 個免疫表型可間接反映MSC 數量變化。從外周血單核細胞中分離得到CD45-CD90+CD29+MSC 的單核細胞即為MSC。 與正常組比較，骨折組大鼠外周血MSC 絕對細胞數目、相對細胞數目增高（P＜0.05），藥物組外周血MSC 絕對細胞數目、相對細胞數目顯著增高（P＜0.01）；與骨折組比較，藥物組大鼠外周血MSC 絕對細胞數目、相對細胞數目增高（P＜0.05）。 詳見圖1。

圖1 骨折大鼠CD45-CD90+CD29+MSC 在不同組別的動員

3.2 THSWD 干預外周血來源CD45-CD90+CD29+MSC 的表型、形態和多向分化潛能的鑒定

通過流式細胞術分析發現：THSWD 干預大鼠骨髓來源的細胞中CD45-、CD90+、CD29+比例和CD45-中CD90+CD29+細胞比例分別為90.94%、98.57%、92.27%和94.15%；而THSWD 干預的外周血來源的細胞CD45-、CD90+、CD29+比例和CD45-中CD90+CD29+分別為90.59%、98.21%、92.03%和93.52%，詳見圖2A。 通過鏡下觀察細胞形態，外周血MSC 較骨髓MSC生長周期明顯延長，細胞克隆數明顯減少；細胞形態基本無明顯區別；經過成骨成脂誘導后，茜素紅和油紅O 染色發現，外周血MSC 和骨髓MSC都能向成骨、成脂肪方向分化，詳見圖2B。

圖2 MSC 不同來源的細胞表型、細胞形態、多向分化潛能的鑒定

3.3 蛋白芯片檢測外周血細胞因子的表達

與正常組比較，骨折組外周血CINC-1 和MIP-1α蛋白表達增高（P＜0.05）。詳見圖3。與骨折組比較，藥物組外周血CINC-1、FKN、L-Selectin、VEGF蛋白表達增高（P＜0.05），IL-1α 蛋白表達降低（P＜0.05）。 詳見圖4。

圖3 蛋白芯片技術檢測骨折后外周血細胞因子的表達

圖4 蛋白芯片技術檢測THSWD 干預后外周血細胞因子的表達

4 討論

動員是指MSC 受到外在刺激后其遷移出原有的微環境（主要是骨髓）進入外周血的過程[20]。 在穩定狀態下很難從外周循環血中培養MSC，之前MSC 能否動員出現在外周血未經證實[21]。 本研究表明，骨折損傷刺激能促進骨髓內MSC 的動員。越來越多的研究發現，MSC 能在各種刺激下被激活而動員進入外周血循環[22-23]，但中醫藥在干預骨折后MSC 動員及其分子機制尚未明確。

骨折初期，血管破壞，血腫形成，骨折處形成缺血缺氧的環境，巨噬細胞及淋巴細胞浸潤到局部，釋放各種炎性因子，誘發炎性反應。 骨髓內或外周血MSC 受炎性信號激活后，啟動骨髓動員并向骨折部位遷移[24]。 在骨折修復期，遷移的MSC 分化大量成纖維細胞出現在有機化血腫、骨折斷端及周圍組織，繼而凋亡、演變成骨祖細胞，骨祖細胞向成骨細胞和軟骨細胞方向分化，與侵入的毛細血管相互作用形成骨痂[25-26]。 骨折重建期，骨痂的吸收和重塑在一定程度上依賴于破骨細胞的骨吸收功能，骨基質釋放活性轉化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β），誘導MSC 遷移和動員到局部修復部位[27]。同時在低氧誘導因子-1α/VEGF 通路下，持續重建的新生血管提供血氧、營養，破骨與成骨細胞循環耦合，骨髓腔、骨皮質先后形成，骨折得以修復[28]。 綜上，MSC“歸巢”中的MSC 動員、遷移與骨折修復具有緊密的內在聯系。

MSC 表面不表達CD45 抗原，但表達CD90、CD29抗原。 本次研究，通過流式細胞術檢測上述抗原的表達以確定外周血MSC 的數目。 結果提示，骨折組中大鼠的外周血CD45-CD90+CD29+單核細胞明顯多于正常組；在THSWD 早期干預后，骨折組大鼠外周血CD45-CD90+CD29+單核細胞進一步增加。 這表明THSWD 可明顯促進MSC 動員。 同時本研究為確定外周血中的MSC 是否來自于骨髓，對THSWD干預的外周血來源的MSC 與骨折大鼠骨髓來源的MSC進行鑒定。 結果顯示，二者表面標記均符合MSC“表達CD90、CD29 抗原，不表達CD45 抗原”的差異性；均為長梭形，貼壁生長；且都能向成骨細胞和成脂肪細胞分化。 因此，本課題組推斷，THSWD 早期干預骨折大鼠后，能促進骨髓內MSC 動員進入外周血。

骨折愈合過程中大量的炎性細胞浸潤和細胞因子釋放入血，募集細胞和促進其他細胞因子的分泌而啟動骨折的修復過程[29]。 本研究通過蛋白芯片檢測，骨折后5 d 外周血中表達CINC-1、FKN、sICAM-1、IL-1α、LIX、L-Selectin、RANTES、TIMP-1、VEGF 和MIP-1α 等細胞因子。

CINC-1 和MIP-1α 濃度在骨折后變化顯著，與正常大鼠比較，骨折大鼠中外周血CINC-1 和MIP-1α增高。 CINC-1 能與CXC 趨化因子受體2 結合并促進中性粒細胞動員[30]；而MIP-1α 能與CC 趨化因子受體1 結合促進巨噬細胞定向移動[31]。 隨著中性粒細胞和巨噬細胞等炎性細胞進入外周血，當骨髓內靜息狀態的MSC 感知上述免疫信號后即被激活進入外周血，參與骨折的修復[32]。

前期研究表明，THSWD 能促進骨折大鼠股骨干骨折骨體積和骨礦化密度的增加[33]。本研究發現，THSWD 可能通過促進骨髓內MSC 動員加快骨折愈合。 蛋白芯片結果提示，THSWD 能增加骨折大鼠外周血中L-Selectin、FKN、CINC-1 和VEGF 表達，并能抑制IL-1α 表達。 FKN 是內皮細胞表達的具有黏附和趨化雙重活性的細胞因子。 有研究報道，FKN能促進骨髓MSC 向缺血損傷的腦組織歸巢[34]。 L-Selectin 作為細胞黏附分子，主要參與白細胞與血管內皮細胞表面的黏附。 研究表明，MSC 不表達L-Selectin 的配體[35]，所以其能否促進MSC 動員需繼續研究。 VEGF 能促進MSC 的生長和鋪展、細胞膜褶皺的形成及黏著斑和應力纖維的組裝[36]。研究表明，MSC 能抑制外周血中巨噬細胞等分泌炎性因子，具有自身免疫調節和抑制炎癥的作用[37]。 另外，外周血IL-1α 表達的降低，可能是由于MSC 動員后的結果，但IL-1α 的降低是否能促進MSC 的動員還尚待證實。

綜上所述，THSWD 作為活血化瘀的代表方在干預骨折早期的大鼠能明顯促進骨髓內MSC 的動員，外周血FKN、CINC-1、VEGF、L-Selectin 的上調、IL-1α 下調可能與其動員分子機制相關，尚待研究。