推拿法介導機械敏感性離子通道Piezo1 對骨骼肌損傷模型大鼠細胞凋亡的影響

黃 博，阮 磊，王蘭蘭，薛惠天，孫夢龍，段苗苗，彭 亮*

1.湖南中醫藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

骨骼肌損傷是骨骼肌纖維受到外力擊打或長期耐力牽拉引起損傷的一類創傷性疾病， 是人們日常鍛煉或運動員專業訓練中常見的損傷。 在運動所受的損傷類型中，最主要的是骨骼肌損傷，占所有損傷的40.9%[1]。機械門控離子通道Piezo1 可將細胞膜接收到的機械力學信號轉換為電信號或化學信號，傳遞至胞內引起一系列生化反應。 國外研究報道，肌肉損傷可由細胞凋亡誘導[2]。而Piezo1 可能參與骨骼肌損傷時細胞凋亡的過程，在損傷后，Piezo1表達下降會導致更多的骨骼肌細胞凋亡[3]。 由于Piezo1 可直接感受到膜張力的變化而進行門控，因此，任何改變膜張力的生理作用力理論上都可激活Piezo1 通道[4]。

推拿是中醫傳統治療手法，有其獨特的生物力學特征[5]，同樣屬于細胞外力學機械刺激，在骨骼肌肉疾病中進行推拿治療可以緩解疼痛并改善功能[6]，其中，法是臨床上治療骨骼肌損傷的常用手法。本課題組前期研究表明，推拿法可促進骨骼肌損傷后的修復進程，減少炎癥反應，抑制組織纖維化，加快功能恢復[7-8]。 本實驗在前期研究基礎上，復制虎蛇毒素（notexin, NTX）誘導的大鼠骨骼肌損傷模型，觀察作為細胞外力學機械刺激的推拿手法——法對大鼠骨骼肌損傷后運動功能、組織形態學、Piezo1、B 淋巴細胞瘤-2 （B-lymphoma-2, Bcl-2）、B淋巴細胞瘤2 相關X 蛋白質（B-lymphoma-2 related X protein, Bax）、胱天蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3, Caspase-3）的影響，探討推拿法治療骨骼肌損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF 級雄性SD 大鼠32 只，體質量220～250 g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。 每籠4 只，飼養于溫度20～25 ℃，濕度50%～70%的環境中，所有大鼠均按標準飲食喂養，并保持12 h 光照/12 h 黑暗周期。 本研究已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查和批準（審批號：LLBH-202106070002)。

1.2 主要試劑與儀器

NTX（法國Latoxan 公司，批號：L8104-100UG）；戊巴比妥鈉（德國Merck KGaA 公司，批號：P3761）；4%多聚甲醛（安徽白鯊生物有限公司，批號：BL539A）；蘇木素染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：G1005）；TUNEL 試劑盒（瑞士Roche 公司，批號：11684817910）；DAPI 染液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C1002）；Bax 抗體（美國AAB 公司，批號：A23917）；Caspase-3 抗體（批號：AD6311）、Bcl-2 抗體（批號：DF14173）、Piezo1 抗體（批號：DF12083）均購自美國Affinity 公司；β-actin 抗體（批號：MD6553）、HRP 山羊抗兔二抗（批號：MD912565）、HRP 山羊抗小鼠二抗（批號：MD912566）均購自英國MDL 公司；PVDF 膜（美國Millipore 公司，批號：ISEQ00010）。

1.3 分組及造模

32 只SD 大鼠適應性飼養1 周后，按照隨機數字表法分成正常組、模型組、法組、法+抑制劑組，每組8 只。 除正常組外，其余各組建立SD 大鼠腓腸肌損傷模型[9]。 具體操作如下：在大鼠的右側下肢腓腸肌部位進行剃毛處理，用馬克筆畫圈標記。 以1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，保證每只大鼠注射部位一致。 在大鼠的右側下肢腓腸肌以10 μg/mL 肌內注射200 μL NTX，造成肌內損傷，肌內注射NTX 時緩慢推進液體，并在注射完畢后停留3 s 再拔出針頭，以保證每只大鼠腓腸肌充分吸收藥物。 肌內注射24 h 后觀察平衡木測試結果，大鼠行走時間延長、滑爪次數增加，表明造模成功[10-11]。正常組大鼠在同樣位置注射200 μL 生理鹽水。

1.4 干預方法

1.5 觀察指標及方法

最后一次干預結束后，禁食不禁水24 h，采用平衡木測試進行行為學評估以觀察大鼠運動功能。行為學測試結束后，腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉處死各組大鼠，立即手術切取腓腸肌標記部位組織，平均分成兩份：一份浸潤于4%多聚甲醛中用于HE染色和TUNEL 染色；另一份組織放入-80 ℃冰箱凍存，待測相關蛋白表達水平。

1.5.1 行為學測試 干預前以及最后一次干預結束后，對4 組大鼠進行平衡木測試[11]。平衡木測試主要評估大鼠骨骼肌損傷后的運動協調性。 將木梁（2 cm×120 cm）提升到離地面120 cm 的高度，記錄大鼠穿過木梁后到達暗箱所需的時間以及爪子滑動的次數。在測試前1 天進行3 次適應性試驗，目的是讓大鼠熟悉木梁和暗箱。每次試驗后用75%乙醇清洗木梁和暗箱。

1.5.2 組織學觀察 將浸潤于4%多聚甲醛中的腓腸肌組織塊進行石蠟包埋，制成5 μm 厚切片，先后進行蘇木素染色和伊紅染色，脫水封片，光鏡下觀察腓腸肌組織的病理變化。

1.5.3 TUNEL 染色 取4%多聚甲醛固定的腓腸肌組織，橫切為5 μm 厚度的切片，石蠟包埋。 嚴格按照TUNEL 試劑盒說明書進行細胞凋亡檢測。 染色結束后用抗熒光淬滅封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。每個切片取5 個不同視野區域，并利用Image J 軟件記錄陽性（綠色）細胞數及細胞總數，計算細胞凋亡率，計算公式：細胞凋亡率=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.5.4 Western blot 檢測SD 大鼠腓腸肌組織中Piezo1、Bax、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表達 組織加液氮進行勻漿后， 加入裂解液，4 ℃，12 000 r/min 離心15 min（離心半徑7 cm），收集上清液；BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度；配制SDS-PAGE 凝膠，樣品輕輕加至凝膠孔中，調制電泳儀（電壓約8 V/cm）使樣品通過凝膠；電泳結束后，將分離到的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至PVDF 膜，65 V 轉膜2 h；室溫、搖床封閉1 h；一抗[Piezo1 抗體、Bax 抗體、Bcl-2 抗體、Caspase-3抗體、β-actin 抗體（稀釋比例均為1∶1 000）]4 ℃反應過夜；二抗用TBST 稀釋300倍，室溫、避光緩慢搖動1 h；按1∶1 混合ECL 試劑盒中兩種液體，均勻鋪在PDVF 膜表面，放入化學發光成像系統獲取目的蛋白條帶。

1.6 統計學方法

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學處理。 計量資料均符合正態分布時用“±s”表示，組間比較用單因素方差分析，方差齊時用LSD 檢驗，方差不齊時選擇Tamhane T2 法；不符合正態分布時選擇秩和檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠平衡木測試結果比較

圖1 各組大鼠平衡木時間及滑爪次數結果比較（n=8）

2.2 各組大鼠腓腸肌組織顯微結構觀察結果

正常組大鼠肌細胞大小均勻，排列緊密，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠大量肌細胞破裂、壞死、大小不一，排列稀疏、無規律，周圍有大量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤；法組大鼠肌細胞病理情況好轉，有少量細胞破裂、萎縮、壞死，細胞間隔縮小，輕度局灶性炎性細胞浸潤；法+抑制劑組大鼠有較多肌細胞萎縮、壞死、大小不一，排列間隔較大，周圍有中性粒細胞和淋巴細胞浸潤。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠腓腸肌組織HE 染色結果（×400）

2.3 各組大鼠腓腸肌組織細胞凋亡率比較

表1 各組大鼠腓腸肌組織細胞凋亡率比較（±s，n=8）

表1 各組大鼠腓腸肌組織細胞凋亡率比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與法組比較，△△P<0.01。

分組正常組模型組images/BZ_117_410_2555_441_2588.png法組images/BZ_117_351_2614_382_2647.png法+抑制劑組細胞凋亡率/%2.31±1.74 43.41±25.02**10.18±9.37##39.06±19.62**△△

圖3 各組大鼠腓腸肌組織TUNEL 染色（×400）

2.4 各組大鼠Piezo1、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達水平比較

表2 各組大鼠腓腸肌組織中Piezo1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達水平比較（±s，n=8）

表2 各組大鼠腓腸肌組織中Piezo1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達水平比較（±s，n=8）

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與法組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

分組正常組模型組images/BZ_117_1256_2288_1285_2322.png法組images/BZ_117_1256_2347_1285_2381.png法+抑制劑組Piezo1 0.43±0.06 0.30±0.08**0.40±0.05##0.33±0.06**△Bax 0.24±0.06 0.35±0.07**0.28±0.06#0.32±0.06*Bcl-2 0.34±0.06 0.22±0.07**0.31±0.06##0.26±0.05**Caspase-3 0.30±0.04 0.43±0.05**0.34±0.04##0.40±0.04**△△

圖4 各組大鼠腓腸肌組織中Piezo1、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白電泳圖

3 討論

骨骼肌損傷時會經歷退化、炎癥、再生和纖維化的連續過程[12]，過度的炎癥反應和細胞凋亡不利于骨骼肌的修復和再生[13-14]，因此，抗炎與抗凋亡治療對骨骼肌再生和促進損傷后的愈合非常重要。 推拿法是中醫推拿在臨床上使用極為廣泛的手法之一，可產生行氣活血、舒筋活絡、緩解痙攣的功效，對骨骼肌損傷療效顯著[15]。 本課題組在前期研究中發現，推拿法可改善骨骼肌損傷后的炎癥及纖維化情況，促進骨骼肌的修復[7-8]。Piezo1 在肌細胞和肌衛星細胞中均有表達[16]，Piezo1 的激活既可促進肌衛星細胞的分化[17]，也參與調控骨骼肌組織中的細胞凋亡過程。 有研究表明，在缺失Piezo1 的小鼠中，骨骼肌組織中促凋亡因子Bax 和Caspase-3 表達顯著上調，細胞凋亡數量明顯增加[18]。 基于此，本研究進一步觀察Piezo1 對推拿法干預后骨骼肌損傷細胞凋亡的影響，以豐富前期研究內容。

NTX 作為一種肌肉毒素，注射入骨骼肌后可導致肌纖維的損害而不影響神經和血管，避免如擠壓、撕裂中常見的缺血與纖維化的競爭性并發癥，另外還可使損傷程度及范圍保持一致性[19]，因而廣泛應用于骨骼肌損傷模型中[9]。 平衡木測試可評價大鼠運動狀態與平衡能力，因此，可用于測試骨骼肌自身損傷后的運動功能變化，以此評估骨骼肌損傷程度[11]。在本實驗中，平衡木測試結果顯示，相比正常組，模型組大鼠行走時間明顯延長、 滑爪次數顯著增多，HE 染色顯示，模型組大鼠肌細胞萎縮、破裂、壞死、大小不一，排列稀疏、無規律，周圍有大量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，這些提示模型組大鼠腓腸肌炎癥顯著，運動功能下降，損傷明顯。 在推拿法干預后，腓腸肌損傷大鼠的平衡木行走時間縮短、滑爪次數減少，HE 染色顯示，大鼠肌細胞病理情況相比模型組明顯好轉，僅有少量細胞破裂、萎縮、壞死，細胞間隔縮小，炎性細胞數量明顯減少，表明推拿法可減輕骨骼肌損傷，使運動功能得以改善。

Piezo1 作為一種大型跨膜蛋白，可接受力學機械刺激，進而激活細胞內信號通路的傳導[20]。有研究發現，Piezo1 可促進肌衛星細胞分化[17]和成肌細胞融合[21]，是骨骼肌再生和修復的關鍵調節因子。在任何可以改變膜張力的作用下，理論上都能激活Piezo1 通道，如剪切力、機械拉伸等[4]，而GsMTx4 是目前唯一已知的Piezo1 特異性抑制劑。 本實驗結果發現，法+抑制劑組的行走時間和滑爪次數顯著高于法組，并且從組織病理學形態結構上觀察發現，法+抑制劑組的肌細胞仍有較多中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，萎縮、壞死的肌細胞占據大半。 由此可以推測，在抑制Piezo1 后，法對損傷骨骼肌的療效有所降低，Piezo1 可能參與推拿法修復骨骼肌損傷過程。

在骨骼肌損傷重構過程中，細胞凋亡也發揮著重要作用。 如Caspases 的激活可參與肌源性分化的初始重塑階段，并防止過度的細胞分解和隨后的細胞死亡；Bcl-2 蛋白家族可通過調控線粒體凋亡信號的起始步驟，影響調節肌肉再生[22]。 Bcl-2 家族調控線粒體膜通透性，影響內源性凋亡途徑，家族中Bax可促進線粒體內細胞色素C 的釋放，在細胞質內與Caspase-9 形成復合物，激活與外源性通路共同介導的Caspase-3，進而促進細胞凋亡。 Bcl-2 家族中的Bcl-2 則可通過抑制Bax 而起到抗凋亡作用[23]。BARTOLI 等[18]發現，Piezo1 的缺失可上調Bax 和Caspase-3，促進骨骼肌組織中的細胞凋亡。本實驗結果顯示，模型組的肌細胞凋亡率明顯高于正常組，且與正常組相比，模型組的Bax、Caspase-3 表達水平顯著升高，Bcl-2 表達水平顯著下降；而法治療可減少腓腸肌細胞凋亡數量，升高Bcl-2 表達，降低Bax、Caspase-3 的表達，提示法對骨骼肌損傷后細胞凋亡起到抑制作用；相比法組，法+抑制劑組中細胞凋亡數量明顯增加，Caspase-3 的表達顯著上升，Bax 和Bcl-2 的表達水平與法組比較，雖無統計學差異，但同樣有升高和下降的趨勢。故本課題組推斷，可能是樣本量不足導致的差異無統計學意義，也可能是由于有多種共同介導Caspase-3 表達的細胞凋亡途徑，除了Bcl-2 和Bax 介導的線粒體凋亡途徑之外，外源性途徑同樣可影響終末Caspase-3來決定細胞是否凋亡。