基于實(shí)驗(yàn)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討芍藥甘草湯治療子宮腺肌病的機(jī)制

鄺梓君，盧 潔，賈金金，曾 誠，韓 慧，李佩瓊，曾玉燕*

1.佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣東 廣州 510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；4.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120

子宮腺肌病（adenomyosis, AM）是指具有活性的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)侵入正常的子宮肌層，形成彌漫性或局限性的病變，進(jìn)而引起漸進(jìn)性痛經(jīng)、月經(jīng)過多、不孕等臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的身心健康[1]。 AM 在育齡期女性中的發(fā)病率為7%～23%，且逐漸年輕化[2]。 該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與子宮內(nèi)膜基底部內(nèi)陷及組織損傷修復(fù)、子宮肌層內(nèi)的胚胎多能干細(xì)胞化生、炎癥刺激、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成、遺傳、免疫反應(yīng)等機(jī)制相關(guān)[2]。 其根治性方法是行子宮全切除術(shù)，但考慮到年齡、生育要求等因素，該方法只適用于少數(shù)患者。 而非甾體抗炎藥、孕激素類藥物、促性腺激素釋放激素激動劑等藥物治療可緩解患者臨床癥狀，但臨床療效短暫，具有一定毒副作用，停藥后容易復(fù)發(fā)。

AM 歸屬于中醫(yī)學(xué)“月經(jīng)過多”“痛經(jīng)”“癥瘕”“不孕”等疾病范疇。 中醫(yī)藥對緩解AM 相關(guān)癥狀，尤其是緩解疼痛方面療效顯著，可控制病灶，不影響患者的生育需求[3]。 芍藥甘草湯出自《傷寒雜病論·辨太陽病脈證并治》，以芍藥為君、甘草為臣，僅此二藥配伍而成，組方精簡，具有養(yǎng)血斂陰、調(diào)和肝脾、緩急止痛之功效。 現(xiàn)代藥理學(xué)和臨床研究表明，芍藥甘草湯具有顯著的解痙鎮(zhèn)痛等作用[4-5]，常用于治療痙攣性、疼痛性、炎癥性疾病以及婦科疾病等[6]。本研究旨在探討經(jīng)典名方芍藥甘草湯對AM 間質(zhì)細(xì)胞的影響，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)掘芍藥甘草湯治療AM 可能涉及的分子作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)研究

1.1 主要試劑

DMEM（武漢Servicebio 生物科技有限公司，批號：G4510）；澳洲胎牛血清、胰酶+酚紅+0.25%EDTA（美國GIBCO 公司，批號分別為：10099-141、25200056）；膠原酶Ⅰ型（美國Sigma 公司，批號：C0130）；廣譜細(xì)胞角蛋白抗體、波形蛋白抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號分別為：ZM-0069、ZM-0260）；酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG 聚合物（上海Gene Tech 公司，批號：GK500505A）；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗，100×）（武漢Procell 公司，批號：PB180120）；PBS 緩沖液（1X）（Biosharp 公司，批號：BL302A）；MTT（美國MCE公司，批號：HY-15924）；Annexin V-APC/7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技有限公司，批號：KGA1026）；二甲基亞砜（DMSO）（美國MP 公司，批號：196055）。

1.2 主要儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱[上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號：BPN-150CH（UV）]；倒置顯微鏡（廣州Mshot科技有限公司，型號：MF52-N）；臺式低速離心機(jī)、臺式高速離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司，型號分別為：L3-5K、H1-16K）；恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司，型號：HH-2）；流式細(xì)胞儀（美國BECKMAN公司，型號：CytoFLEX）；酶聯(lián)免疫分析儀（山東BIOBASE 公司，型號：BK-EL10C）。

1.3 標(biāo)本取材

實(shí)驗(yàn)所需人體組織取自2020 年9 月至2021 年12 月于廣東省中醫(yī)院婦科住院并要求行全子宮切除手術(shù)治療的AM 痛經(jīng)患者共10 例。 子宮離體后，在無菌條件下解剖子宮，取較硬處病灶3 cm×3 cm×2 cm。該實(shí)驗(yàn)通過廣東省中醫(yī)院倫理委員會同意（倫理審批號：BF-2020-123-01）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 AM 原代細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定 標(biāo)本用無菌眼科剪碎組織至1 mm×1 mm×1 mm，加入Ⅰ型膠原酶，為組織體積2～3 倍。 置于37 ℃恒溫水浴箱中消化4～6 h 后終止消化，以100 目濾網(wǎng)過濾后400 目復(fù)濾，留取濾出的混懸液，置于離心機(jī)以1 000 r/min離心10 min（離心半徑62.5 mm），共2 次，棄上清液，向裝有沉淀物的離心管中加入含10%FBS 的DMEM 細(xì)胞完全培養(yǎng)基4 mL，以5×105種植至25 cm×25 cm的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后第1 次換液，之后視細(xì)胞生長情況3～5 d 換液1 次，在細(xì)胞生長融合達(dá)到80%～90%時，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，取第2～3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法（immunocytochemistry, ICC）以波形蛋白抗體、角蛋白抗體對AM 間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定。

1.4.2 芍藥甘草湯水煎液藥物制備 購置白芍180 g、甘草72 g（購于廣東省中醫(yī)院中藥房，批號分別為2111005、G042171），藥材分別碎成粉末狀，再次配比，8 倍量蒸餾水煮沸10 min，轉(zhuǎn)文火煮50 min。在80 ℃下濃縮至流浸膏狀，定容至1 mL 含生藥0.3 g的芍藥甘草湯水煎液。

1.4.3 含藥血清的制備 根據(jù)含藥血清劑量不同，分為：正常血清組，芍藥甘草湯低、中、高劑量組。 大鼠的給藥劑量按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]標(biāo)準(zhǔn)動物的等效劑量折算系數(shù)的5 倍。 芍藥甘草湯低、中、高劑量分別為1.15×103、2.31×103、4.62×103mg/（kg·d）。 含藥血清制備方法參照課題組前期研究[8]：將上述濃度配制后，每只大鼠灌胃2 mL，正常血清組予等量的生理鹽水。早晚各1 次，間隔12 h，共3 d。第3 天給藥時禁食不禁飲，最后1 次給藥1 h 后對大鼠進(jìn)行腹主動脈取血，血清在室溫靜置1 h，離心、分離，同組血清混勻，56 ℃水浴30 min 作滅活處理，0.22 μm 微孔濾膜除菌，所得血清分裝保存于－80 ℃冰箱備用，避免反復(fù)凍融。

1.4.4 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)期生長的AM間質(zhì)細(xì)胞種植于96 孔版中，每孔約1×104個細(xì)胞。分為以下5 組：空白組（AM 原代細(xì)胞），正常血清組（AM 原代細(xì)胞+正常血清），AM 原代細(xì)胞+芍藥甘草湯含藥血清低、中、高劑量組，各組依次培養(yǎng)，干預(yù)24 h、48 h 之后換成完全培養(yǎng)基100 μL，每孔加入MTT 溶液10 μL，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO 震蕩10 min，酶標(biāo)儀上以570 nm 波長檢測各孔吸光度（OD），計算細(xì)胞增殖率，篩選出效果更顯著的干預(yù)時間繼續(xù)下一步的實(shí)驗(yàn)步驟。 細(xì)胞生長增殖率（%）=（用藥組OD-空白組OD）/（正常血清組OD-空白組OD）×100%。

1.4.5 細(xì)胞劃痕檢測細(xì)胞遷移水平 取對數(shù)期生長的AM 間質(zhì)細(xì)胞，分組同“1.4.4”。 根據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出干預(yù)時間為48 h。 馬克筆在6 孔板背后，均勻地劃橫線，橫穿過孔；以1×106個/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)6 孔板，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜；待細(xì)胞密度達(dá)到90%以上，鋪滿6 孔板底部，用槍頭垂至于背后的橫線劃痕；用PBS 洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入對應(yīng)血清，同時拍取照片；放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，拍取48 h照片。

1.4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的AM 細(xì)胞，分組同“1.4.4”。 以5×105個/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)6 孔板，分別加入對應(yīng)血清，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS 將細(xì)胞潤洗2 次，1 200 r/min，5 min離心（離心半徑62.5 mm），加入500 μL Binding Buffer，重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-APC混勻后加入5 μL 7-AAD，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，計算細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計分析

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php），Pub-Chem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），Swiss-ADME網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（http://www.swissadme.ch/index.php），Swiss Target Prediction 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/），STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl），Metascape 數(shù)據(jù)庫（http://metascape.org/gp/index.html），微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/），易漢博生物信息在線作圖（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.html），網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape3.6.0。

2.2 芍藥甘草湯活性成分的篩選

將“白芍”“甘草”作為Herd name 輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索其化學(xué)成分，并根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫設(shè)置口服生物利用度（oral bioavaila bility, OB）≥30%及類藥性（druglikeness, DL）≥0.18，獲得白芍和甘草的主要活性成分。根據(jù)文獻(xiàn)補(bǔ)充的化合物以“經(jīng)胃腸可吸收度=‘HIGH’，DL≥2 個‘YES’”為條件在SwissADME 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選。

2.3 藥物作用靶點(diǎn)的預(yù)測及疾病靶點(diǎn)的獲取

經(jīng)過上述方法篩選獲得芍藥甘草湯的主要活性成分后，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫獲得其Canonical SMILE結(jié)構(gòu)，并輸入Swiss Target Prediction 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行主要活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測分析，提取可能性大于0的作用靶點(diǎn)。 把“adenomyosis”作為檢索詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得AM 的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.4 藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將疾病靶點(diǎn)與藥物作用靶點(diǎn)取交集，得到芍藥甘草湯治療AM 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。 借助在線制作工具Draw Venn Diagram 繪制韋恩圖。 利用Cytoscape 3.6.0 軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洚悩?gòu)學(xué)分析，尋找芍藥甘草湯治療AM 的重要活性成分和靶點(diǎn)。

2.5 靶點(diǎn)蛋白相關(guān)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

采用STRING 數(shù)據(jù)庫對芍藥甘草湯治療AM 的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，并借助Cytoscape 3.6.0 對蛋白互作關(guān)系進(jìn)行可視化分析，以節(jié)點(diǎn)度值（Degree）、中介中心度（Betweenness Centrality）、緊密中心性（Closeness Centrality）等作為篩選指標(biāo)，首先以“Degree≥中位數(shù)”作為篩選條件進(jìn)行第一次靶點(diǎn)提取分析，隨后以“Degree、Betweenness Centrality、Closeness Centrality≥中位數(shù)”作為篩選條件進(jìn)行第2 次靶點(diǎn)提取分析，逐步篩選出芍藥甘草湯治療AM的核心靶點(diǎn)。 利用Metascape 數(shù)據(jù)庫，依據(jù)分子復(fù)合物檢測算法（molecular complex detection, MCODE）對關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析及功能注釋。

2.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO 和KEGG 通路富集分析

借助Metascape 數(shù)據(jù)庫對芍藥甘草湯治療AM的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能GO 富集分析和KEGG 通路分析，選擇P＜0.01，最小計數(shù)3，富集因子＞1.5 的基因功能群分別進(jìn)行分子功能、生物過程、細(xì)胞組成以及KEGG 通路進(jìn)行分析。 同時，利用在線作圖工具微生信平臺及易漢博生物信息在線作圖構(gòu)建GO富集分析柱狀圖和KEGG 通路信息圖。

3 結(jié)果

3.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

在提取原代細(xì)胞48～72 h 后，顯微鏡下觀察部分細(xì)胞可貼壁。 培養(yǎng)過程中AM 間質(zhì)細(xì)胞呈典型梭形生長，相互平行排列，活力較好。 細(xì)胞凍存復(fù)蘇后細(xì)胞活性穩(wěn)定，形態(tài)大致與原代細(xì)胞相同。ICC 結(jié)果顯示， 間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白波形蛋白成強(qiáng)陽性表達(dá)，而上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白角蛋白呈陰性表達(dá)，說明細(xì)胞活性和純度均較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。詳見圖1。

圖1 AM 間質(zhì)細(xì)胞圖（ICC×100）

3.2 芍藥甘草湯對AM 間質(zhì)細(xì)胞增殖率的影響

與干預(yù)24 h 后比較，干預(yù)48 h 后芍藥甘草湯含藥血清低、中、高劑量各組細(xì)胞增殖率均降低（P＜0.05），提示48 h 抑制細(xì)胞增殖率明顯強(qiáng)于24 h，效果呈時間依賴性，故篩選出48 h 干預(yù)時間的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 與空白組、正常血清組比較，干預(yù)24 h后芍藥甘草湯含藥血清中、高劑量組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05），干預(yù)48 h 后芍藥甘草湯含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）。與芍藥甘草湯含藥血清低劑量組比較，干預(yù)48 h 后芍藥甘草湯含藥血清中、高劑量組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）；與芍藥甘草湯含藥血清中劑量組比較，芍藥甘草湯含藥血清高劑量組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 芍藥甘草湯含藥血清對AM 間質(zhì)細(xì)胞增殖率的影響（±s）

表1 芍藥甘草湯含藥血清對AM 間質(zhì)細(xì)胞增殖率的影響（±s）

注：A.空白組；B.正常血清組，C、D、E 組分別為芍藥甘草湯含藥血清低、中、高劑量組。 與24 h 比較，#P＜0.05；與空白組比較，*P＜0.05；與正常血清組比較，※P＜0.05；與芍藥甘草湯含藥血清低劑量組比較，△P＜0.05；與芍藥甘草湯含藥血清中劑量組比較，▲P＜0.05。

分組24 h OD 值增殖率/%48 h OD 值增殖率/%ABCDE 0.65±0.03 0.64±0.01 0.61±0.02 0.53±0.02 0.48±0.02 1.00 0.98±0.05 0.93±0.02 0.81±0.06*※0.72±0.06*※0.88±0.03 0.86±0.01 0.75±0.01 0.67±0.03 0.54±0.02 1.00 0.97±0.05 0.84±0.02*※#0.75±0.03*※#△0.58±0.04*※#△▲

3.3 芍藥甘草湯對AM 間質(zhì)細(xì)胞遷移的影響

與空白組、正常血清組比較，干預(yù)48 h 后芍藥甘草湯含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞遷移距離均縮短（P<0.05）。與芍藥甘草湯含藥血清低劑量組比較，干預(yù)48 h 后芍藥甘草湯含藥血清中、高劑量組細(xì)胞遷移距離縮短（P＜0.05）；與芍藥甘草湯含藥血清中劑量組比較，芍藥甘草湯含藥血清高劑量組細(xì)胞遷移距離縮短（P＜0.05）。 詳見表2、圖2。

表2 芍藥甘草湯含藥血清對AM 間質(zhì)細(xì)胞遷移的影響

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（ICC×100）

3.4 芍藥甘草湯對AM 間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

與空白組、正常血清組比較，干預(yù)48 h 后芍藥甘草湯含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）。與芍藥甘草湯含藥血清低劑量組比較，干預(yù)48 h 后芍藥甘草湯含藥血清中、高劑量組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與芍藥甘草湯含藥血清中劑量組比較，芍藥甘草湯含藥血清高劑量組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。 詳見表3、圖3。

表3 芍藥甘草湯含藥血清對AM 間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

圖3 流式檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

3.5 芍藥甘草湯活性成分及靶點(diǎn)的篩選

根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共獲得白芍化合物85 個，甘草化合物92 個。 根據(jù)文獻(xiàn)報道，補(bǔ)充了白芍化合物36 個。 但限于OB、DL、胃腸可吸收度等條件及Pubchem、Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫的篩選，最終得到白芍化合物21 個、甘草化合物86 個，二者共有化合物3 個，分別為白樺脂酸、谷甾醇、山柰酚。通過Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫的預(yù)測，共獲得芍藥甘草的作用靶點(diǎn)共822 個。 以“adenomyosis”作為檢索詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索得到AM 的相關(guān)靶點(diǎn)294 個。 二者進(jìn)行交集，并制作韋恩圖，詳見圖4。得到芍藥甘草湯治療AM 的關(guān)鍵靶點(diǎn)58 個，涉及98 個中藥成分，約占總活性成分95%。

圖4 疾病與藥物靶點(diǎn)的韋恩圖

通過Cytoscape 3.6.0 構(gòu)建“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并行性網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洚悩?gòu)學(xué)分析，詳見圖5。該網(wǎng)絡(luò)圖包含158 個節(jié)點(diǎn)、917 條邊，其中綠色三角形節(jié)點(diǎn)代表中藥，五邊形橙色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，圓形紅色節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵靶點(diǎn)。 Degree 值越大，則節(jié)點(diǎn)面積越大，顏色越深。根據(jù)Degree 值排名，前十的化學(xué)成分甘草寧G（Gancaonin G）、鱗葉甘草素A（Glepidotin A）、刺果甘草查爾酮（Glypallichalcone）、Kanzonol F、8α-羥基甘草次酸（18α-hydroxyglycyrrhetic acid）、白藜蘆醇（Resveratrol）、苜蓿毒素（Medicarpin）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、山柰酚（kaempferol）、異三醇（Isotrifoliol）。 排名前十的靶點(diǎn)為雌激素β 受體（estrogen receptor β,ESRβ）、雌激素α受體（estrogen receptor α,ESRα）、P450芳香化酶基因（cytochrome P-450AROM, CYP19A1）、17-β-羥基類固醇脫氫酶2 型（17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2, HSD17B2）、表皮生長因子（epidermal growth factor receptor, EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1, MMP-1）、多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶（polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase, ALOX5）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3, MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）。詳見表4。

表4 Degree 排名前十的活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

3.6 靶點(diǎn)蛋白相關(guān)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用STRING 數(shù)據(jù)庫對芍藥甘草湯的作用靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析， 獲取其蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，借助Cytoscape3.6.0 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。 該網(wǎng)絡(luò)包含58 個節(jié)點(diǎn)，相互關(guān)系440 條，Degree 值中位數(shù)為12。以“Degree≥12”為條件篩選提取核心網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洚悩?gòu)學(xué)分析，計算得到Degree、Betweenness Centrality、Closeness Centrality 中位數(shù)后，以“Degree≥16，Betweenness Centrality≥0.006 782 9，Closeness Centrality≥0.681 818 18”作為條件，進(jìn)行第2 次核心網(wǎng)絡(luò)的提取，過程如圖6。最終得到PPI 網(wǎng)絡(luò)含有13 個節(jié)點(diǎn)，包括血管生長內(nèi)皮因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、EGFR、MMP-9、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（serine/threonine-protein kinase mTOR,mTOR）、細(xì)胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin-D1,CCND1）、前列腺素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2）、MMP-2、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase, AKT1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、纖維母細(xì)胞生長因子-2（fibroblast growth factor-2,FGF-2）、ESR1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）、孕激素受體（progesterone receptor, PGR）是芍藥甘草湯治療AM 的核心靶點(diǎn)。

3.7 分子復(fù)合物檢測

通過Metascape 數(shù)據(jù)庫的MCODE 算法對關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊預(yù)測，結(jié)果顯示靶蛋白中有功能相似的蛋白復(fù)合物，K-core 值>3 的共有5個。 每個模塊中的蛋白有著緊密的聯(lián)系，協(xié)同參與調(diào)控某條信號通路、某項生物過程或某種分子功能。 各模塊蛋白聚集的生物過程和通路分析。 詳見表5。

表5 芍藥甘草湯關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)MCODE 模塊分析

3.8 GO 基因富集分析

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，篩選P<0.01，最小計數(shù)3，富集因子>1.5 的條目，顯示芍藥甘草湯治療AM 涉及1 164 個生物過程、50 個細(xì)胞組成、69 個分子功能。 根據(jù)P 值排名，生物過程、細(xì)胞組成和分子功能各前二十的富集條目，詳見圖7。 結(jié)果提示芍藥甘草湯治療AM 主要參與細(xì)胞遷移、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞成分運(yùn)動的正調(diào)控，上皮細(xì)胞增殖、血管發(fā)育、腺體發(fā)育等生物過程，調(diào)控發(fā)揮核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、趨化因子結(jié)合、雌激素受體活性等分子功能，涉及核膜、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞體、軸突、神經(jīng)元細(xì)胞體等細(xì)胞組成。

圖7 芍藥甘草湯GO 富集分析

3.9 KEGG 通路分析

A

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，篩選P<0.01、最小計數(shù)3、富集因子>1.5 的條目，共得到130 條。 根據(jù)P 值排名，前二十名通路詳見圖8。 以癌癥居多，包括癌癥通路、癌癥的微小RNA、前列腺癌、胃癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌、膀胱癌等，提示芍藥甘草湯可能具有潛在的抗癌治療作用，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。 在富集的條目中，芍藥甘草湯治療AM 可能涉及的通路主要包括內(nèi)分泌抵抗、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B 信號（Phosphatidylinositol 3-kinase-RAC serine/threonine-protein kinase, PI3K-Akt）信號通路、局部黏附、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1,HIF-1）信號通路、雌激素信號通路、類固醇激素生物合成、絲裂原活化蛋白激酶信號（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號通路、卵巢類固醇生成等，這些通路主要與血管生成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移侵襲、細(xì)胞凋亡、性激素合成代謝等相關(guān)。

圖8 芍藥甘草湯KEGG 通路富集分析

4 討論

AM 發(fā)病率逐年增高，其中15%～30%的患者痛經(jīng)，AM 也可導(dǎo)致繼發(fā)性不孕、早期流產(chǎn)[9]等，給患者造成極大的心理負(fù)擔(dān)。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AM 的根本病機(jī)是機(jī)體氣血失和，臟腑功能失調(diào)、沖任損傷，致部分經(jīng)血不循常道而逆行，“離經(jīng)”之血瘀積，蓄積胞宮，瘀滯日久則為癥瘕[10]。芍藥甘草湯是緩急止痛名方，方中白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛、平抑肝陽功效；甘草補(bǔ)益脾氣、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥。臨床上芍藥甘草湯常用于治療頸肩腰腿痛證、消化性潰瘍、三叉神經(jīng)痛等多種痛癥[11]。 鄭仁省等[12]研究結(jié)果提示，芍藥甘草湯治療痛經(jīng)可有效改善臨床癥狀，降低炎癥指標(biāo)，緩解疼痛。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，芍藥甘草湯具有抗炎鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)、解痙鎮(zhèn)痛等作用[13]。本研究表明，芍藥甘草湯含藥血清能顯著抑制AM間質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)AM 間質(zhì)細(xì)胞凋亡，療效呈濃度和時間依賴性，其中以高濃度芍藥甘草湯含藥血清干預(yù)48 h 效果最好。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，本課題組認(rèn)為芍藥甘草湯是通過MMP、EGFR、CCND1、HIF-1、PI3K-Akt 信號通路等多成分、多靶點(diǎn)、多信號通路的相互作用，抑制AM 間質(zhì)細(xì)胞增殖、遷移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，干預(yù)AM 的發(fā)生發(fā)展，緩解痛經(jīng)。MMP 是降解和重建細(xì)胞外基質(zhì)的重要蛋白酶，它可以通過蛋白質(zhì)水解法降解細(xì)胞外基質(zhì)的各種成分，使細(xì)胞能夠入侵組織。研究證實(shí)，MMP-9、MMP-2 在AM 患者中顯著表達(dá)，且與VEGF 的表達(dá)呈正相關(guān)，MMP-9、MMP-2 的高表達(dá)促進(jìn)了子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移、侵襲的過程以及血管生成過程[14]。 EGFR 是一種細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性。 當(dāng)EGFR內(nèi)在蛋白激酶被激活，形成磷酸化的EGFR 后，可參與多種下游信號通路調(diào)控細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡、誘發(fā)腫瘤血管產(chǎn)生、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。 磷酸化信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（phospho-signal transducer and activator of transcription 3, p-STAT3）是位于EGFR 下游的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及微血管的形成，降解腫瘤基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，降低細(xì)胞間黏附能力，以此來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。 EGFR、STAT3 在AM 在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達(dá)均高于正常內(nèi)膜組。 研究證實(shí)，加味芍藥甘草湯可抑制EGFR 和p-EGFR，使其下游STAT3 和p-STAT3 的表達(dá)下降，從而抑制AM細(xì)胞的遷移和增殖[15]。EGFR 與VEGF 受體VEGFR具有的共同下游信號通路PI3K/AKT/mTOR 與血管生成，細(xì)胞增殖、生長、轉(zhuǎn)移和黏附相關(guān)。Akt1 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖、凋亡和血管生成等。PI3K-Akt信號通路參與多種生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外機(jī)制的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、存活等生物過程[16-17]。mTOR 是Akt 下游的一個重要作用靶點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外多種信號對細(xì)胞代謝、生長、增殖等重要生命活動的調(diào)節(jié)[18-19]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路的激活促進(jìn)了AM 病灶細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成[20-21]。 此外，局灶黏附與細(xì)胞的增殖、生長、遷移有關(guān)，該信號中的重要啟動因子局部黏著斑激酶被證實(shí)在AM 患者的在位內(nèi)膜中高表達(dá)，其下游通路有MAPK 信號通路和PI3K-Akt 信號通路，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，促進(jìn)內(nèi)膜細(xì)胞向肌層侵入，形成異位內(nèi)膜病灶[22-23]。人類CCND1 基因位于11 號染色體長臂上，其編碼的細(xì)胞周期蛋白cyclin D1 是細(xì)胞周期從G1-S 過度的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要通過細(xì)胞增殖途徑參與腫瘤的形成[24]。最新研究表明，采用PI3Kα 抑制劑BYL719 或mTOR 抑制劑everolimus 靶向抑制PI3K/mTOR 信號通路相關(guān)因子的表達(dá)可下調(diào)cyclin D1 蛋白水平[25]。 Cyclin D1過表達(dá)主要與周期蛋白依賴性蛋白激酶4（cyclindependent kinase4, CDK4）或CDK6、CDK2 結(jié)合成復(fù)合物，加快細(xì)胞通過G1 檢查點(diǎn)，具有推動細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，與異位子宮內(nèi)膜的異常生長、增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)表現(xiàn)有關(guān)[26]。 研究發(fā)現(xiàn)，AM 作為一種雌激素依賴性疾病，雌激素受體過度激活可以下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑和上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶、cyclin D1、CDK2、CDK2、CDK6，參與AM 的發(fā)生過程[27]。HIF-1 在AM 組織中也存在高表達(dá)，被認(rèn)為從血管生成、細(xì)胞侵襲等方面參與了AM的發(fā)生發(fā)展過程[28-30]，但具體機(jī)制研究較少。 AM 與子宮內(nèi)膜異位癥在發(fā)病過程、癥狀、治療均有相似之處。 在子宮內(nèi)膜異位癥中，HIF-1α可上調(diào)異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor beta-1 proprotein, TGF-β1）的分泌，激活TGF-β1/母體抗生物皮膚生長因子同源物（transforming growth factor beta-1 proprotein/mothers against decapentaplegic homolog, TGF-β1/Smad）信號通路，從而促進(jìn)整合蛋白表達(dá)，增強(qiáng)異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的黏附能力[31]。 此外，HIF-1α 表達(dá)激活了β-連環(huán)蛋白/T 細(xì)胞因子（β-catenin/T-cell factor）信號通路，誘導(dǎo)VEGFR 和MMP-9 的表達(dá)[32]，HIF-1α可以通過誘導(dǎo)自噬從而觸發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）[33-34]， 促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的遷移和侵襲能力。 以上機(jī)制也可能促進(jìn)AM 的發(fā)生。

綜上分析，芍藥甘草湯可能通過干預(yù)MMP-9、MMP-2、VEGF、EGFR、CCND1、局部黏著斑激酶、HIF-1 等多個靶點(diǎn)的表達(dá)，及調(diào)控以上靶點(diǎn)與PI3K/Akt/mTOR、HIF-1、MAPK 等多個信號通路的相互作用，從而抑制AM 細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成從而發(fā)揮治療效果。

此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果提示，芍藥甘草湯可能通過調(diào)控類固醇激素和抗炎鎮(zhèn)痛等機(jī)制治療AM。 課題組前期研究證明，AM 組織中雌激素及受體表達(dá)水平升高，且通過雌激素激活及剝奪狀態(tài)證實(shí)雌激素及其受體可促進(jìn)AM 病灶細(xì)胞增殖[35]。 后續(xù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，以芍藥、甘草為主的中藥復(fù)方及其含藥血清均能明顯降低細(xì)胞雌激素受體水平，并通過干預(yù)雌激素受體與miR-21 介導(dǎo)的Ras/Raf 通路形成的信號交通網(wǎng)，對AM 痛經(jīng)患者起治療作用[36-37]。

5 結(jié)語

本研究證實(shí)了芍藥甘草湯含藥血清通過抑制間質(zhì)細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮治療作用，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析芍藥甘草湯治療AM 的主要活血成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及可能涉及的分子機(jī)制，體現(xiàn)了AM 發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性以及中藥復(fù)方芍藥甘草湯“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”的藥物特點(diǎn)，課題組下一步將對主要調(diào)控的靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并通過其進(jìn)行靶向調(diào)控等實(shí)驗(yàn)，并探索具體的分子機(jī)制。