淺談非洲豬瘟病毒研究進(jìn)展及防控措施

陸田甜 陳華云 余群蓮

(重慶農(nóng)投肉食品有限公司，重慶 401120）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起豬的急性、發(fā)熱、高度傳染性疾病，致死率可達(dá)100%，被世界衛(wèi)生組織列為法定報告動物疫病，是我國的一類動物疫病。由于ASFV 結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，編碼蛋白質(zhì)的多樣性，以及目前對ASFV 與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的了解不足，阻礙了疫苗的開發(fā)。通過構(gòu)建完善的生物安全防控體系，做好防控措施是我國目前應(yīng)對ASF 的主要手段。本文綜述了非洲豬瘟病毒的研究進(jìn)展，并對非洲豬瘟防控措施提出一些見解，以期為進(jìn)一步做好非洲豬瘟防控工作提供借鑒。

1 ASFV 的概述

1.1 病原學(xué)

ASFV 是一種大型雙鏈DNA 病毒，總直徑為175～215 nm，其基因組大小為170～190 kbp，根據(jù)病毒株的不同，包含151～167 個開放閱讀框（ORF）[1]。基因組末端顯示反向重復(fù)，并由發(fā)夾環(huán)閉合。基因組編碼許多蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)參與病毒組裝、DNA 復(fù)制和修復(fù)[2]。此外，還對參與免疫調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了編碼，例如抑制Ⅰ型干擾素和干擾細(xì)胞死亡途徑[3]。

ASFV 粒子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，呈二十面體對稱，其類核包含雙鏈DNA 基因組[1]。類核被核殼和內(nèi)外衣殼包圍，每個衣殼被一層脂膜（內(nèi)膜和外膜）包裹[4]，然而，這種包膜的重要性尚不清楚，因為它不是感染所必需的[5]。

1.2 流行病學(xué)

ASFV 于1921年在非洲肯尼亞首次被發(fā)現(xiàn)，至今已有100 多年的歷史[2]，我國于2018年在遼寧省沈陽市沈北新區(qū)發(fā)現(xiàn)首例非洲豬瘟[6]。非洲豬瘟在我國東北地區(qū)發(fā)生后，隨即在河南、江蘇、安徽和浙江等省份點狀散發(fā)，其傳播具有方向性，疫情分布也具有明顯的方向性，總體呈東北向東部、南部方向傳播，西南向西北方向傳播[7]。

ASFV 的寄主范圍非常窄，唯一的脊椎動物宿主是豬，而節(jié)肢動物媒介是鳥形綱軟體動物[8]。ASF 沒有人畜共患病的潛力，也沒有跡象表明這種情況可能會改變[9]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國主要的感染源包括感染的家豬和野豬，以及受污染的飼料、人員、車輛和豬肉。目前尚不清楚康復(fù)豬可以攜帶病毒的時長及多久可以排出病毒。據(jù)報道，康復(fù)豬在ASFV 感染后6 個月仍可排出ASFV 并感染易感豬[10]。

1.3 臨床癥狀

非洲豬瘟的臨床癥狀差異較大，主要取決于毒株的毒力及動物的年齡和免疫狀況，ASFV 有強毒力、中等毒力和低毒力3 種類型毒株。其中，強毒力毒株可引起急性或亞急性疾病，致死率高達(dá)100%，包括高熱、呼吸和胃腸道癥狀、發(fā)紺、共濟(jì)失調(diào)等非特異性臨床癥狀，懷孕母豬可因嚴(yán)重的疾病和高燒而流產(chǎn)。中等毒力菌株導(dǎo)致的臨床癥狀表現(xiàn)為高燒、厭食、疲勞和非特異性呼吸道和胃腸道癥狀，這種情況下的死亡率為30%～70%。低毒力菌株感染豬只后，無特異性臨床癥狀，死亡率低，病豬可在7～10 d 后形成抗體，但這些抗體不能完全中和病毒，其預(yù)后效果也尚未可知[8]。

2 非洲豬瘟病毒的研究進(jìn)展

2.1 診斷方法

由于非洲豬瘟臨床癥狀與豬瘟極其相似，只能通過實驗室檢測進(jìn)行鑒別診斷。常用的檢測技術(shù)包括分子生物學(xué)檢測技術(shù)、血清學(xué)檢測技術(shù)及病原學(xué)檢測技術(shù)。分子生物學(xué)檢測技術(shù)包括普通PCR 技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、數(shù)字PCR 技術(shù)、等溫擴增技術(shù)等；血清學(xué)檢測技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、交叉免疫試驗法等；病原學(xué)檢測技術(shù)包括血細(xì)胞吸附試驗（HAD）、直接免疫熒光檢測非洲豬瘟抗原（FAT）。

目前，規(guī)模化豬場實驗室常用的2 種診斷技術(shù)為實時熒光定量（qPCR）及ELISA。qPCR 檢測技術(shù)具有操作簡便、快捷、靈敏度高及特異性強的特點，且能有效解決常規(guī)PCR 污染問題，目前常用于qPCR 檢測的基因有B646L、CP204L、E183L、CP530R、B602L[11]。Trinh 等[12]開發(fā)了一種靶向ASFV p54 基因的qPCR 檢測方法，具有較高的特異性和靈敏度，可用于單獨檢測血液、血清、脾臟和腎臟中的ASFV，也可作為輔助檢測工具。ELISA 檢測技術(shù)具有快速、靈敏、成本低、特異性和準(zhǔn)確性高的特點，適用于大規(guī)模樣本檢測，國內(nèi)外常用p30/p32、p54、p72、p73 等作為檢測ASFV 抗體的蛋白，郝麗影等[13]分別用ASFV 重組蛋白p30、p72、pA104R 作為包被原建立間接ELISA 方法，3 種方法分別檢測梯度稀釋的ASFV 陽性血清、ASFV（CD2v 缺失）陽性血清，其中p72-ELISA 靈敏度最高，其檢測下限分別為1∶64、1∶128，但3 種方法間特異性差異不大。

2.2 疫苗研究現(xiàn)狀

接種疫苗是控制牲畜病毒性疾病的最佳措施之一，目前針對豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬傳染性腹瀉病毒等養(yǎng)殖場常見病毒類型均有疫苗的研發(fā)及臨床應(yīng)用。雖然目前尚未有針對ASFV 的疫苗被研制出來，但各個國家的科研人員一直在探索ASFV 疫苗的研發(fā)。

滅活疫苗主要通過物理、化學(xué)或兩者相結(jié)合的方式使病原體失活。傳統(tǒng)的滅活疫苗無論其采用何種滅活方法和佐劑，都已經(jīng)被證明是無效的。盡管它在誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生方面非常有效，有時能夠阻斷液體中的病毒，但并不能夠誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性CD8+T 細(xì)胞，而T 細(xì)胞對于消除病毒感染的細(xì)胞至關(guān)重要[14]。

減毒活疫苗（LAVs）一般可分為天然減毒菌株和人工基因缺失菌株，后者是通過刪除某些毒力基因制成的。與其他類型的ASF 疫苗相比，LAV 可以提供完全同源和部分異源保護(hù)。Zhang 等[15]通過刪除L11L-L100L基因制備疫苗，這些減毒菌株對同源攻擊提供了18%的保護(hù)。Bao 等[16]構(gòu)建了E184L 缺失菌株以區(qū)分感染動物和接種疫苗的動物，但缺失菌株不能提供完全保護(hù)。由于安全問題，LAV 在大規(guī)模疫苗接種期間可能存在毒力逆轉(zhuǎn)的風(fēng)險。因此，在廣泛推廣之前，應(yīng)進(jìn)行充分的實驗來驗證LAV 的有效性和安全性。同時，LAV 的交叉保護(hù)能力需要進(jìn)一步評估。ASFV 在不同基因型甚至同一基因型的不同菌株的基因組中存在某些序列的突變、重復(fù)和丟失，這可能導(dǎo)致毒力變化。

亞單位疫苗可以增強免疫細(xì)胞對抗原的攝取和處理，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高滴度的抗ASFV 抗體。已經(jīng)證實，一些ASFV 抗原具有一定的保護(hù)作用。p72 和p54 抗體可阻斷ASFV 的吸附，p30 抗體可阻斷病毒內(nèi)化[17]。Goatley 等[18]將B602L、p72、p30、p54、E199L、EP153R、F317L 和MGF505-5R 克隆到腺病毒載體中進(jìn)行初級免疫，并克隆到MVA 載體中進(jìn)行加強免疫，然后在豬中發(fā)現(xiàn)保護(hù)功能高達(dá)100%。然而，在試驗結(jié)束之前，免疫豬體內(nèi)的傳染性病毒水平仍然很低。亞單位疫苗一般處于實驗室研究階段，與實際應(yīng)用還存在較大差距。ASFV 編碼多達(dá)150～200 種蛋白，且大多蛋白功能未知，所以，篩選有效的保護(hù)性抗原有一定的挑戰(zhàn)性。深入鑒定可以誘導(dǎo)強烈免疫應(yīng)答的保護(hù)性抗原以及中和表位，有利于開發(fā)有效的ASFV 亞單位疫苗[19]。

2.3 抗病毒藥物研究現(xiàn)狀

在研制出有效的疫苗之前，使用抗病毒藥物有助于在疫情發(fā)生后早期控制病毒的傳播。部分廣譜抗病毒化合物在細(xì)胞水平顯示了抗ASFV 活性，如：吡唑呋喃菌素、利巴韋林等。某些組蛋白去乙酰化酶抑制劑，如苯丁酸鈉、丙戊酸、曲古抑菌素A 和伏立諾他在體外能顯著抑制ASFV 復(fù)制，其中苯基丁酸鈉能以劑量依賴的方式干擾病毒晚期基因表達(dá)和阻斷病毒感染誘導(dǎo)的乙酰化修飾，并與恩諾沙星具有協(xié)同抗ASFV 的作用。植物次生代謝成分在抗ASFV 上展示了良好前景。如黃酮類的芹菜素、芫花素、楊梅黃酮、楊梅苷；多酚類的白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇、沒食子酸十二酯；多糖類的硫酸多糖、巖藻多糖、戊聚糖多硫酸酯；植物提取物如紫球藻和自養(yǎng)小球藻[20]。

3 生物安全防控措施

3.1 人車物防控

3.1.1 人員防控

人員管理是整個防控體系里最重要的因素，一是要充分發(fā)揮人的主觀能動性，樹立明確的入場隔離、消毒的意識，加強生物安全防控措施的理論和實踐培訓(xùn)，建立監(jiān)督檢查機制；二是要制定嚴(yán)格的進(jìn)場流程，所有人員進(jìn)場前都需經(jīng)過“三級”洗消隔離程序，進(jìn)場人員除攜帶手機、眼鏡及必需藥品外不得攜帶任何其他行李，且必須進(jìn)行紫外線消毒或臭氧熏蒸；三是規(guī)范日常管理，員工每進(jìn)出生產(chǎn)區(qū)時都必須洗頭洗澡，進(jìn)入污區(qū)的人員不能再返回凈區(qū)，同時禁止各豬舍人員串舍。

3.1.2 車輛防控

為避免因車輛流動造成疫病的發(fā)生和蔓延，一是場內(nèi)車輛，豬場內(nèi)部設(shè)立中轉(zhuǎn)車輛，由專人負(fù)責(zé)，每次使用后必須徹底沖洗、消毒，每周1～2 次采樣檢測，車輛行駛固定路線，不越過關(guān)口，非特殊情況禁止駛出場外；二是場外工作車輛，每次使用后進(jìn)行清洗消毒，每周進(jìn)行一次徹底沖洗消毒，包括車外表面及內(nèi)部座椅等，沖洗前采樣檢測，按指定路線行駛，停放在規(guī)定位置。

3.1.3 物資防控

場內(nèi)涉及的物資主要包括生活物資、生產(chǎn)工具、飼料、疫苗及藥品等，為降低風(fēng)險，食材每周集中采購1次，其他物資原則上每月集中采購1 次，所有到豬場的物資必須經(jīng)過采樣檢測為ASFV 陰性后方可進(jìn)場，檢測合格后霧化熏蒸消毒12 h 或高溫70℃消毒1 h 以上。

3.2 衛(wèi)生與消毒

3.2.1 消毒劑的選擇

ASFV 很容易導(dǎo)致環(huán)境污染，包括飼料和飲用水，并導(dǎo)致在周圍豬中傳播，因此應(yīng)合理的選擇消毒劑，各類型消毒劑適用范圍見表1。

表1 非洲豬瘟消毒劑種類及使用范圍

3.2.2 消毒程序

一是空欄消毒，先清掃圈舍內(nèi)外的污物，用高壓水槍沖洗圈舍內(nèi)的頂棚、墻壁、門窗和地面，易可拆卸的用具和設(shè)備盡量拆卸后沖洗和消毒。豬舍干燥后用消毒劑從上到下噴霧消毒，密封門窗后熱風(fēng)炮或熏蒸消毒。二是日常清潔，欄舍內(nèi)糞便和垃圾每日清理，禁止長期堆積。發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)隨時清理，病死豬及時移出，放置和轉(zhuǎn)運過程保持尸體完整，禁止剖檢，及時清潔、消毒病死豬所經(jīng)道路及存放處；三是環(huán)境消毒，重點區(qū)域內(nèi)的道路每月至少消毒1～2 次，每年3～8月份是ASF 及各類疾病的高風(fēng)險時段，每周至少消毒1 次。

3.3 飼料與飲水

飼料和飲水是ASF 傳播的主要途徑之一，在選擇飼料時要棄用高風(fēng)險原料，每批原料采購前進(jìn)行檢測，所有飼料運輸車使用專業(yè)運輸車，按照流程洗消、檢查、檢測，合格后使用，場內(nèi)盡量采用獨立料槽，如已采用通槽，則應(yīng)按照5～10 頭豬/槽進(jìn)行區(qū)隔。

在水源的選擇方面，應(yīng)當(dāng)盡可能選擇自來水或用微生物、理化指標(biāo)符合飲用水標(biāo)準(zhǔn)的深井水。生豬飼養(yǎng)場應(yīng)當(dāng)控制豬場的飲水系統(tǒng)，定期檢測水塔、水線、飲水器等系統(tǒng)中的水源質(zhì)量，有條件的生豬飼養(yǎng)場可選擇安裝水塔、水線的電子警報器，保證飲水充足的同時對水質(zhì)起到監(jiān)測的作用。在飲水消毒的過程中應(yīng)當(dāng)選擇正規(guī)廠家生產(chǎn)、有正規(guī)批號且未過期的消毒劑，消毒劑應(yīng)滿足易溶于水、方便儲存、無毒副作用、無腐蝕性、無刺激性、對畜禽生長發(fā)育無不良影響的。常見的水體消毒劑主要包括氯制劑、復(fù)合消毒劑、酸化劑等[21]。

3.4 驅(qū)蟲

蜱蟲是ASFV 重要的傳播媒介，可寄生在鼠、貓、犬、鳥等動物體表，同時蒼蠅、蟑螂、蚊子等蟲媒生物也可作為傳播媒介，豬場應(yīng)裝好紗窗，防好蚊蟲，可在場內(nèi)角落處投喂蟑螂藥、老鼠藥，并做好標(biāo)識；在飼料庫、豬舍及出風(fēng)口處可懸掛防鳥網(wǎng)，也可安裝超聲波驅(qū)鳥器；定期做好檢查，每日進(jìn)行場內(nèi)巡視，防止外界生物進(jìn)入場內(nèi)。

3.5 病死豬無害化處理

由于ASFV 可在豬只和環(huán)境中存在很長時間，病死豬的無害化處理是生物安全防控措施中的重要一環(huán)，豬場采用高溫及生物無害化處理設(shè)備處理病死豬，為應(yīng)對突發(fā)情況，可配置一定容量的凍庫。無害化處理人員到工作場所穿防護(hù)服或更換無害化處理區(qū)專門的工作服，更換靴子，戴手套和口罩進(jìn)行操作。處理完之后，防護(hù)服、鞋套、手套和口罩等焚燒處理，更換衣服、鞋子，對車輛和人員進(jìn)行消毒，無害化處理區(qū)每周采樣檢測一次。

4 小結(jié)

由于ASFV 結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及其對機體免疫力的高抑制力，目前尚未研究出可適用于該疾病的疫苗，也無對應(yīng)的治療方案。但是，多年來的經(jīng)驗總結(jié)，構(gòu)建完善的生物安全體系，做好防控措施可有效避免ASF 的發(fā)生。各養(yǎng)殖相關(guān)人員應(yīng)自主提高主觀能動性，學(xué)習(xí)、吸納生物安全防控知識，了解ASFV 的研究動態(tài)。做好豬群管理工作，強化豬群健康狀態(tài)；提高敏感度，一旦發(fā)現(xiàn)可疑病例，及時上報處理，避免疫情擴散。