左歸降糖清肝方對糖尿病性脂肪肝小鼠PGC-1α 和DNMT3A 表達的影響

彭 泉，鐘雁城，楊霄旭，成細華*

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 4102081；2.長春中醫藥大學針灸推拿學院，吉林 長春 130500

近年來2 型糖尿病（type 2 diabetes, T2DM）發病率呈遞增趨勢，2019 年全球有4.63 億糖尿病患者，中國達1.3 億人[1]。 有75%的T2DM 患者并發非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver, NAFLD），其進一步可向肝炎、肝纖維化及肝癌等肝病發展[1]。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ 共激活因子（peroxisomeproliferative activated receptor-γ activation of auxiliary factor1Alpha, PGC-1α)信號通路失調是2 型糖尿病性脂肪肝發生發展的關鍵機制[2]，而PGC-1α 信號失常與其DNA 甲基化異常密切相關，DNA 甲基轉移酶抑制劑能恢復PGC-1α 信號[3]。 因此，抑制DNA 甲基轉移酶（methyltransferase, DNMT）表達，能進一步影響PGC-1α 及其信號通路，改善糖尿病性脂肪肝。

糖尿病性脂肪肝具有本虛（脾肝腎虧虛、氣陰兩虛）標實（毒、瘀蘊積）的病機特點，據滋陰益氣、清熱利濕、化痰消瘀組方的左歸降糖清肝方，能改善糖尿病性脂肪肝高糖脂及肝損傷[4-5]，然而其機制需深入研究。 本研究選用具有遺傳變異的轉基因2 型糖尿病MKR 鼠，加上高脂飼料喂養，模擬臨床人類糖尿病性脂肪肝發生，建立糖尿病性脂肪肝動物模型[6]，經左歸降糖清肝方干預治療后，檢測肝臟PGC-1α、TFAM、NRF1 和DNMT3A 表達，從分子水平探討該復方是否調節PGC-1α 及其信號通路相關基因表達，緩解糖尿病性脂肪肝發生發展。

1 材料與方法

1.1 動物

24 只MKR 鼠（采用組織特異過度表達轉基因技術產生），由美國國立衛生研究院提供純合子MKR鼠[6]，經自然交配后繁殖的后代用于實驗研究。小鼠在湖南中醫藥大學SPF 級實驗動物中心飼養。倫理審核編號：XMBH-202203030004。飼養籠具、墊料、飲水的制備與消毒均符合SPF 級實驗動物飼養要求。

1.2 藥物和試劑

左歸降糖清肝方由黃芪18 g、山藥12 g、熟地黃12 g、黃連6 g、丹參9 g、茵陳15 g、虎杖12 g、郁金9 g、陳皮9 g 組成，均購自湖南中醫藥大學杏林藥號。 制劑方法如下：加水先浸泡30 min，再按照W/V=1/8 量加水，將藥材及水加入煎藥機中煎煮至沸騰，15 min 后取濾液，兩次煎藥所得濾液混合，過濾濃縮至生藥2.4 g·mL-1，4 ℃冰箱貯存備用。

甘油三酯（triglyceride, TG）、游離脂肪酸（free fatty acid, FFA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A110-1-1、A042-1-1）；動物組織總RNA提取試劑盒（批號：B511311-0025）、逆轉錄試劑盒（批號：B600020-0200）、Taq PCR 預混液（批號：B110006）、PCR 引物均購自生工物工程（上海）股份有限公司；多克隆一抗：β-肌動蛋白（β-actin）（京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-8770R）；PGC-1α、DNMT3A、超敏二步法免疫組織化學檢測試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-7535R，bs-23029R、PV-0023）。

1.3 主要儀器

怡成超越JPS 型血糖測試儀；日本日立7150 全自動生化分析儀；BeckmanAllerga 25R 高速冷凍離心機；德國艾本德公司Realplex2 型熒光定量PCR儀；日本尼康公司DS-U3 型成像系統。

1.4 實驗分組

24 只MKR 鼠，8 周時根據性別、體質量，隨機分為對照組、高脂模型組和左歸降糖清肝方（中藥方）組，每組8 只。 高脂模型組和中藥方組小鼠均以高脂飼料（高脂飼料為動物基礎飼料加15%豬油、1%膽固醇）喂養8 周，無小鼠死亡，形成糖尿病性脂肪肝；造模成功的標準：空腹血糖≥11.1 mmol/L，小鼠肝細胞以彌漫性小泡性脂變為主，脂肪性變肝細胞達到70%以上，符合T2DM 合并NAFLD 的病變特點[4]。對照組以基礎飼料喂養。 試驗中無小鼠死亡。 高脂飼料喂養4 周后，中藥方組以左歸降糖清肝方生藥29.64 g·kg-1灌胃[4-5]（中藥藥物劑量依據臨床用藥劑量，按人與動物體表面積計算法換算），對照組和高脂模型組以等體積蒸餾水灌胃，0.5 mL/20 g，每天1次，連續給藥4 周。隔夜禁食不禁水12 h，小鼠稱重后，取小鼠肝臟，稱取肝臟濕重，計算肝指數（肝指數=肝質量/體質量×100%）。

1.5 肝組織形態學觀察

取小鼠肝臟最大葉距邊緣5 mm 處肝組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，病理切片，HE 染色后光鏡觀察，拍照。

1.6 肝臟TG 和FFA 的測定

取新鮮肝臟組織，用9 g/L 的生理鹽水4 ℃制備10%的肝勻漿，3 000 r/min 離心15 min，取上清。 嚴格按照試劑盒要求測定TG 和FFA 含量；TG用單試劑GPO-PAP 法，酶標儀檢測；FFA 用比色法檢測（FFA 與銅離子結合形成脂肪酸的銅鹽而溶于氯仿中，其含量與游離脂肪酸含量成正比）。

1.7 qRT-PCR 檢測小鼠肝組織PGC-1α、TFAM、NRF1 和DNMT3A 的mRNA 表達

取各組小鼠新鮮肝臟組織，用動物組織總RNA提取試劑盒抽提取總RNA，采用紫外分光光度計測定其濃度。取1 μg 總RNA，隨后用逆轉錄試劑盒，以Oligo(dT)為引物進行逆轉錄反應。 PCR 引物見表1。取cDNA，用Bio-Rad CFX Maestrol 1.0 Real-Time系統對目的基因進行熒光定量檢測。 PCR 反應條件：預變性95 ℃，30 s，1 個循環。 PCR 反應95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，30 s；40 個循環。以β-actin作為內參，2-ΔΔCT法計算mRNA 的相對表達量[7]。

表1 目的基因和內參基因引物

1.8 Western blot 檢測PGC-1α 和DNMT3A 的蛋白表達

將肝組織中加入RIPA（細胞裂解液）和PMSF（蛋白酶抑制劑），冰上裂解細胞30 min 后，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，收集上清，BCA 法測定蛋白濃度。 用10%～12%SDS 聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，蛋白分離后在冷卻的含20%甲醇的轉移緩沖液中電泳轉移至PVDF 膜。 轉移后迅速置于TBS 液中，隨后在室溫下含5%脫脂奶粉的TBST 中封閉1 h，洗滌后用相應的一抗按1∶1 000 的比例稀釋后4 ℃孵育過夜，脫色搖床洗膜3 次（15 min/次），用HRP耦聯的山羊抗鼠，兔IgG 室溫孵育2 h，洗滌后用ECL 化學發光試劑盒在凝膠成像分析系統（Bio-Rad公司）顯影，使用軟件分析條帶灰度值分析[7]。

1.9 免疫組織化學檢測PGC-1α 的蛋白表達

免疫組織化學嚴格按照試劑盒說明書進行操作。 不著色為陰性。PBS 取代一抗作陰性對照，已知陽性組織作陽性對照。 以細胞內有明顯的棕黃色信號顆?；蛐盘柊邽殛栃訹6]。

1.10 統計學分析

所有實驗數據用SPSS 26.0 統計軟件進行統計分析，結果用“±s”表示，多組間比較服從正態分布，采用單因素方差分析，組間方差齊時采用LSD 檢驗，方差不齊，采用GamesHowell(A)檢驗；不服從正態分布資料，采用秩和檢驗。P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝臟病理形態的影響

光鏡下可見，對照組MKR 鼠肝組織肝小葉結構正常，肝細胞規則排列，肝細胞大小正常，胞核位于細胞中央；高脂模型組MKR 鼠肝細胞則以彌漫性小泡性脂變為主；中藥方組MKR 鼠肝組織脂肪性變程度明顯改善。 詳見圖1。

圖1 肝組織病理形態學變化（HE，×400）

2.2 左歸降糖清肝方對小鼠血糖及肝指數的影響

與對照組比較，高脂模型組血糖、體質量、肝質量和肝指數差異均有統計學意義（P<0.01）。 與高脂模型組比較，中藥方組小鼠除體質量外，血糖、肝質量和肝指數均有改善，差異均有統計學意義（P<0.01）。詳見表2。

表2 左歸降糖清肝方對小鼠血糖及肝指數的影響（±s，n=8）

表2 左歸降糖清肝方對小鼠血糖及肝指數的影響（±s，n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高脂模型組比較，△△P＜0.01。

組別對照組高脂模型組中藥方組血糖8.32±0.53 12.21±0.46**8.78±0.49△△體質量/g 21.350±2.14 25.21±3.38**24.14±1.82肝質量/g 1.098±0.104 2.231±0.143**1.564±0.073△△肝指數/（×10-2）5.143±0.034 8.849±0.101**6.488±0.058△△

2.3 左歸降糖清肝方對小鼠肝臟TG 和FAA 的影響

與對照組比較，高脂模型組和中藥方組肝臟TG和FAA 含量差異均有統計學意義（P<0.01）。與高脂模型組比較，中藥方組TG 和FAA 含量均有下降，差異均有統計學意義（P<0.01）。 詳見表3。

表3 左歸降糖清肝方對小鼠肝臟TG 和FAA 含量的影響（±s，n=8，μmol/g）

表3 左歸降糖清肝方對小鼠肝臟TG 和FAA 含量的影響（±s，n=8，μmol/g）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與高脂模型組比較，△△P＜0.01。

組別對照組高脂模型組中藥方組TG 25.69±2.38 51.12±5.48**35.54±3.21△△FAA 31.64±2.41 96.46±7.87**56.89±5.21△△

2.4 左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細胞PGC-1α、TFAM、NRF1 和DNMT3A mRNA 表達的影響

與對照組比較，高脂模型組PGC-1α、NRF1 和TFAM mRNA 表達下調，而DNMT3A mRNA 表達上調，差異均有統計學意義（P<0.01）。 與高脂模型組比較，中藥方組能上調PGC-1α、NRF1 和TFAM mRNA表達，下調DNMT3A mRNA 表達，差異均有統計學意義（P<0.01）。 詳見表4。

表4 各組小鼠PGC-1α、NRF1、TFAM 和DNMT3A mRNA表達比較（±s，n=6）

表4 各組小鼠PGC-1α、NRF1、TFAM 和DNMT3A mRNA表達比較（±s，n=6）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與高脂模型組比較，△△P＜0.01。

組別對照組高脂模型組中藥方組PGC-1α 0.812±0.042 0.498±0.032**0.687±0.041△△NRF1 1.232±0.093 0.627±0.053**0.844±0.035△△TFAM 0.985±0.084 0.513±0.034**0.796±0.053△△DNMT3A 0.385±0.023 0.744±0.045**0.582±0.028△△

2.5 Western blot 檢測左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細胞PGC-1α 和DNMT3A 蛋白表達的影響

與對照組比較，高脂模型組和中藥方組PGC-1α蛋白表達下調，而DNMT3A 蛋白表達上調，差異均有統計學意義（P<0.01）；與高脂模型組比較，中藥方組能上調高脂飲食MKR 鼠PGC-1α 蛋白表達，下調DNMT3A 表達，差異均有統計學意義（P<0.01）。詳見圖2。

圖2 左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細胞PGC-1α 和DNMT3A 蛋白表達的影響（n=3）

2.6 免疫組織化學檢測左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細胞PGC-1α 蛋白表達的影響

免疫組織化學顯示，PGC-1α 蛋白分布在胞漿，染色后成棕褐色，在MKR 鼠肝細胞中PGC-1α 含量高，高脂飲食MKR 鼠肝細胞中明顯減少，左歸降糖清肝方能增加PGC-1α 蛋白表達。 詳見圖3。

圖3 左歸降糖清肝方對高脂飲食MKR 鼠肝細胞PGC-1α 蛋白表達的影響（免疫組織化學，×400）

3 討論

TM2D 中NAFLD 的發生率持續增加，正成為主要的健康負擔，但目前缺乏標準的治療方案[8-9]。 中醫藥在防治糖尿病性脂肪肝中凸顯優勢[4-5,10-11]。糖尿病性脂肪肝，據其臨床特點，中醫學將其歸屬于“消渴”“脅痛”“積聚”等范疇，其主要病因為飲食不節、起居無常、不知持滿、不時御神、情志失調、久病體虛。 據滋陰益氣、清熱利濕、化痰消瘀組方的左歸降糖清肝方，能減輕高脂飲食加劇的MKR 鼠的胰島抵抗，降低血糖、ALT、AST 和血脂水平[4-5,11]。

在骨骼肌、肝臟、褐色脂肪組織和心臟的脂質代謝中，PGC-1α 促進NRF1 表達，NRF1 隨后上調TFAM，進而刺激線粒體DNA(mtDNA)轉錄和復制，促進線粒體生物合成，從而調控氧化磷酸化相關酶的表達來調節脂質代謝[12-13]。 此外PGC-1α 具有直接調節脂質代謝轉錄因子[如過氧化物酶體增殖劑激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα）、固醇調節元件結合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c, SREBP-1c）等的效應，促進了線粒體脂肪酸β 氧化，抑制脂肪酸合成，參與脂質代謝[14-15]。 肝臟、骨骼肌等器官PGC-1α 表達異常，線粒體功能紊亂和脂肪酸β 氧化不完全是2 型糖尿病性脂肪肝發生的主要機制[3]。 本實驗中，高脂飲食MKR 鼠肝臟PGC-1α、NRF1 和TFAM的mRNA 表達顯著下降（P<0.01），PGC-1α蛋白表達也顯著下降（P<0.01），與本研究團隊前期研究高脂飲食MKR 鼠PGC-1α 調控的SREBP-1c 表達水平顯著增加的結果是一致的[16]，表明高脂飲食MKR 鼠肝臟中PGC-1α 下調，出現線粒體功能低下，脂肪酸β-氧化下降，脂肪酸合成增加，脂質在肝臟內不斷積累成脂肪肝；左歸降糖清肝方能上調糖尿病性脂肪肝小鼠PGC-1α 表達，進一步調節PGC-1α 信號通路，降低肝臟脂質堆積。

DNA 甲基化與糖尿病及其并發癥的發生密切相關[3,17-18]，缺乏膽堿和葉酸飲食的A/J 和WSB/EiJ小鼠，肝臟DNMT1 和DNMT3A 上調，高甲基化改變與肝脂質堆積及損傷顯著相關[19]；在神經細胞中發現，FFAs 誘導了PGC-1α 啟動子高甲基化，導致PGC-1α 表達減少[20]。 本實驗中，高脂飲食MKR 鼠肝臟DNMT3A 表達顯著增加，與PGC-1α 表達呈負相關。本研究團隊推測，可能PGC-1α 存在DNA 甲基化異常，抑制了PGC-1α 表達。左歸降糖清肝方干預治療后，高脂飲食MKR 鼠肝臟DNMT3A mRNA 和蛋白表達均顯著降低，PGC-1α 則顯著上升，說明該復方可能通過下調DNMT3A 表達，減少PGC-1α 甲基化，促進PGC-1α 表達，減少肝臟脂質堆積。

本實驗結果初步證明，左歸降糖清肝方可調節PGC-1α 及其信號通路基因表達來減緩脂肪肝的發生，從分子水平證實了該復方能緩解糖尿病性脂肪肝的發展，對肝臟具有保護作用。 同時發現，該復方可以抑制高脂飲食MKR 鼠肝臟DNMT3A 基因表達，推測該復方通過下調DNMT3A 表達，減少PGC-1α DNA 甲基化，從而促進PGC-1α 表達，進一步調節肝臟脂肪代謝相關基因表達，減少肝臟脂質堆積。本研究團隊后期將進一步通過體外實驗，設計甲基化酶激活劑組和抑制劑組等，檢測PGC-1α 啟動子甲基化水平及PGC-1α 下游通路，深入研究左歸降糖清肝方基于DNA 甲基化修飾調控PGC-1α 通路防治糖尿病性脂肪肝的作用機制。