基于網絡藥理學和實驗驗證探討近視復明丸治療近視的作用機制

黃 云，陳 姝，夏如梅，李 蕾，喻干龍，喻 娟*

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫藥大學第一中醫臨床學院，湖南 長沙 410007

近視是一種全球普遍存在的視覺疾病，主要表現為遠距離視物不清，近距離視物良好，并逐漸出現飛蚊癥、閃光感等癥狀，后期近視進展為高度近視或者病理性近視，則容易合并多種眼部疾病，例如白內障、青光眼、黃斑變性和視網膜脫離等，這些均可造成視力的嚴重喪失[1]。 近視已成為我國及全世界的嚴重公共衛生問題，預計2050 年，全球近視患病人數將會達到47 億[2]。研究發現，2020 年，我國兒童青少年近視率為52.7%，其中，小學生35.6%、初中生71.1%、高中生達80.5%[3]。近視高發病率嚴重影響青少年的視覺健康。 目前，臨床上對近視的治療以框架眼鏡、角膜塑形鏡或低濃度阿托品滴眼液為主，同時也有耳穴貼壓及針刺等治療[4]，但各類方法療效并不明確，且均有一定局限性。

中醫藥防控近視具有獨特優勢[5]。 近視在中醫古籍中被稱為“目不能視”“能近怯遠癥”[6]。 《諸病源候論·目病諸候》[7]中認為，本病為“勞傷肝腑，肝氣不足，兼受風邪，使精華之氣衰弱，故不能遠視”。 近視復明丸由芍藥、柴胡、木瓜、丹參、當歸、人參、巴戟天、石菖蒲、黃芪組成，近視復明丸作為院內制劑，是喻干龍教授根據青少年近視防治的長期臨床經驗組方而成。 肝氣郁結而致血循不暢，肝郁則脾失健運，氣血生化無源，氣血無以上乘，目系則失其濡養。 柴胡疏肝理氣開郁；芍藥、木瓜味酸以斂肝；人參、黃芪健脾胃以補中氣；石菖蒲豁痰開竅；丹參、當歸補血活血；巴戟天溫腎以升舉陽氣，濡養目竅。 近視復明丸在湖南中醫藥大學第一附屬醫院應用于近視治療已有20 余年，臨床療效較好，但其中藥復方的作用機制及靶點仍不明確。 本研究以近視復明丸治療近視的有效成分和靶點為切入點，研究其作用機制，為近視復明丸的臨床應用提供進一步的理論支持。

1 方法

1.1 近視復明丸活性成分及靶點的獲取

本研究采用TCMSP 數據庫及TCMID 數據庫收集近視復明丸中芍藥、柴胡、木瓜、丹參、當歸、人參、巴戟天、石菖蒲、黃芪的化學成分，并設置口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%，類藥性（druglikeness, DL）≥0.18，對其活性成分進行鑒定，最終將數據導入藥物靶點預測系統SwissTargetPrediction，進行靶點預測。

1.2 近視相關靶點的獲取與篩選

以“myopia”為檢索詞，在GeneCards、DrugBank、OMIM 和Therapeutic Target Database 數據庫進行檢索與篩選，最終得到近視的相關靶點。

1.3 “藥物-疾病”網絡模型的構建與分析

將近視復明丸藥物成分靶點與近視相關靶點導入Venny 2.1.0 數據庫，所得交集靶點，即為近視復明丸治療近視的潛在作用靶點。

1.4 “成分-靶點”網絡的構建與分析

將近視復明丸藥物成分靶點與近視靶點的交集靶點，共同導入Cytoscape 3.9.1 軟件，構建“成分-靶點”可視化網絡圖，同時分析網絡拓撲屬性，度值表示成分所涉及的靶點個數，度值越大，說明該成分對疾病治療作用越大。 本研究利用網絡模型下活性成分的度值，對近視復明丸治療近視的主要活性成分進行分析。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction, PPI）網絡構建

將近視復明丸與近視的交集靶點導入STRING平臺，構建PPI 網絡圖。 將篩選的結果通過Cytoscape 3.9.1 軟件進行拓撲學分析，篩選近視復明丸治療近視的關鍵節點。

1.6 近視復明丸治療近視相關靶點的GO 和KEGG富集分析

將近視復明丸與近視的共同靶點導入DAVID 6.8 數據庫，進行可視化分析。

2 動物實驗驗證

2.1 實驗動物

選取約3 周齡雄性普通級健康豚鼠48 只，體質量160～200 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，實驗動物質量許可證：SCXK（湘）2019-0015；實驗動物在實驗前均通過裂隙燈排除眼瞼異常、眼底等病變。 飼養條件：室溫保持在25 ℃左右，空氣濕度保持在45%～50%，晝夜交替飼養（12 h 交替光照），自由飲食，每日進食新鮮蔬菜以補充體內維生素C，適應性飼養1 周后開始實驗。 實驗由湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會審核批準（倫理編號：ZYFY20220813-09）。

刀手、劍士全聚集在練功廳，武成龍在上首道：“大伙集中于此是由于黑旗會闖進本莊之前三少吩咐我告訴大伙：本莊不幸成為江湖鐵血組合，組合應有組合的鐵律，三少會在不同時期有不同要求。雖然無法確定要求證確，但即使有誤也要無條件遵守。因為三少為家園而戰，由于家園危如懸卵，任何人違背三少意志三少都不會輕饒。也在那時我知道琴臺之戰是三少制造的第一懸案，也驀然悟及鐵衛中有一些熟悉的面孔是由于我們數年天涯亡命，那些鐵衛又放下了昔日的名聲。”

2.2 主要儀器與試劑

研磨儀（型號：KZ-II，武漢塞維爾生物科技有限公司）；冷凍離心機（型號：neofuge 15R，力新儀器上海有限公司）；電泳儀（型號：DYY-6D，北京六一生物科技有限公司）；熒光定量PCR 儀（型號：ABI QuantStudio 1，美國Thermo 公司）；逆轉錄儀（型號：SCI1000-G，美國SCILOGE 公司）；曝光儀（型號：HB-980，美國Protein simple 公司）；純水儀（型號：AJC-0501-P，重慶艾科浦有限公司）。 Trizol（批號：R1100，北京索萊寶科技有限公司）。 近視復明丸（生產批號：20220817，湖南中醫藥大學第一附屬醫院）。復方托吡卡胺滴眼液[生產批號：MP2262，參天制藥（中國）有限公司]。

2.3 分組、造模及給藥

隨機將豚鼠分為空白組、近視模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，共4 組，每組12 只。 近視模型組、中藥高劑量組和中藥低劑量組豚鼠用半球形塑料眼罩遮蓋右眼4 周，誘導形覺剝奪性近視動物模型[8-9]，左眼不做處理；空白組不做任何處理。 4 周后經檢影驗光確認造模成功[10]。 繼續保持造模狀態4周。 根據“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值”折算等效劑量[11]。 予近視模型組2 mL 生理鹽水灌胃；中藥高劑量組予2 mL 近視復明丸藥粉（給藥濃度為0.8 g/mL）灌胃；中藥低劑量組予2 mL 近視復明丸藥粉（給藥濃度為0.2 g/mL）灌胃。 空白組予2 mL 生理鹽水灌胃。 每日1 次，連續灌胃4 周。

2.4 屈光度測量

在實驗造模前和造模4 周后測量所有豚鼠屈光度，將豚鼠置于暗室，使用復方托吡卡胺滴眼液滴入豚鼠右眼結膜囊中，每5 min 滴1 次，充分散大瞳孔，驗光師在30 min 后進行帶狀光檢影鏡檢影驗光檢測屈光度。

2.5 鞏膜組織病理學形態觀察

每組取3 只豚鼠，經處死拆除眼球后，選取鞏膜組織固定在多聚甲醛溶液中，常規脫水、石蠟包埋，選取靠近視盤部切片，染色，顯微鏡下觀察各組鞏膜厚度及各層間結構。

2.6 實時熒光定量PCR

每組各取3 只豚鼠，取右眼眼球，分離鞏膜組織，采用Trizol 法提取鞏膜組織總RNA，參考試劑盒說明書進行操作，逆轉錄合成cDNA，引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成。 MMP-2 上游引物：5'-ACACACCTGATCTGGACCCT-3'；下游引物：5'-ACACAGATGTGCAGCGAAGA-3'；產物大小為93 bp。 TIMP-2 上游引物：5'-ACACAGATGTGCAGCGAAGA-3'；下游引物：5'-AACTACGAGGGCAACTGAGC-3'；產物大小162 bp。 調整反應程序，執行擴增，先在94 ℃預變性2 min，94 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，共循環45 次。最后以β-actin 作為內參，用2-△△Ct方法進行分析。

2.7 統計學分析

統計學分析采用GraphPad Prism 8 軟件，計量資料采用“±s”表示，組間比較用Tukey 的多重比較檢驗分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 近視復明丸活性成分與靶點

經TCMSP 和TCMID 數據庫檢索，共收集到587個OB≥30%且DL≥0.18 的有效活性成分，其中芍藥123 種、柴胡74 種、木瓜123 種、丹參52 種、當歸35 種、人參51 種、巴戟天26 種、石菖蒲42 種、黃芪61 種。 采用SwissTargetPrediction，將上述數據進行靶點預測，經合并，篩除重復值后共得到近視復明丸作用靶點176 個。

3.2 近視相關作用靶點

利用GeneCards 數據庫、Therapeutic Target Database 數據庫、DrugBank 數據庫和OMIM 數據庫，以“myopia”為檢索詞，分別檢索到4 888、2、270、26個與近視相關的靶點，移除重復值后得到4 217 個近視相關作用靶點。

3.3 “成分-靶點”網絡的構建與分析

圖1 近視復明丸與近視共同靶點

圖2 中藥-有效成分-靶點網絡

3.4 PPI 網絡的構建及核心靶點的篩選

通過STRING 平臺與Cytoscape 3.9.1 軟件生成PPI 網絡，圖中共有122 個節點，1 996 條邊。節點的顏色和面積越深、越大，其節點度值越大。 結果顯示，絲氨酸-蘇氨酸激酶（serine-threonine kinase 1, AKT1）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGFA）、白細胞介素-1β（interlukin-1β, IL-1β）、基質金屬蛋白酶抑制劑-9（matrix metallo proteinase-9, MMP-9）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）等的度值排名靠前，推斷這些靶點是近視復明丸治療近視的核心靶點。 詳見圖3。

圖3 近視復明丸與近視PPI 網絡

3.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析

通過對DAVID 數據庫GO 功能分析，共得到631條目，其中472 條生物過程（biological process, BP）、57 個細胞組成（cell composition, CC）、102 個分子功能（molecular function, MF），選取前10 項進行可視化，并使用在線作圖工具繪制出GO 富集分析條形圖。 詳見圖4。 其中，BP 主要包括蛋白質結合、相同的蛋白質結合、酶結合、轉錄因子活性等；CC 主要包括細胞核、細胞質、核漿、細胞膜的組成部分、細胞外空間等；MF 主要包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、正調控轉錄、DNA 的正向調控等。 通過KEGG 富集通路分析，共獲得151 條細胞信號通路，通路主要涉及磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）信號通路信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）信號通路、白細胞介素-17（interleukin-17, IL-17）信號通路等。 選擇前20 條通路作為近視復明丸治療近視的重要途徑進行分析。 詳見圖5。

圖4 關鍵靶點的GO 分析

圖5 核心靶點的KEGG 富集分析

3.6 各種豚鼠造模前后屈光度比較

造模前，各組豚鼠屈光度差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。 造模4 周后，與空白組比較，近視模型組、中藥高劑量組和中藥低劑量組屈光度降低，差異有統計學意義（P＜0.01），結果提示造模成功。 詳見表1。

表1 造模前后各組豚鼠屈光度比較（±s，n=12，D）

表1 造模前后各組豚鼠屈光度比較（±s，n=12，D）

注：與空白組比較，##P＜0.01。

組別空白組近視模型組中藥高劑量組中藥低劑量組造模前2.90±0.31 2.83±0.40 2.98±0.27 3.13±0.25造模后1.21±0.23-1.27±0.31##-1.15±0.29##-1.10±0.27##

3.7 近視復明丸對各組鞏膜厚度的影響

空白組豚鼠的鞏膜組織形態完整，膠原纖維結構緊密，細胞排列整齊，分布規則；近視模型組鞏膜厚度較空白組變薄，且膠原纖維結構疏松，排列紊亂；中藥高劑量組與中藥低劑量組鞏膜厚度較模型組均增加；中藥高劑量組膠原纖維排列較模型組稍緊密，各層結構較中藥低劑量組清晰。 與空白組比較，近視模型組顯著變薄（P＜0.01）；與近視模型組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組厚度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。 詳見表2，圖6。

表2 各組豚鼠鞏膜厚度比較（±s，n=3）

表2 各組豚鼠鞏膜厚度比較（±s，n=3）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與近視模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別空白組近視模型組中藥高劑量組中藥低劑量組鞏膜厚度/μm 346.23±5.38 319.33±7.32##341.10±3.04**336.00±1.55*

圖6 各組豚鼠鞏膜組織HE 染色圖（×200）

3.8 近視復明丸對鞏膜組織中MMP-2 及基質金屬蛋白酶抑制劑-2（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2, TIMP-2）mRNA 表達的影響

與空白組比較，近視模型組豚鼠鞏膜組織中MMP-2 mRNA 表達水平顯著增加（P＜0.01）、TIMP-2 mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與近視模型組相比較，中藥高劑量組中豚鼠鞏膜組織MMP-2 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01）、TIMP-2 mRNA 表達水平明顯增加（P＜0.05）；與中藥高劑量組相比較，中藥低劑量組鞏膜組織中MMP-2 mRNA表達水平明顯降低（P＜0.01）。 詳見表3。

表3 近視復明丸對鞏膜組織中MMP-2 及TIMP-2 mRNA表達的影響（±s，n=3）

表3 近視復明丸對鞏膜組織中MMP-2 及TIMP-2 mRNA表達的影響（±s，n=3）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與近視模型組比較，*P＜0.05；**P＜0.01；與中藥高劑量組比較，&&P＜0.01。

組別空白組近視模型組中藥高劑量組中藥低劑量組MMP-2 1.000±0.089 1.337±0.061##0.763±0.026**0.057±0.005**&&TIMP-2 1.000±0.09 0.272±0.018##0.709±0.037*0.142±0.003

4 討論

從藥物-疾病交集靶點可知，近視復明丸可作用于AKT1、VEGFA、IL-1β、MMP-9、EGFR、MMP-2 等多個靶點，從而起到治療近視作用。 在近視復明丸治療近視過程中，發揮關鍵作用的途徑主要包括PI3K/Akt信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路等。

Akt 可調節多種生物過程，它在調節細胞生存、增殖和凋亡中發揮重要作用[12]。 其中的亞型AKT1，在調節胚胎發育，生長及存活上有著獨特的優勢作用[13]。HUANG 等[14]研究發現，AKT1 通過在小膠質細胞和巨噬細胞發生的極化作用，影響視神經病變的病程變化。表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）是作用在機體內外各種組織細胞上的生長因子， 可通過促進鞏膜成纖維細胞的增殖，進而影響鞏膜的重塑[15]。 而EGFR 可參與調節鞏膜成纖維細胞的增殖和分化[16]。 EGR 與EGFR 結合，對體內外的組織生長與增殖起著明顯的調節作用[17]。

基因金屬蛋白酶是一類能夠降解細胞外基質（extracellular matrix, ECM）并參與鞏膜重塑的內肽酶[18-19]，其家族成員MMP-2 與鞏膜ECM 重塑關系最為密切[20]。在近視的發展過程中，鞏膜重塑在其中起到關鍵調控作用，而鞏膜重塑的關鍵在于MMP-2及其抑制物TIMP-2 之間的動態平衡[21]。 LIU 等[22]研究發現，在形覺剝奪誘導近視樹鼩中發現MMP-2 表達水平增高，而TIMP-2 表達水平降低。 QIAN 等[23]研究發現，在近視豚鼠鞏膜中，吡侖西平降低了MMP-2 的表達，增加了組織抑制物TIMP-2 的表達，這提示MMP-2 與TIMP-2 的動態平衡在近視中發揮著重要作用。

PI3K/Akt 信號通路對多種眼病有著重要的調節作用[24]，該通路有多種下游信號通路，包括糖原合成酶激酶3 和凋亡信號調控激酶1 等[25]，PI3K 通過催化方式生成產物，進而激活絲裂原活化蛋白激酶等蛋白，進而參與多種近視相關的生物過程，其中包括鞏膜重塑[26]。研究顯示，玻璃體內miR-200a 紊亂，原因是PI3K/Akt 信號通路影響眼軸長度的發展[27]。這也進一步說明，PI3K/Akt 信號通路可以抑制近視的進展。

本研究在網絡藥理學的基礎上進行實驗驗證。結果顯示，與近視模型組比較，近視復明丸使MMP-2 mRNA 表達水平下降，TIMP-2 mRNA 表達水平增加，促進鞏膜膠原纖維的合成，減少鞏膜膠原纖維的降解，進而調控鞏膜重塑，延緩近視進展。 本研究為近視復明丸的臨床應用提供了科學依據，同時為后續近視復明丸的相關研究提供了新線索與新思路。此外，對于其他相關靶點和信號通路，未來還需進一步深入研究及實驗驗證。